Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol
May 8th, 2026
Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.
Araştırmam, süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epigenom düzenleme ve Arabidopsis çekirdeklerinde kromatin organizasyonunun görselleştirilmesine odaklanmaktadır. Mevcut yöntemler STORM görüntülemeye uyarlanmamıştır. Bu protokol, çekirdeklerin saflığını, etiketleme tutarlılığını, örnek montajını ve görüntüleme kararlılığını iyileştirir.
Arabidopsis thaliana ve diğer bitki sistemleri için nükleer organizasyon, kromatin yapısı ve epigenetiği yüksek çözünürlükte incelemek için geçerlidir. Başlamak için, duman kaputunun altına altı kuyuyla bir kültür tabağı buzun üzerine yerleştirin. Hacim hacmi %4, metanol stabilize formaldehit %0,1 Triton X100 ve PBS içeren fiksasyon çözeltisini karıştırın.
Duman kaputu altındaki her kuyuya yaklaşık dört mililitre buz soğukluğu solüsyesi ekleyin. Temiz forseps kullanarak, çimlenmeden sekiz ila 15 gün sonra olan Arabidopsis fidelerini, sağlam yarı güçlü Murashige ve Skoog veya MS ortamından çıkarın. Fideleri hemen fiksasyon çözeltisine batırın ve her kuyu başına yaklaşık 20 fide yerleştirin.
Her örnek için yeterli malzeme elde etmek için üç kuyu kullanın. Plakayı buzla dolu vakum odasına yerleştirin ve kapatın. Hapsalanmış havayı çıkarmak ve fiksasyonun bitki dokularına derin nüfuz etmesini sağlamak için -0.6 bar ile eksi 0.8 bar arasında 15 dakika vakum döngüsü uygulayın.
Sonra, yavaşça vakumu serbest bırakın. Numuneyi karıştırın ve vakumu 15 dakika daha uygulayın. Duman kapağının altından pipetle fiksasyon çözeltisini çıkarın.
Her birini üç kez 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayıp beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Yıkamadan sonra PBS'yi çıkarın. Forseps kullanarak, sabit dokuyu 120 x 120 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve sabit fidelere 50 mikrolitre çekirdek izolasyon tamponu ekleyin.
Bir bıçakla, sabit dokuyu doğra. Aynı bıçağı kullanarak doğranmış mendiliyi Petri kabının bir kenarına kazıyın. 600 mikrolitre çekirdek izolasyon tamponu ekleyin ve bıçağa yapışan dokuları yıkayın.
Doku bululu iki mililitrelik bir Dounce homojenizer tüpüne aktarın ve küçük tokvanla beş ila on kez vurun. Daha sonra daha büyük havanla yumruk ile yumuşak hareket ettirin; genellikle beş ila on darbe gerektirir. Homojenleştirilmiş örneği 30 mikrometrelik bir ağ filtreden 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.
Filtratı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Süspansiyonu 800G'de 10 dakika boyunca santrifüjle yapın; hem ivmelenme hem de yavaşlama için en düşük rampayı kullanarak. Santrifüjden sonra, yeşil doku kalıntıları arasında küçük beyaz bir peletin görüldüğüne dikkat edin.
Süpernatantı atın ve pelleti 600 mikrolitre çekirdek izolasyon tamponunda tekrar askıya alın. 800G ile tekrar 10 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın. Yeşil kalıntıları tamamen yıkandıktan sonra, izole çekirdek süspansiyonunu en fazla bir hafta boyunca dört derece Celsius'ta saklayıp çekirdekleri istenen antikorlarla immün altına alın.
Düşük eriyen 1,5% hacim ağırlığı olan agaroz çözeltisini 90 derece Celsius'ta bir dakika boyunca ısıtarak tozu çözün ve berrak bir çözelti elde edin. Tam karışımı sağlamak için kısa bir girdap kullanın. Çözeltiyi soğutun ve 37 derece Celsius'ta tutun, ardından glikoz oksidaz tamponunun ısı denatürasyonunu önlemek için devam edin.
