Euglena gracilis'in heterotrofik yetiştiricilik için manyok bazlı substratlara uyarlanması için bir yöntem

Araştırmalarımız, yeni Euglena gracilis yapraklarını manyok atıklarına uyarlamaya ve büyüme, siyanür indirgemesi ve protein açısından zengin biyokütle üretimini incelemeye odaklanmaktadır. Bu protokol, sürdürülebilir manyok işleme, tarımsal atık değerlenmesi, yem üretimi ve düşük maliyetli biyoteknoloji sistemlerinde uygulanabilir. Başlamak için, steril 500 mililitrelik havalandırmalı kapağılı şişeleri substrat tipini garri olarak etiketleyin.

Uygun hedef konsantrasyonunu mataşa üzerinde işaretleyin. Matonun kopyalanmış tanımlaması ve planlanan sterilizasyon koşullarıyla otoklavlı veya otoklavsız olarak etiketlen. Analitik tartıya bir tartı yerleştirin.

Tare'ye bastıktan sonra, garriyi nihai çalışma hacmine uyduracak şekilde tartın. Tartılan garri'yi, 300 mililitre deionize veya damıtılmış su içeren steril 500 mililitrelik bir şişeye aseptik olarak ekleyin. Havalandırmalı kapağı her şişeye tekrar uygulayın.

Her süspansiyonu üç dakika karıştırın, karışım homojenleşene kadar. Manyetik karıştırma kullanılıyorsa, matayı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve hızını 200G'ye ayarlayın; böylece sıçrama olmadan sığ bir girdap oluşturulur. Süspansiyonun 25 derece Celsius'ta 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden hidratlanmasına izin verin.

Fermantasyondan hemen önce havalandırma kapağını sıkın ve mazarayı elle beş kez çevirerek karışımı nazikçe homojenleştirip yerleşmiş malzemeyi yeniden askıya alın. Ek manyok ürün ortamı hazırlamak için, şişeleri etiketleyip alt tabakayı daha önce gösterildiği gibi tartarak çalışma hacmine göre litrede 30 gram elde edilir. Tartılan substratı aseptik olarak 300 mililitre deiyonize veya damıtılmış su içeren steril bir şişeye ekleyin.

Havalandırmalı kapağı her şişeye tekrar uygulayın. Daha önce gösterildiği gibi süspansiyonu hidratlayıp karıştırın. Gaz değişimine izin veren ve çevresel kirliliği en aza indiren steril gaz geçirimli bir kapağın takıldığından emin olun.

Termoseleri doğrudan güneş ışığından ve yoğun trafik hava akışından uzak belirlenmiş bir alana 25 derece Celsius sıcaklıkta dik konuma getirin ve şişeleri en az 72 saat boyunca çalkalanmadan kuluçka edin. Her şişe ve durum için fermantasyonun başlama tarihini ve saatini kaydedin. Her 500 mililitrelik şişenin sterilasyon sırasında kaynamayı önlemek için fermantasyon sonrası 300 mililitreden fazla sıvı içermediğinden emin olun.

Havalandırmalı kapak parmak sıkı bir konuma gevşedildikten sonra, termosa otoklav gösterge bandı uygulanır. Termosları otoklav güvenli bir tepsiye doldurduktan sonra, tepsiyi otoklavın içine yerleştirin ve P13 sıvı döngüsünü seçin. Sıvı sterilizasyon için sterilizasyon parametrelerini 30 dakika boyunca 121 derece Celsius olarak ayarlayın.

Otoklav döngüsünü başlatın. Döngü tamamlandıktan sonra, otoklav odası basıncının atmosfer basıncına dönmesine izin verin ve otoklav kapısını yavaşça açın. Isıya dayanıklı eldivenler kullanarak matonları çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasına izin verin.

