Düşük ve Dalgalanan Besin Koşullarında Escherichia coli'nin Incelenmesi için Sürekli Kültür Milifluidik Cihaz

Araştırmam, bakterilerin doğal ortamlara özgü düşük ve değişken besin koşullarına fizyolojik olarak nasıl uyum sağladığını incelemeye odaklanıyor. Geleneksel yetiştirme sistemleri düşük dinamik besin koşullarını kötü bir şekilde çoğaltırken, bizim sistemimiz bu çevresel koşullar altında yetiştirmeyi mümkün kılar. Deneyden bir gün önce gece kültürünü hazırlayın.

Altı mililitre tam zengin tanımlanmış ortam (RDM) içeren bir tüpe gece kültüründen altı mikrolitre ekleyerek pre-kültür hazırlayın. Karışımı eşit olarak iki 15 mililitrelik kültür tüpüne böl ve bunları A ve B olarak etiketleyin. Her iki tüpü 37 derece Celsius'ta, 200 RPM'de çalkalayarak inkübe yapın. Optik yoğunluğu 600 nanometrede B tüpünü kullanarak izleyin ve optik yoğunluk yaklaşık 0,5'e ulaşana kadar devam edin.

İnkubasyon sırasında, Düşük RDM ortamını hazırlayın ve toplam hacmi şişeler arasında farklı zaman noktaları için dağıtın. Sonra her şişeyi üç tüplü kapaklarla kapatın. Üçüncü en geniş silikon tüpü steril hava değişimi için 0,2 mikrometrelik bir havalandırma filtresine bağlayın.

Her peristaltik tüpün bir ucu, erkek Luer kilitli konnektörlerle donatılmış olarak daha küçük çaplı silikon tüplere takılır. Deney başlayana kadar peristaltik tüplerin diğer ucundaki boş erkek Luer kilit parçasında alüminyum folyo kapağı, kontaminasyonu önlemek için bırakın. Şişeleri ve peristaltik pompayı 37 derece Celsius sıcaklığa ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin.

Tüm peristaltik boru aynı pompa başlığının kanallarına sabitleyin, böylece tüm filtrelerde aynı akış oranlarını sağlayın. Ön kültürü bir ile 10 oranında, 5,4 mililitre düşük RDM içeren bir tüpe 600 mikrolitre kültür ekleyerek seyreltin. Bir mililitrelik pipet kullanarak, altı adet 0,45 mikrometrelik poliviniliden florür veya PVDF filtrenin her birine bir mililitre seyreltilmiş kültür ekleyin.

Tek yönlü çek vanalarını otoklavlı ultra saf suyla duruladıktan sonra, filtrelerin her iki ucuna takın. Boru bağlantılarından alüminyum folyo kapaklarını çıkarın. Her filtreyi peristaltik boru bağlantılarına bağlayın.

Peristalttik pompada akış hızını dakikada iki mililitre ayarlayın. Filtrelerin altına bir atık yuvası yerleştirin, çıkışı toplayın ve akışı başlatın. İki saat sonra, bir litrelik şişeye bağlı filtrelerden birini çıkarın, tek yönlü çek vanalarını çıkarın ve filtreyi girişi aşağıya bakacak şekilde 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

Santrifüj 2.000 G'de iki dakika boyunca. Sterilize edilmiş boru kesici kullanarak, plastik kılıfın çıkış ucuna hafifçe basın ve filtreyi açın. İç silindiri serbest bırakın ve zar içeren bölümü atın.

Filtre kılıfının iç duvarlarını toplanan kültür ortamıyla durulayın. Toplanan toplam hacmi beş mililitrelik serolojik pipet ile ölçün. Numuneden üç adet 100 mikrolitrelik alikot alın ve onları glutaraldehit ile %1,5 nihai konsantrasyona sabitleyin. Sonraki zaman noktalarında ilgili filtreleri fişten çıkarın ve toplama işlemini tekrarlayın.

Toplanan örnekleri ilgili zaman noktalarına göre etiketleyin. Örnekleri floresan DNA boyasıyla etiketleyin ve akış sitometrisi kullanarak hücreleri sayın. Zamanla, log 10 dönüştürülmüş hücre sayısı doğrusal yörüngeler izledi ve tüm koşullarda üstel büyümeyi gösterdi.

Büyüme oranları %0,5RDM durumu için yaklaşık saatte 0,88, %0,25 durumu için saatte 0,64 ve %0,01 durumu için saatte 0,18 idi. Hücre sayıları örnek başına bir milyar hücreye kadar ulaştı ve bu, milifluidik sürekli kültür cihazının (MCCD) hem üstel büyümeyi hem de nanomolar ile mikromolar besin konsantrasyonlarında yüksek biyokütle verimini desteklediğini gösterdi. %0,5 RDM'de yetiştirilen hücreler, %0,01 RDM'de yetiştirilen hücrelere göre ortalama hücre uzunluğu daha fazladır.

Düşük besin yetiştiriciliğinde ana zorluk, tıkanmayı, basınç birikmesini ve besin tükenmesini önlemek için yeterli hücre yoğunluğunu korumaktır. Bu prosedürün ardından hücreler, proteomik, metabolomik ve diğer omik yaklaşımlar dahil olmak üzere diğer sonraki analizler için toplanabilir. Gelecekteki çalışmalar, bu protokolü nicel bir omik analizle entegre ederek mikrobiyalin besin sınırlamaları ve dalgalanmalara uyum sağlamasını araştırabilir.