Name: Drosophila lizatlarında hücresiz In vitro mRNA çevirisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin, Drosophila embriyo lizatlarında hücresiz in vitro mRNA çevirisi yöntemiyle protein sentezi ve çeviri kontrol mekanizmalarını nasıl çalışılır. Bu protokol temel araştırma ve biyoteknoloji uygulamaları için sağlam sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.</li>
	<li>Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.</li>
	<li>Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.</li>
	<li>Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5&#8242;-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.</li>
	<li>Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.</li>
	<li>Zapata JM, Mart&#237;nez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.</li>
	<li>Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.</li>
	<li>Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.</li>
	<li>Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.</li>
	<li>Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5&#8242; and 3&#8242; UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.</li>
	<li>Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.</li>
	<li>V&#225;zquez-Pianzola P, Hern&#225;ndez G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.</li>
	<li>Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.</li>
	<li>Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.</li>
	<li>Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.</li>
	<li>Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.</li>
	<li>Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.</li>
	<li>Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.</li>
	<li>Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.</li>
	<li>Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.</li>
	<li>Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.</li>
	<li>Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.</li>
	<li>Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.</li>
	<li>Kr&#252;ger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.</li>
	<li>Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.</li>
	<li>Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.</li>
	<li>Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.</li>
	<li>Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.</li>
	<li>Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user&#8217;s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.</li>
	<li>Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aluminum foil sheet</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Standart ev tipi alüminyum folyo; herhangi bir eşdeğer ticari marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Amino acids mixture</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Apple cider vinegar</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Ticari elma sirkesi (%5 asitlik); herhangi bir eşdeğer marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Apple or grape fruit juice</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Ticari üzüm suyu; veya herhangi bir eşdeğer ticari marka.</td></tr><tr><td>Bacteriological agar&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Boric acid (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, Moleküler Biyoloji sınıfı, &ge;99.5%, toz; TBE tamponunun hazırlanmasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNA cap structure</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: Non-functional cap analogue G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube (15 mL)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphokinase from rabbit muscle</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphoric acid, disodium salt</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dehydrated baker&acute;s yeast</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Ticari aktif kuru maya; herhangi bir eşdeğer marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; Drosophila melanogaster mutant suşları, ayrıca diğer Drosophila türlerinin (virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, vb.) vahşi tip referans suşları da bu Stok Merkezi tarafından sağlanmaktadır.</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS reaktifi, 99.4-100.6%, toz; TBE tamponunun hazırlanmasında kullanılır.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%(titre)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Ticari (~%2,5-3,5 hidrojen peroksit çözeltisi; herhangi bir eşdeğer marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 and AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, also termed KCH3COO</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb broth (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Luciferase assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 and AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS Reaktifi</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Any company</td><td>N/A</td><td>Sıraya özgü.</td></tr><tr><td>Pasive lysis 5X buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 mikrolitre sarı uçlar.</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1ml mavi uçlar.</td></tr><tr><td>Pipet Tips&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0,5-10 mikrolitre şeffaf uçlar.</td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS reaktifi sınıfı, &ge;99.5%, sıvı.</td></tr><tr><td>PYREX&reg; 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep spin plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Rabbit reticulocyte lysate (RRL)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Renilla luciferase (RLuc) assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNA clean up kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (Ancak, moleküler boyut kesme noktasına bağlıdır).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite (bleach)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Ticari ağartıcı (%5-6 NaOCl); benzer konsantrasyona sahip herhangi bir eşdeğer ticari marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stainless steel sieve</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Herhangi bir ticari tedarikçi.</td></tr><tr><td>Taq plus precision DNA polymerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 or R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (Tris base)</td>

drosophila lizatlarında hücresiz in vitro mrna çevirisi

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Drosophila lizatlarında hücresiz In vitro mRNA çevirisi

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

Araştırmamız, böcek gelişiminin çeşitli aşamalarında protein sentezini ve translasyonel açığa çıkışı incelemek için bir drosophila hücre içermeyen translasyon sistemi kullanmaktadır. Bu protokol, uzak metazoalardan elde edilen lizatlar aksine, böcek gelişimine özgü in vivo translasyon olaylarını doğru bir şekilde yeniden canlandırmaktadır. Başlamak için Benchling klonlama yazılımını açın.T7 promotörünün aşağısında beş prime çevrilmeyen bölge, bir ateş böceği lusiferazı veya Fluc raporlayıcı sistron, bir üç prime çevrilmeyen bölge ve bir poliadenilat veya poly(A) kuyruğu içeren konstrüktü yerleştirmek için uygun bir plazmid seçin. Transkripsiyon öncesinde her bir plazmid konstrüktünü lineerize etmek için poly(A) kuyruğunun hemen aşağısındaki KPN1 özgün restriksiyon bölgesini kullanın. In vitro transkripsiyon için şablon olarak kullanmadan önce, dizileme yoluyla elde edilen konstrüktlerin temiz ve belirgin piklerini doğrulayın.Lineerize edilmiş DNA'yı %1'lik agaroz jel elektroforezi ile 100 volt'ta bir saat boyunca ayırın. Lineerize edilmiş DNA'yı jelden ekstrakte edin. Bunu bir mikrotüpe yerleştirin ve DNA saflaştırması için agaroz sindirim tamponu veya ADB ekleyin.Tüpü bir termosha

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Biz burada mRNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması için işlemler ve metabolitlerin...

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Bu makalede, sineklerde RNA hedefleme cas13d enzimini (RfxCas13D) kullanmak için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.

CRISPR/CasRx kullanarak Drosophila Melanogaster'da Her Yerde ve Dokuya Özgü RNA Hedeflemesi

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Öğrenin, Drosophila embriyo lizatlarında hücresiz in vitro mRNA çevirisi yöntemiyle protein sentezi ve çeviri kontrol mekanizmalarını nasıl çalışılır. Bu protokol temel araştırma ve biyoteknoloji uygulamaları için sağlam sonuçlar sunar.

Drosophila lizatlarında hücresiz In vitro mRNA çevirisi

Daha fazla video keşfet