Name: İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Keşfedin: Canlı hücre görüntüleme ile LysoTracker Deep Red kullanarak IMR-90 insan akciğer fibroblastlarında lizozomal yeniden yapılanmayı nicel olarak değerlendirin. Bu yöntem hücresel yaşlanma yükünü ölçmek için pratik bir bağıntı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Canlı hücre floresan görüntüleme ile uyumlu herhangi bir berrak tabanlı çok kuyuluk kültür plakası (örn., 6-, 12- veya 24-kuyuluk TC-tedavi edilmiş polistiren plakalar; daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için cam tabanlı görüntüleme plakaları tercih edilebilir).</td></tr><tr><td>Beta-galaktosidaz boyama kiti (yaşlanma analizi)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>pH 6.0'da doğrulanmış boyama tamponu olan herhangi bir ticari SA-β-galaktosidaz kiti. Referans amaçlı, fiksasyon çözeltisi PBS içinde %2 formaldehit ve %0,2 glutaraldehit içerir ve boyama çözeltisi DMF içinde 1 mg/mL X-gal, 40 mM sitrat/fosfat pH 6.0, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 5 mM potasyum ferrisiyanür, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 içerir.</td></tr><tr><td>BioRender (bilimsel çizim yazılımı)</td><td>BioRender</td><td>N/A &mdash; web uygulaması</td><td>Şematik şekiller oluşturmak için kullanılır (Şekiller 1&ndash;3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Karbon dioksit gazı (CO2), sıkıştırılmış silindir</td><td>Airgas (veya benzer bir tedarikçi)</td><td>N/A</td><td>Hücre kültürü inkübatör ve sahne üstü görüntüleme odasında %5 atmosferi korumak için kullanılan medikal sınıf CO2.</td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş fetal boğaz serumu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>56 °C'de ısı ile inaktive edilmiş herhangi bir hücre kültürü sınıfı FBS; tam kültür ortamında %10 v/v oranında kullanılır.</td></tr><tr><td>Canlı hücre yeteneğine sahip floresan mikroskopu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Canlı hücre sıcaklığı ve CO2 kontrolüne sahip herhangi bir geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu, uzak kırmızı (yaklaşık 647 nm eksitasyon / yaklaşık 670 nm emisyon) ve DAPI/Hoechst (yaklaşık 405 nm eksitasyon / yaklaşık 460 nm emisyon) kanalları için filtre setleri ve lizozomal özellikleri çözmek için yeterli NA'ya sahip 20×-40× bir objektif. Bu çalışmada EVOS M7000 Görüntüleme Sistemi kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 nükleer boyası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Canlı hücre nükleer boyaması için hücreye geçirgen DNA boyası (mavi floresan, yaklaşık 405 nm eksitasyon). DAPI ile değiştirilemez, çünkü fizyolojik koşullar altında hücreye geçirmez.</td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Python Yazılım Vakfı</td><td>N/A</td><td>Çekirdek segmentasyonu, çekirdekten hücreye bölge genişletme, yoğunluk eşiği ve temel görüntü istatistiklerini destekleyen herhangi bir bilimsel hesaplama ortamı (örn., scikit-image ile Python, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). SenTrack işlem hattı (bkz. Ek Dosya S1) bu çalışma için geliştirilmiştir.</td></tr><tr><td>IMR-90 insan akciğer fibroblastları (hücre hattı)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Replikasyon yaşlanmasını modellemekte kullanılan normal insan fetal akciğer diploid fibroblast hücre hattı; benzer şekilde karakterize edilmiş herhangi bir insan fibroblast hattı ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Asidik organellerin canlı hücre boyanması için asidotropik floresan boya; DMSO içinde 1 mM stoklar halinde tedarik edilir. Hazırlanan hücre kültürü ortamında çalışma konsantrasyonu 75nM'dir. Uzak kırmızı emisyon (ek 647 nm / em 668 nm) lipofusin otofloresans ile çakışmayı en aza indirir, ancak bunu ortadan kaldırmaz.</td></tr><tr><td>Minimum Temel Ortam (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>IMR-90 fibroblastları için bazal kültür ortamı; %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiştir. Herhangi bir standart Eagle's Minimum Temel Ortam formülasyonu Earle'in tuzları ve L-glutamin ile ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin çözeltisi (100×)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Tam kültür ortamı için antibiyotik takviyesi; %1 v/v (son konsantrasyon 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin) oranında kullanılır. Herhangi bir standart pen-strep çözeltisi ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Fenol kırmızısız görüntüleme ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>Canlı hücre görüntüleme için kullanılan fon ışığını azaltmak amacıyla kullanılır; 10% FBS ile takviye edilmiş herhangi bir phenol kırmızısız görüntüleme tamponu ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 (1×)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Hücre yıkama ve reaktif seyreltme için izotonik tampon; pH 7.4'de herhangi bir steril 1× PBS ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (yazılım)</td><td>Açık Kaynak (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Lizozomal yaşlanma görüntü analizi için açık kaynaklı tek dosyalık Python / Tkinter uygulaması. Ek Dosya S1 olarak dağıtılmıştır. Zenodo'da arşivlendi, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT lisansı. Kaynak: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack</td></tr><tr><td>Mikroskop

