Potansiyel Anti-TB Adaylarının Tanımlanması: Memeli Hücrelerinde Sentez, MIC Belirleme ve Sitotoksisite Değerlendirmesi için Adım Adım Rehber

Araştırmamızın odağı, terapötik stratejileri ilerletmeye yönelik yeni anti-tüberküloz ilaç adaylarının geliştirilmesi ve doğrulanmasıdır. Önleyici fenotipik tarama boru hattı, mycobacterium tuberculosis suşlarına karşı yeni ilaçların arayışında kullanılabilir. Başlamak için gerekli reaktifleri toplayın ve verilen oranlarla reaksiyon karışımını hazırlamaya başlayın.

Reaksiyon karışımını 85 derece Celsius'ta 16 saat boyunca karıştırın. Çözücüyü çıkarmak için döner evaporatör kullanın. Kalıntıya yaklaşık 20 mililitre doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.

Bu süspansiyonu, kalıntı katı maddeleri toplamak için 11 mikrometrelik selüloz nitelikli filtre kağıdı ile filtreleyin. Kalıntı katı maddeleri 50 mililitre kloroformda çözür. Klorofom çözeltisini 15 mililitre suyla üç kez durulamak için ayırıcı huni kullanın.

Her seferinde su tabakasını çıkarmak. Organik faza susuz sodyum sülfat ekleyin, kalan suyu çıkarıp kurutun. Çözücü buharlaştırıldıktan sonra, ortaya çıkan yeşil katı yaklaşık 50 derece Celsius'ta 10 mililitre sıcak heksan ile dört kez yıkayın.

Bir miligram Bileşik 6'ya, bir mililitre asetonitril ve metanol karışımı ekleyin ve stok çözeltisi hazırlanır. Stok çözeltiyi mililitrede 0,5 miligrama kadar seyreldin ve analiz öncesi filtreleyin. Örneği HPLC sistemine yükleyin.

Verileri almak ve işlemek için kromatografi veri toplama yazılımı kullanın. Kromatografik yöntemi, beş mikrometre boyutunda parçacık boyutunda 250 x 4,6 milimetre ters faz C18 kolonu kullanacak şekilde ayarlayın. Akış hızını dakikada 1,5 mililitre ayarlayın ve UV algılamasını 254 nanometreye ayarlayın.

Programlanmış mobil faz bileşim değişiklikleriyle sunulan bir gradyanı oluşturun. Yaklaşık 15 ila 20 miligram Bileşik 6'yı nükleer manyetik rezonans veya NMR tüpüne aktarın. Uygun bir DMSOD6 hacminde çözün.

Alım parametreleri sunulduğu gibi ayarlandıktan sonra, standart bir darbe dizisi kullanarak proton NMR spektrumunu alın. Satın alma parametrelerini ayarlayın. Proton ve karbon 13 NMR spektrumunu başlatın ve kimyasal değişimleri milyonda bir bölek olarak raporlayın.

Deneyden elde edilen serbest indüksiyon bozgunu dosyasıyla NMR verilerini görselleştirin ve işleyin. Kromatografi tabanlı 6 Bileşen arıtması için, bir sütunu silika jeliyle doldurun. Ham Compound 6'yı kolona yükleyin.

Bileşiği elyasyonla ve kesirleri toplayın. Fraksiyonları ince tabaka kromatografisi ile izleyin ve saf ürünü içeren fraksiyonları birleştirin. 96 kuyu tabakasının 12. sütununa %10 albümin dekstroz katalaz veya ADC ile takviye edilmiş 100 mikrolitre 7H9 suyu ekleyin.

Sonra %10 ADC ve %5DMSO içeren 7H9 çorbasından 100 mikrolitre 11. sütuna aktarın. Ve ardından ardışık olarak dokuzuncu sütundan bire kadar. 10. sütuna bileşik çözeltinin 200 mikrolitresi ekleyin, her bileşik için bir satır atanır.

Bileşik çözeltiyi 100 mikrolitre, test konsantrasyonunun iki katı ile 96 kuyu plakasının 12. sütununa pipetleyin. 10. sütundan 10. sütundan dokuzuncu sütuna 100 mikrolitre aktarın ve pipetle iyi karıştırarak iki kat tahıl seyreltmesi başlatılır. Seri seyreltme sırasıyla birinci sütuna kadar devam edin.