Düşük eriyen agaroz çözeltisi 37 derece Celsius'a ulaştıktan sonra, düşük eriyen agaroza 100 milimolar merkaptoetilamin ve glukoz oksidaz tamponu ekleyerek 1X son konsantrasyon elde etmek için STORM tamponunu hazırlayın ve çözeltiyi nazikçe karıştırın. Çekirdek karışımından 10 mikrolitre, ultraviyole ozon temizleme sisteminde 20 dakika işlenmiş ozonla işlenmiş 1.5H bir örtü parçasına bırakın. Çekirdeklerin kapak kağızına birikmesini üç dakika bekleyin.
Sonra fazla sıvıyı çıkarıp iki dakika bekleyin. Hazırlanmış düşük eriyen agarozdan 10 mikrolitre kapağıya ekleyin ve hemen mikroskop slaytıyla örtün. Kapak kapak kapağını silikon sızdırmazlık maddesiyle mühürleyin.
Küçük bir Petri kabında eşit miktarda çözelti A ve B çözeltisi mikropipet ucu kullanarak karıştırın. Karışımı kapak kenarlarının üzerine uygulayarak numuneyi mühürleyin. Silikon sızdırmazlık maddesinin beş dakika sertleşmesine izin verin.
Örnek slaytı mikroskopa monte edin ve odak edin. Bir çekirdeği bulup ona odaklanın. Uzun satın almalar sırasında istikrar sağlamak için varsa odak tutma modülünü aktive edin.
Yeniden yapılandırma sırasında sürüklenme düzeltmesini iyileştirmek için çekirdeğin yakınında bir veya birkaç nanoelmas konumlandırıldığı bir bölge seçin. İki renkli görüntüleme için, alımı daha uzun dalga boylu kanalla başlatın ve ardından görüntülemeyi tamamlamak için daha kısa dalga boylu kanala geçin. ThunderSTORM'ta ham görüntü yığınlarını ağırlıklı en küçük kareler tahminiyle Gauss uyumu kullanarak işleyin ve yeniden oluşturulmuş görüntüler oluşturun.
30 nanometrenin altındaki sigma ve belirsizliğe dayalı filtreleme uygulayarak doğru lokalizasyonları koruyun ve gürültüyü ortadan kaldırın. Son olarak, ThunderSTORM çapraz korelasyonu veya COMET algoritması kullanılarak örnek sürüklenme düzeltmesi yapın ve yeniden oluşturulan görüntülerde minimum kaymayı doğrulayın. Çekirdekler, 15 günlük yabani tip fidelerden izole edildi, AF647 konjuge ikincil antikorlarla immünoetiketlendi ve Hoechst H33258 ile karşı boyandı.
Konfokal görüntüleme, kromosentrleri ve nükleolusu açıkça ayırt edilebilen çok sayıda izole ve iyi korunmuş çekirdek gösterdi. RNA polimeraz II sinyali kromosentrlerde ve nükleolus'ta yoktu. Kırınım, maksimum yoğunluk projeksiyonlarını sınırladı ve ilgili SMLM rekonstrüksiyonları, RNA polimeraz II'nin yapısal detaylarını ve DNA etiketlemesinin yapısal detaylarını, daha ince yapılar gösteren büyütülmüş ilgi alanlarını ortaya koydu.
Sigma ve belirsizliğe dayalı lokalizasyon filtreleme, RNA polimeraz II ve DNA sinyallerinin tanımını tespit edilen lokalizasyonlara kıyasla geliştirmiştir. Ve drift düzeltmesinden sonra yapılan daha fazla iyileştirme bu gelişmiş yapıyı korudu. Sigma değerlerine dayalı filtreleme, aşırı küçük veya büyük uydurulan genişliklere sahip yerelleştirmeleri ortadan kaldırdı.
Fourier halka korelasyon analizi, AF647 kanalındaki çözünürlüğün filtreleme sonrası 90.1'den 47.7 nanometreye yükseldiğini, JF549 kanalının ise 56.6'dan 27.9 nanometreye yükseldiğini gösterdi. Nükleer bütünlüğünü korumak, enkaz ve arka plan floresansını en aza indirmek, yüksek kaliteli tek moleküllü görüntüleme elde etmek için kritik öneme sahiptir. Gelecekteki çalışmalar, nükleer mimariyi çevresel veya gelişimsel koşullarda gen düzenlemesiyle ilişkilendirebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
