Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Bu çalışmada, lipid membranlarının fiziksel ve elektriksel özelliklerinin ve çevrelerinin damla arayüz çift katmanlı model sistemlerinde iyon iletimini nasıl etkilediğini inceliyoruz. Geleneksel yama kelepçe elektrofizyolojisi daha büyük ölçekli membran biyofiziğini incelemez, ancak bu tek platform, membran biyofiziğini daha kapsamlı incelemek için milimetre ölçeğinde hem tek kanallı aktiviteyi hem de daha büyük membran alanlarını yakalar. Başlangıç olarak, elektrofizyolojik deneyler için klorlu agaroz kaplı gümüş tel elektrotları ve lipid vezikül çözeltilerini hazırlayın.

Damla arayüzü çift katmanlı oluşumu için, ters mikroskopun aşamasına şeffaf bir alt Petri kabı yerleştirin. Kabı yaklaşık beş milimetre derinliğe kadar %100 heksadekan gibi alkan yağı ile doldurun. Elektrotları patch kelepçe baş sahnesine ve topraklama elektrot tutucuya taktıktan sonra, mikromanipülatör kontrolleriyle her iki agaroz kaplı top uclarını yağ yüzeyinin yaklaşık 2,5 milimetre derinliğine indirerek Petri kabıyla çarpışmayı önlemek için hızlı hareketi önleyin.

Mikroskop odakını her iki top uçları ve agaroz kaplamaları keskin odaklı hale getirene kadar ayarlayın. Elektrotları görüş alanının kenarına yakın konumlandırın, böylece her ikisi aynı anda gözlemlenebilir. Kalibre edilmiş iki mikrolitrelik pipet kullanılarak, gramicidin A ile doplanmış ekstrüze edilmiş DPhPC lipid veziküllerini aspire edin. Süspansiyondan 250 nanolitreni, her agaroz kaplı top ucuna yavaşça dağıtın; her biri için ayrı bir pipet ucu kullanarak agarose kabuğuna dokunmadan.

Damlacıkların agaroz yüzeyine yayılmasına ve yerçekimi ile azalmış yüzey gerilimi nedeniyle aşağıya doğru görünür şekilde sarkmasına izin verin, böylece sarma damlası şekli oluşturulur. Petri kabı duvarının yanından sarkma açıksa, gözlemleyin. Beş dakika sonra, anti-titreşim masasını hafifçe iterek damlayı değerlendirin.

Sarkan damlacıkların elektrot hareketine göre hafif bir gecikmeyle hareket ettiğini doğrulayın; bu da tam kaplı lipid monotabakalı damlacıkların oluştuğunu gösterir. Bu davranış gözlemlenmezse, iki-üç dakika daha bekleyip değerlendirmeyi tekrarlayın. Mikroskop, titreşim karşıtı tablo, Faraday kafesi, amplifikatör, dijitalleştirici, fonksiyon üreteci ve bilgisayarın ortak bir toprak bağlantısına bağlı olduğundan emin olun.

Enstrüman bağlantılarını üreticinin kurulum rehberine göre düzenleyin ve temel elektriksel ve optik kurulumu, damla arayüzü çift katmanlı deneyler için ayrıntılı talimatlara uygun olarak yapılandırın. Harici bir fonksiyon üreteci veya satın alma yazılımı çıkış kanalını 10 Hertz, 10 milivolt üçgen gerilim dalgası formu oluşturmak için yapılandırın. Bağlı bir osiloskopta ve satın alma yazılımında genlik ve frekansı doğrulayın.

Damlacıklar yaklaşık 10 dakika sarktıktan sonra, mikromanipülatörleri kullanarak iki damlayı nazikçe temas ettirin. 10-Hertz, 10 milivolt üçgen dalga formunu açın ve satın alma yazılımında kapasitif akım tepkisini izleyin. Damla temas alanını, elektrotları hafifçe hareket ettirerek dalga formuna tepeden tepeye kapasitif akım yanıtı yaklaşık 100 ile 200 pikoamper arasında ayarlayın.

Ya da temas alanı damla çapının yaklaşık dörtte birinden fazla değildir. Elektriksel olarak genişleyen zirveden zirveye kapasitif akım yanıtıyla ve optik olarak artan iç yansıma ile temas bölgesinde oval görünümle gösterilen spontan çift katmanlı oluşumu bekleyin. Saf lipid bikatmanlarının üçgen voltaj uyarısına karşılık dikdörtgen akım platoları gösterdiğini, gramisidin A-doping çift katmanlarının ise grup iyonik iletimi yansıtan eğimli platolar sergilediğini doğrulayın.

Kararlı-kapasitif veya iletken yanıtlar doğrulandıktan sonra, üçgen dalga formunu kapatın ve damla arayüz çift katmanının en az 15 dakika dengelenmesine izin verin, ardından uyarı protokolleri uygulanır. Video yakalama yazılımında, kare hızını en az saniyede 20 kare olarak ayarlayın. Uygun kamera ve objektif lens ayarlarını seçin.

