Kaplamalı filtreler ve ön filtrelerin aerosol Phi6 virüsünün enfektifliği ve konsantrasyonu üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi

Ön filtreler ve antiviral kaplamaların hava yoluyla virüs bulaşılığını ve kapalı ortamlarda konsantrasyonlarını azaltmadaki etkisini araştırıyoruz. Mevcut yaklaşımlar gerçekçi hava akışı dinamiklerini gözden kaçırıyor. Protokolümüz aerosol koşullarını yeniden oluşturur ve hem enfektif virüsleri hem de toplam viral yükü ölçür.

Başlangıç olarak, saflaştırılmış phi6 bakteriyofaj stok süspansiyonunu pH 7.2'ye ayarlanmış bir milimolar magnezyum klorür içeren 20 milimolar potasyum fosfat tamponu içinde seyreltirin. Yüzey testlerini yapmak için biyogüvenlik kabininde tüm filtre, ön filtre ve antiviral kaplama malzemelerini birleştirin. Bakır veya bakır ve gümüş aktif bileşenlere dayalı tüm kaplama malzemelerinin antiviral etkinliğini, özellikle A6, B4, VS ve VS B, düz test parçalarında gömülü bakır ve gümüş aktif bileşenlere göre değerlendirin.

Sonra, yüzey canlılık testi yapmak için seyreltilmiş phi6 bakteriofag stok çözeltisi 20 mikrolitre seyreltilmiş test parçalarına pipetleyin. Numuneyi steril bir cam üçgen kullanarak iki x iki santimetre büyüklüğünde bir alana eşit şekilde yayın. Örnekleri 22 derece Celsius sıcaklığında dört zaman noktasına kadar kuluçka edin; bunlar bir dakika, beş dakika, bir saat veya üç saat dahildir.

Her zaman noktasından sonra virüsleri geri kazanmak için yüzeye 180 mikrolitre taze LB suyu ekleyin. Numuneyi toplamak için yüzeyi 10 ila 20 kez tekrar pipetle yıkayın. Kontrol yüzeyi olarak plastik bir Petri kabı kullanın.

Yüzey kaplamalarının antiviral etkinliğini, enfeksîyonel viral parçacıkların sayısını ölçmek için plak testi ve viral genom kopya sayılarını belirlemek için nicel ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile niceliklerini ölçmek. Daha önce gösterildiği gibi saflaştırılmış ve konsantre phi6 bakteriyofaj süspansiyonunu seyreltirerek 2,5 kat 10 ile 10 kuvveti arasında viral konsantrasyon elde edilir; mililitrede 4,08 çarpı 10 ile 11 plak oluşturan birim gücünde bir viral konsantrasyon elde edilir. Sonra, deneysel aerosol odasını uyumlu bir kapaklı silindirik cam gövde kullanarak monte edin.

İç metal iskeleyi hazneye yerleştirin ve hava geçirmez bir mühür sağlamak için yalıtım contalarını sabitleyin. Bir nebulizatörü hava pompasıyla birlikte kullanarak kararlı ve tekrarlanabilir viral aerosol girişi üretin. Her deneyden önce ve sonra nebülizörde kullanılan virüs çözeltisini stabiliteyi izlemek için titreleyin.

Aerosol akış hızını odada dakikada sekiz litre ayarlayın. Uzun ölçümler sırasında nem azaltmak için, aerosol akışının yaklaşık dörtte üçünü yüksek verimli partikül hava (HEPA) filtresi aracılığıyla egzoza yönlendirin. Dakikada iki litre karşılık gelen akışın kalan dörtte birinin odaya girmesine izin verin.

Aerosol akışını filtre veya ön filtre yüzeyine doğru yönlendirmek için bir huni kullanın. HEPA filtresini ve akış ölçerini aşırı nemden korumak için giden hava akışını bir kurutucu kullanarak nemini azaltın. Harici pompayı kullanarak sistem içinde negatif basınç oluşturun ve çıkış portundan verimli egzoz sağlanması için hava akışını daha da destekleyebilirsiniz.

Aerosol odası içindeki çift katmanlı cam lifli malzemelerle birlikte kaplamasız veya VS B kaplamalı polyester ve bulpren ön filtrelerinin antiviral özelliklerini değerlendirin. Impaction örnekleme ile antiviral etkiyi değerlendirmek için, pH 7.2 seviyesinde 20 milimolar HEPES tamponu içeren bir Petri kabını test ön filtresinin hemen altına yerleştirerek parçacık birikimini maksimize etmek için konumlandırın. Alternatif olarak, GF2 filtrelerinin antiviral etkisini test etmek için, aerosol toplama için harici pompaya bağlı üçlü nozullu tam camlı bir dönme impinger kurun.

