Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

C.elegans'ta germline proteinlerin lokalizasyonunu ve dinamikini incelemek için CRISPR tabanlı endojen etiketleme kullanıyoruz. Geleneksel transgenler germ hattının ifadesini etkileyebilir, ancak bu protokol proteinleri doğal kontrol altındaki endogen lokustaki etiketler. Başlangıç olarak, gonad veya germ hücrelerinde baskın ekspresyona sahip aday genleri kamu veri tabanları ve yayımlanmış literatür kullanarak tanımlayın.

Hedef protein için UniProt girişini açtıktan sonra, yapısal özellikleri ve protein alanlarını değerlendirmek ve uygun floresan etiketleme noktasını belirlemek için Yapı tuşuna tıklayın. Aşağıya kaydırın ve model güven değerlerini doğrulamak için AlphaFold DB girişini açın. Belirli yapısal sınıflandırmalar için Domains sayfasına tıklayın.

Sonra, WormBase'te hedef gen sayfasını açın. Aşağıya kaydırın, Sequences widget'ına ve ana transkript bağlantısına tıklayarak transkripsiyon sayfasını açın. Dizileri bölümüne kaydırın ve seçilen transkriptin eklemli dizisini göstermek için özel seçeneğe tıklayın.

IDT CRISPA-Cas9 Rehber RNA Tasarım Aracı web sayfasında, hedef genin ilk ekzon dizisini WormBase sayfasından kopyalayıp yapıştırın ve rehber RNA veya gRNA tasarımı için Tür açılır menüsünden C, elegans seçin. En çok önerilen gRNA dizisini ve ona karşılık gelen PAM dizisini almak ve incelemek için DESIGN butonuna tıklayın. SnapGene'de, CeU6 promotoru ile gRNA iskelet bölgeleri arasındaki klonlama noktasını belirlemek için Sequence seçeneğini seçin.

IDT araç sayfasından gRNA dizisini kopyalayın, ekleme diyalog kutusuna yapıştırın ve aralığı CRISPR ifade plazmidine entegre etmek için Ekle'ye tıklayın. gRNA yerleştirme doğruluğunu doğrulamak için diziyi seçin ve Sanger dizileme sonuç tabanını bazla beklenen dizilikle karşılaştırmak için Hizalamaları Göster seçeneğine tıklayın. Donör plazmini oluşturmak için, homoloji kolunun genomik dizilerini WormBase'ten kopyalayın.

SnapGene'de diziyi yapıştırın ve Ekle'e tıklayın. Sonra, yerleştirme yerine sağ tıklayarak Set DNA Color penceresini açın ve birleşimi işaretlemek için Turuncu olarak değiştirin. Yeşil floresan protein veya GFP insert dizisini kopyalayıp doğrudan işaretlenmiş konuma yapıştırın.

Sonra Özellik Ekle'ye tıklayın. Özelliği GFP olarak adlandırın. Ekran rengini yeşile çevirin ve in silico donör plazmid montajını tamamlamak için OK tuşuna tıklayın.

Entegrasyondan sonra Cas9'un yeniden kesilmesini önlemek için donör plazmid şablonuna sessiz bir ikame eklemek için, 19-nükleotid gRNA aralığını ekspres vektöründen kopyalayın. Donör plazmid sekmesinde, diziyi Bul DNA dizisi arama çubuğuna yapıştırarak hedef noktayı bulabilir ve mutasyon yapılacak spesifik nukleotit konumunu seçebilirsiniz. Base Değiştir bölümünde yeni nükleotid girin ve Insert'e tıklayın.

Değiştirilmiş tabana sağ tıklayın ve Set DNA Color ile rengini kırmızıya değiştirin. Donör plazmid Sanger dizileme sonuçlarını beklenen dizilikle hizalanarak bütünlüğü doğrulayın. Enjeksiyon karışımını, CRISPR ekspresyon plazmidi, donör plazmid ve eş enjeksiyon belirteçlerini steril çift distile suda birleştirerek gösterilen konsantrasyonda 10 mikrolitre nihai hacme elde ederek hazırlayın.

Sonra karışımı 10.000 g boyunca 10 ila 20 dakika boyunca santrifüjle ederek partikül maddeleri pellet olarak çıkarır ve mikroenjeksiyon kapillerinin tıkanmasını önler. Uzun konik ve gonadal enjeksiyon için uygun keskin uçlu cam kapillyarlardan mikroenjeksiyon iğneleri oluşturmak için iğne çekicisi kullanın; kutup ayarları ampirik olarak optimize edilebilir. Bir mikrokapiller pipeti ısıtıp ikiye bölerek bir yükleme aracı oluşturun.

Kısaltılmış mikrokapiler pipetin geniş ucuna bir kauçuk aspiratör ampulünü takın. Yaklaşık bir mikrolitre enjeksiyon karışımını yükleyiciye aspire edin. Yükleyiciyi enjeksiyon iğnesinin arka ucuna yerleştirin ve enjeksiyon karışımını nazikçe dağıtın.