Sonra, Edin'e tıklayın ve Yeni Protokol'ü seçin. Acquisition Mode sekmesinde Epizodik Uyarım seçeneğini seçin. Her deneme için set koşu, her koşuda sweep sayısı bir.

Tarama süresini toplam deneysel süreden dört saniye daha uzun ayarlayın, böylece uyarı öncesi ve sonrası iki saniyelik bir başlangıç süresi sağlanır. Örnekleme hızını beş ila 10 kilohertz arasında ayarlayın. Girişler sekmesinde, kayıt kanalını mevcut girişe atayın.

Ve sonra, Çıkışlar sekmesinde, elektrotları kontrol eden voltaj çıkışına uyarım kanalını atayın. Waveform sekmesini açın. A sütununda, tip olarak Step, birinci seviye ve delta seviyesi sıfır milivolt, ilk süre ise 2.000 milisaniye olarak belirlenerek önceden bir temel çizgi tanımlanır.

B sütununda, eşleştirilmiş darbe kolaylaştırma için Pulse tipini ayarlayın. İlk süre ve birinci seviye voltaj genliği için değerleri belirleyin ve tren hızını, hedef görev döngüsüne karşılık gelen darbe aralığını belirleyecek şekilde ayarlayın. Darbe genişliğini 100 milisaniyeye ayarlayın.

C sütununda, eşleştirilmiş darbe depresyonu için, aynı genlik ve darbe süresiyle tipi Pulse olarak ayarlayın. İstediğiniz daha düşük görev döngüsüne ulaşmak için tren hızını ayarlayın ve darbe genişliğini ayarlayın. Sonra, D sütununda, uyarılma sonrası parametreleri uyarılma öncesi temel çizgiyle aynı şekilde yapılandırın.

Protokolü gözden geçirin ve tanımlayıcı bir isimle kaydedin. Video kaydını başlatın ve hemen her yazılımda Kaydet butonuna tıklayarak elektrik toplama ve uyarıma başlayın. Uyarımanın ilk 60 saniyesinde, akımın arttığını ve bir platoya ulaşabileceğini gözlemleyin.

Son 60 saniyede akımın azaldığını gözlemleyin. Protokolün sonunda, elektrik alımını ve video kaydını aynı anda durdurun. Son olarak, görüntüleme ve elektrik verilerinden membran alanını çıkarmak ve normalize akım, alan ve akını hesaplamak için sonradan işlem yapılmasını gerçekleştirin.

Ardışık görüntüler, iki sarkan damlanın temas ettiğinde çift katmanlı fermuarlaşma ve alan genişlemesini yakaladı. Damla temasındaki parlak iç oval şekilli yansımalar, zaman içinde çift katman çapı ve membran alanını tahmin etmek için kullanıldı. Sıfır saniyeden 60 saniyeye eşleştirilmiş darbe kolaylaştırma ve 60 saniyeden 120 saniyeye eşleştirilmiş nabız depresyonu 100 milisaniyelik darbeler kullanılarak sağlandı.

Adet dönemindeki temsil akım yanıtları ve uyarılma kalıpları kaydedildi. Heksadekan ve dodekan/heksadekan yağlarında gramosdin A-doped DPhPC çift katmanları için normalize akım, eşleşmiş nabız kolaylaştırma ve eşleşmiş nabız depresyonu sırasında gösterilmiştir. 30 zaman noktasında ölçülen normalize edilmiş membran alanı, farklı akımlara rağmen her iki petrol koşullarında da benzer alan evrimini gösterdi.

Normalize akı, alandan bağımsız iletkenlik değişikliklerini ayırdı ve basit alan genleşmesinin ötesinde membran iletimindeki değişikliklerle tutarlıydı. 30 dakikaya kadar uzatılmış eşleştirilmiş nabız depresyon uyarısı, heksadekan membranlarında uzun süreli depresyon benzeri davranışlar yaratırken, dodekan/heksadekan zarlarında uzun vadeli potensiye benzeri davranışa uygun yüksek akışı korur. Bu protokol, damla arayüz çift katmanlarının elektriksel olarak yeniden yapılandırılması yoluyla membran yapısı ve iyon iletkenliğinin nasıl değiştiğini ölçmemize olanak tanır.

Bu platform, iyon kanalları olan, iyon kanalları olmayan, hatta fotoizomerize edilebilir kanallar ile birçok farklı uyarma protokolünü destekleyerek zar dinamiklerini ve elektriksel özellikleri daha iyi araştırabilir. Bu ayarlanabilir platform hem makro hem de mikro ölçekli zar biyofiziğini incelediği için, floresans spektroskopisi kullanılarak protein kanalı aktivitesini membran gözenek iletiminden daha emin şekilde ayırmak için gelecekteki deneyler büyük ölçüde gelişecektir.