Test ön filtresi veya filtre üzerinden hava akışını dakikada iki litre sürdürün. Odadan çıkan ek bir valf kullanarak toplam hava girişini dakikada 10 litreye çıkarın. Aerosolleri beş mililitre 20 milimolar HEPES tamponunda yakalayın.

Ve buharlaştırılmış tamponu her 30 dakikada bir yenileyin. Üçlü örnekleme için, her deneyden önce ve sonra 15 dakika boyunca ön filtre veya filtre olmadan kontrol çalışmaları yapılabilir. Deney öncesi kontrol çalışmasından sonra, filtreyi veya ön filtreyi odaya yerleştirin ve sistemi üç saat boyunca çalıştırın.

Her 30 dakikada bir 20 mililitre tampon içeren Petri kaplarından bir mililitre süspansiyon geri kazanarak viral aerosolleri toplayın. Filtreyi çıkarın ve deney sonrası kontrol çalışması yapın. Deney sırasında her 30 dakikada bir örnek toplayarak her deney başına sekiz qRT-PCR ve titrasyon örneği alın.

İmpinger deneylerinde, üç saatlik çalışmanın sonunda sadece bir kez titrasyon örnekleri alın. Toplanan örnekten 800 mikrolitresi qRT-PCR analizi için, kalan 200 mikrolitresi ise virüs titrasyonu için kullanılır. QRT-PCR örneklerini sıvı azotta anlık dondurun ve 80 derece Celsius sıcaklığında saklayın.

Virüs titrasyon örneklerini plak testi ile hemen işleyin. Yüzey canlılık testleri, test edilen tüm kaplamaların virüsü başarıyla inaktif ettiğini ve ilk beş dakika içinde önemli azalmalar gözlemlediğini gösterdi. Bakır bazlı yüzey kaplaması B4, en hızlı azalmayı sağladı; bulaşıcı sayıları beş dakika içinde üç mertebe azalttı ve 15 dakika içinde mililitrede 100 plak oluşturma biriminin altında tespit sınırı ile tam inaktivasyona ulaştı.

A6 kaplama 25 dakika içinde tam virüsü inaktive etti, VS B ise 60 dakika içinde gerçekleşti. VS kaplama, test edilen malzemeler arasında en yavaş inaktivasyon oranını gösterdi. İncelenen ön filtreler BP6, S11 ve FMR5, filtresiz kontrole kıyasla enfeksîyon virüs sayısını 1,5 ila 2 merteme kadar azaltarak enfeksiyon virüs sayısını azalttı.

GF2 filtreleri üstün performans göstererek viral yükü en az altı merteme azalttı ve tespit sınırı içinde enfeksiyon phi6 virüs plaketleri tespit edilmedi. VS B kaplaması, kaplamasız ön filtrelere kıyasla enfeksiyon filtreleme etkinliğini anlamlı şekilde etkilemedi. qRT-PCR sonuçları, ön filtrelerin viral genom kopya sayılarını iki mertebedene kadar düşürdüğünü gösterdi.

GF2 filtresi, filtresiz kontrole kıyasla dört derece büyüklük derecesine kadar azalma gösterdi. Ön filtre ile kontrol arasındaki farklar ilk 30 dakika boyunca önemsiz kalsa da, mekanik filtreleme verimliliği 60 dakikalık zaman noktasından arttı. Ayrıca, VS B kaplamasının uygulanması, filtrasyon ortamından geçen viral genom sayısı üzerinde ölçülebilir bir etkisi olmadı.

Bu protokol, araştırmacıların viral inaktivasyon, filtrasyon verimliliği ve enfeksîyonel partiküller ile toplam viral yük arasındaki farkları nicelikle ölçebilmesini sağlar. Önemli bir zorluk, hava akışı sırasında virüs yüzeyi temas süresinin çok kısa olmasıdır; bu da antiviral kaplamaların etkinliğini sınırlar. Gelecekteki çalışmalar, kaplamaları UV ile birleştirmeyi veya gerçek dünya havalandırma sistemlerinde ve çeşitli virüslerde performans testini araştırabilir.