Yüklü iğneyi yatay olarak 10 dakika boyunca yerleştirerek sürekli bir sütun oluşturun ve çözeltinin uca doğru çökmesini sağlayın. İğneyi enjeksiyon mikroskobuna monte edin ve ucu parlak alan optikleriyle netleştirin. İğne ucunu, halokarbon yağı ile kapak kenarına hafifçe temas ederek açın ve akışı kontrol edin.

Solucanları enjeksiyon için kültürlemek için, N2 vahşi tip solucanları OP50 bakteri tohumlu ortam plakalarında bulundurun. Sağlıklı bir plakadan L4 aşamasında hermafroditleri seçip 20 derece Celsius'ta 10 saat kuluçka yapın; böylece iyi gelişmiş germ hatlarına sahip genç yetişkinler elde edilir. Solucanları tohumlanmamış bir plakaya aktararak bakteri yayılmasını azaltın.

Cam slayt üzerinde kuru 2% agaroz pedi hazırlayın. Ve bir damla halokarbon yağı uygulayın. Kirpik tırma makinesi kullanarak bir solucanı agarose pedine aktarın ve hareketsizleştirin.

Enjeksiyon için gonadı yönlendirmek için düşük büyütmeli bir objektif kullanın. Mikromanipülatör kontrollerini kullanarak iğneyi solucana göre 20 ila 40 derece açıyla konumlandırın. Distal germline odaklanmak için yüksek büyütme kullanın.

Solucanı iğneye doğru ilerletin ve ucunu gonadal sinsityumun içine yerleştirin. Çözeltiyi gonat şişene kadar enjekte edin. İğneyi çekip sonraki enjeksiyonlar için yeniden konumlandırın.

M9 tamponu ekleyin, agarose pedini yumuşatıp kısmen parçalayarak solucanları serbest bırakın. Her solucanı ayrı bir kurtarma plakasına aktarın. Sonra 20 ila 25 solucan için enjeksiyonları tekrarlayın.

F1 yavrularını ko-enjeksiyon belirteçleri için taramak ve marker-pozitif hayvanları seçmek. Her F1 solucanını ayrı bir tabakaya aktarın ve yumurta bırakma için bir ila iki gün bekleyin. Her F1 solucanını proteinaz K tamponunda lizleyerek PCR şablonları hazırlanır.

Homoloji kolunun dışında bir genomik primer ve bir dahili etiket primer kullanarak birleşim PCR yapın. Ve PCR-pozitif F1 hayvanlardan gelen ilgili plakaları koruyun. PCR-pozitif F1 çizgilerinden F2 koyunları bireysel plakalara izole ederek nesil üretin.

Genotipleme için yetişkinleri lizleyin. Homoloji kollarının yanındaki primerlerle ürün boyutuna göre vahşi tip ve knock-in allelleri ayırt etmek için PCR yapın. SnapGene aracını kullanarak hem sol hem de sağ yerleştirme birleşimlerinde doğru entegrasyonu doğrulamak ve doğrulamak için Sanger dizileme sonuçlarını beklenen düzenlenmiş genomik dizilerle hizalayın.

Germline ifadesini ve lokalizasyonunu doğrulamak için floresans mikroskopisi kullanın. Doğrulanmış homozigot çizgileri genişletin. Stokları koruyun ve uzun vadeli depolama için kriyokonserve doğrulu hatlar kullanın.

F1 yavrularının PCR tabanlı taraması, bir yan genom ve bir dahili GFP primer kullanılarak 1.550 baz çifti birleşim PCR amplikonuyla başarılı knock-inler tespit edildi. Çoğu F1 hayvanında 1.550 baz çifti bandının yokluğu, tespit edilebilir bir hedef entegrasyonu olmadığını gösteriyor; bu, homoloji yönlendirilmiş onarım yerine bütünleşmemiş DNA iletimi ile uyumlu bir durum olarak görülüyordu. Birleşim PCR-pozitif çizgilerden türetilen F2 neslinde zigotlik belirlemesi, 1.345 baz çifti vahşi tip allel olarak bant boyutuna göre allelleri ve 2.344 baz çiftini knock-in allel olarak ayırır.

Heterozigotlar her iki grubu da gösterir. Homozigot knock-in örneklerinde wild type boyutunda bant yoktur ve entegrasyonu başarısız olan örnekler sadece wild type boyutunda ürünü gösterir. Homozigot GFP knock-in hattının ek doğrulaması, spermatojenik bölgede zenginleştirilmiş sinyalle germ hattı hücrelerinde GFP floresansı gözlemlendiği konfokal mikroskobik görüntüleme kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu protokol, C.elegans germhattındaki protein lokalizasyonu ve dinamiklerinin in vivo analizini mümkün kılar. Protein fonksiyonunu korumak ve yanlış pozitif adayları en aza indirmek için dikkatli etiket tasarımı ve kapsamlı doğrulama gereklidir. Gelecekteki çalışmalar, bu iş akışını protein lokalizasyonunu takip etmek ve germline gelişimi sırasında potansiyel etkileşimleri incelemek için kullanabilir.