İnsan fibroblastlarında hücresel yaşlanmanın nicel değerlendirmesi İçin lysotracker ile lizozomal profilleme

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

lysosomal-profiling-with-lysotracker-for-quantitative-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, çift yaşlanma belirteçleri ile tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Yaşlanan hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi, bir β-galaktosidaz substratının kullanılmasını içerir. Substrat, yaşlanan hücreler içindeki aktif lizozomal β-galaktosidaz ile parçalanır ve otofloresan lipofusin granülleri ile birlikte yaşlanan kanser hücrelerini işaretleyen bir floresan ürün üretir.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinin Akış Sitometrisine Dayalı Miktar Tayini

Yaşlanması önler veya tümörogenez tartışmalıdır teşvik olsun. Kemoterapik ilaçlar senesce için kanser hücrelerinin neden olabilir bu yana, yaşlılık okuyan yeni tedaviler önermek için gereklidir. Ancak, standart ve geniş kullanılan β-galaktosidaz tahlil büyük sakıncaları sunar. Burada yaşlılık ölçmek için hızlı ve hassas akım sitometri bazlı analiz öneriyoruz.

Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Hücre içi ROS hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında miktarının için hassas bir tahlil açıklayın. Ayrıca bildirildi çeşitli yaş ile ilgili işlev bozuklukları için katkıda yaşlanma ilişkili salgı fenotip, değerlendirmek için protokolleri sağlar.

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Kemoterapi ilaçlarının hücre kültüründe veya murin tümör modellerinde indüklediği yaşlanan kanser hücrelerinin floresan, akım sitometrik nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur. İsteğe bağlı prosedürler arasında ko-immün boyama, büyük parti veya zaman noktası analizini kolaylaştırmak için numune fiksasyonu ve akış sitometrik sıralama ile canlı yaşlanan hücrelerin zenginleştirilmesi yer almaktadır.

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

Bu protokol, insan yağ dokusundan izole edilen stromal damar fraksiyonunda yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin objektif ve tek hücreli tespiti için yansıtılmış ışık konfokal mikroskopisi sunmaktadır. Yöntem, immünositokimya ile uyumludur, nicel değerlendirme için pH kontrollerini içerir ve ayrıca geleneksel SA-β-gal boyamaya daha hassas ve daha az öznel bir alternatif sunar.

Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti

Keşfedin: Canlı hücre görüntüleme ile LysoTracker Deep Red kullanarak IMR-90 insan akciğer fibroblastlarında lizozomal yeniden yapılanmayı nicel olarak değerlendirin. Bu yöntem hücresel yaşlanma yükünü ölçmek için pratik bir bağıntı sağlar.

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Daha fazla video keşfet