Mycobacterium tuberculosis'in bakteriyel süspansiyonundan 11. sütundan birinci sütuna sırayla 100 mikrolitre ekleyin ve plakayı kapatın. Plakayı parafilm ile mühürleyin ve yedi gün boyunca 37 derece Celsius'ta kuluçka yapın. Sonra, her bir tabakaya 60 mikrolitre %0,01 resazurin çözeltisi ekleyin ve üzerini kapatın.

Plakayı parafilm ile mühürleyin ve 37 derece Celsius'ta 48 saat kuluçka yapın. Sonra rengin maviden pembeye geçişini kontrol et. Serumsuz DMEM'de mililitre başına 0,5 miligram MTT'lik çalışan bir çözelti hazırlayın.

Vero ve HEPG2 hücrelerini 48 saat boyunca Compound 6 ile işlenmiş hale getirin ve tedavi etkilerini değerlendirmek için inceleyin. Malzemeyi plakalardan aspire edin ve düşük ortam ışık koşullarında her kuyuya 50 mikrolitre MTT çalışma çözeltisi ekleyin. Üç saatlik kuluçkadan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre DMSO ekleyerek Formazan kristalleri düşük ortam ışık koşullarında çözülür.

Plakayı 100 RPM'de yörünge sallayıcısına 15 dakika boyunca yerleştirin ve ışıktan korunur. Kristalin tam çözüldüğünü doğrulamak için kontrol kuyularını inceleyin. Plakayı mikroplaka okuyucuya koy.

Referans dalga boyunu 630 ile 690 nanometre arasında ayarlayın ve soğurmayı 570 nanometre olarak kontrol edin. Serumsuz DMEM'de mililitrede 40 mikrogramlık nötr kırmızı çalışma çözeltisi hazırlayın. Daha sonra hacim olarak %1 buzul asetik asit, %49 etanol ve %50 ultrasaf su içeren nötr kırmızı desorpsiyon çözeltisini hazırlayın.

Vero ve HEPG2 hücreleri üzerindeki Bileşik 6'nın etkisi değerlendirildikten sonra, ortam çıkarılır ve her kuyuya 100 mikrolitre filtrelenmiş nötr kırmızı çalışma çözeltisi eklenir. Plakayı %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta iki saat kuluçka edin. Nötr kırmızı çalışan çözeltiyi çıkardıktan sonra, her birini 150 mikrolitre steril PBS ile bir kez iyice durulayın.

Her kuyuya 150 mikrolitre nötr kırmızı desorpsiyon çözeltisi ekleyin. Plakayı 150 RPM'de yörüngesel bir sallayıcıya 15 dakika boyunca yerleştirerek boyayı çıkarabilirsiniz. Tam boya çıkarımı doğrulamak için kontrol yuvalarını kontrol edin.

Mikroplaka okuyucu ile 540 nanometrede soğurmayı oku. HPLC kromatografisi, Bileşik 6'nın tutma süresinin 14,11 dakika ve saflığının %99 olduğunu gösterdi. Proton NMR spektrumu piperidin kısmı için karakteristik sinyaller gösterdi ve 1,50 ile 3,13 milyon parça arasında değişti. Bir metil singlet 2,38 parça milyonda.

Aromatik sinyaller arasında 6,97 ve 7,17 milyon parça oranlarında çiftler ve 7,63 ila 7,75 milyon parça arasında multiplet bulunur. Karbon 13 NMR spektrumu metil karbon sinyali 23,81 milyonda bir oranda, piperidine bağlı sinyaller ise 24,85 ile 49,70 parça milyonda oran arasında gösterildi. MTT plakası, bileşik konsantrasyonları arasında net bir renk gradyanı gösterdi; bu da sitotoksisitenin şeffaf kuyular ile yüksek bileşik konsantrasyonlarında en yüksek, derin mor kuyularda ise düşük bileşik konsantrasyonlarında en düşük olduğunu gösteriyor.

Nötr kırmızı alım plakası, bileşik konsantrasyonları arasında net bir renk gradyanı gösterdi; bu da sitotoksisitenin translüs kuyularda yüksek bileşik konsantrasyonlarında en yüksek, derin pembe kuyularda ise düşük bileşik konsantrasyonlarında en düşük olduğunu gösterdi. Bu protokol, fenotipik taramaya dayalı tüberküloza karşı ilaç adaylarının geliştirilmesi için bir boru hattını temsil etmektedir. Protokol uygulanırken sentezlenen bileşiklerin düşük çözünürlüğünü dikkate almak ve değerlendirmek önemlidir.

Bu araştırma, gelecekteki biyoyararlanım, makrofaj enfeksiyonu ve in vivo çalışmalar için temel oluşturabilir.