Soğutulmuş matonları aşılamadan önce gece boyunca oda sıcaklığında saklayın. Fermente manyok ortamını, otoklavlama yapmadan doğrudan kullanarak yerli mikrobiyal toplulukları koruyun. İstenmeyen çevresel kirliliği en aza indirmek için 72 saatlik fermantasyon döneminden hemen sonra otoklavlanmamış ortamı aşılayın.

Tüm substrat koşulları için aynı tip 500 mililitrelik havalandırmalı kapsul şişeler, aynı çalışma hacmi ve aynı fermantasyon süresi kullanılarak replikalar arasında tutarlı kullanım sağlamak. Euglena gracilis'i taze heterotrofik besin ortamına aşılayın. Kültürleri tam karanlıkta, 28 derece Celsius'ta kuluçka, 120G'de sürekli yörüngesel sallanma ile orta logaritmik büyümeye ulaşana kadar kullanın.

Parlak alan modunda bileşik ışık mikroskobu kullanarak, kültürleri 100 kat ila 400 kat toplam büyütme ile inceleyin ve aktif hareketliliği, uzun hücre morfolojisini ve düşük ısrar seviyelerini doğrulayın. Aşırı hücresel döküntü, anormal morfoloji veya yüksek ısrar gösteren kültürleri adaptasyon deneylerinden önce hariç tutun. Başlangıç kültürlerini havalandırma kapağını sıkılaştırarak nazikçe homojenleştirdikten sonra, şişeleri elle 15 saniye boyunca çevirerek hücre dağılımı tamamen stres yaratmadan eşit şekilde dağılabilirsiniz.

Neubauer hemositometresi kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. Kültür 15 saniye boyunca çarpıtarak karıştırıldıktan sonra, bir mililitre kültürü steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Hemositometreyi ve kapak kaçığını %70 etanol ile temizleyin ve hemositometre ile kapağın hava ile kurumasına izin verin.

Hemositometredeki iki ızgaraya 10 mikrolitre kültür pipetleyin ve kapak parçasını ıslak numuneye yerleştirin. 10x hedefli parlak alan mikroskopisi kullanarak, ızgaraya odaklanın ve standart sınır kurallarını uygulayarak büyük ızgaradaki tanımlanmış bir kareler seti içindeki hücreleri sayın. İkinci odadaki hücre sayımlarını tekrarlayın ve mililitre başına ortalama hücreler ile hücre yoğunluğunu hesaplayın.

Aşılama hacimlerini, tüm deneysel ortamlarda hacim hacmi %5 nihai aşı elde etmek için ayarlayın. Her tedavi durumu için ayrı inokula hazırlayarak deneysel gruplar arasında tutarlı başlangıç hücre yoğunluklarını koruyun. Hazırlanmış E.gracilis aşısını, litrede 10, 20 ve 30 gram nihai garri konsantrasyonlarında hazırlanan otoklavlı ve otoklavlanmamış manyok ortamına ekleyin.

Tüm tedavi koşullarında eşit aşılama hacimleri kullanılarak başlangıç hücre yoğunluğu standartlaştırılır. Havalandırmalı kapağı sıktıktan sonra, maşeyi 15 saniye boyunca dairesel hareketlerle nazikçe çevirerek hücreleri dağıtın. Kültürleri tam karanlıkta, 25 derece Celsius'ta kuluçkada kuluçka altına alın ve heterotrofik büyüme başlatın.

Yerel mikrobiyal topluluk yapısını ve substrat tabakasını korumak için otoklav olmayan ortamın hareketlenmesini en aza indirin. Tüm kültürleri günde bir kez, nazikçe manuel dönerek 15 saniye boyunca karıştırarak E. gracilis hücreleri ile askıda bulunan manyok materyali arasında temas kalın. Her 48 saatte bir, steril pipet ucu kullanarak, her kültürden aseptik olarak bir mililitre örnek alın.

Havalandırmalı kapağı sıkın ve kültür şişesini örneklemeden önce 15 saniye boyunca nazikçe döndürün, böylece hücreler ve askıda kalan materyal eşit dağılımı sağlanır. Bir aliquot kültür kutusunu steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktardıktan sonra, örnek gerekirse deiyonize suyla seyreltilerek bireysel hücrelerin görselleştirilmesini iyileştirir. Su parçalı mikroskopi slaytı 10 mikrolitre seyreltilmiş numuneyi temiz bir mikroskop slaytına pipetleyip numuneyi bir kapak klaytıyla kaplayarak hazırlayın.

Parlak alan modunda bileşik ışık mikroskobu kullanılarak, örnekleri 100x ila 400x toplam büyütmede inceleyip hücre hareketliliği, morfolojisi ve ısrar sıklığını adaptasyon durumu göstergesi olarak değerlendirin. Her yedi günde bir, her kültürün hacim hacmi %20'sini aseptik olarak aynı garri konsantrasyonu ve sterilizasyon koşullarıyla taze hazırlanmış manyok ortamına aktarın. Geçişler arasında tutarlı transfer hacimlerini koruyun ve kültürler 30 gram/litre manyok ortamında tutarlı büyüme, sürekli hareketlilik ve düşük ısrar sıklığı gösterene kadar seri geçişi tekrarlayın.

Yüksek konsantrasyonlu manyok adaptasyonu ve karşılaştırmalı büyüme analizinden sonra, siyanür seviyelerini değerlendirmek ve gelişen rengi gözlemlemek için kolorimetrik şeritler kullanın. Santrifüjlemeden sonra, aşağı akış analizi için biyokütle toplanır. Tamamen karanlık yetiştirme koşullarında, litre başına 30 gram garri ile yetiştirilen kültürler, düşük konsantrasyonlara göre daha yüksek entegre büyüme göstermiştir.

Litrede 10 ila 20 gram arasında düşük garri konsantrasyonları tespit edilebilir ancak azalmış ve daha değişken büyüme gösterdi. Litrede 40 ila 50 gram arasında daha yüksek konsantrasyonlar, yüksek zirve hücre yoğunluklarına ulaştı ancak gecikmeli stabilizasyon ve daha büyük değişkenlik gösterdi. Trypan mavisi dışlama testleri, 30 gram/litre garri olarak tutulan kültürlerin, örneklenmiş zaman aralıklarında yüksek canlılık koruduğunu göstermiştir.

Daha yüksek garri konsantrasyonları, geçici olarak canlılık azalması ve ardından kısmi iyileşme ve zamanla artan değişkenlik gösterdi. Olumlu sonuçlar arasında, tekrarlanan alt kültür sırasında sabit kalan yuvarlak veya yarı ısrarlı hücreler arasında hareketliliği azaldı. Uyarlanmış E. gracilis kültürleri, birden fazla substrat tipinde tekrarlanabilir büyüme göstermiş ve vahşi tip kültürlere göre daha erken stabilizasyon ile geç evre azalma göstermiştir.

Protokolün başarılı uygulanması, yanma Dumas yöntemiyle harici laboratuvar analiziyle ölçülebilir ham protein içeriğine sahip E.gracilis biyokütlesi elde etti. Uyarlanmış kültürlerde gözlemlenen protein yüzdeleri, artan biyokütle birikimiyle eşleşen daha yüksek toplam protein üretimine karşılık gelen vahşi tip kültürlerde ölçülenlerle karşılaştırılabilirdi. Bu protokol, araştırmacıların farklı manyok bazlı ortamlarda Euglena büyümesi, siyanür indirgemesi, biyokütle üretimi ve besin potansiyelini incelemelerine olanak tanır.

Bu protokolteki kritik zorluk, Euglena büyümesi için istikrarlı bir sıcaklık, tutarlı kültür koşulları ve dengeli bir mikrobiyal topluluğun korunmasıdır. Gelecekteki çalışmalar bu protokolü optimize edip ölçeklenebilir, protein verimini artırabilir ve çeşitli manyok atık akışları kullanılarak büyük ölçekte farklı endüstriyel uygulamaları test edebilir.