Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi
23 Haziran 2026
Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.
Araştırmamız, dokuların sinyal alışverişini anlamak için fare kası ve kemik iliğinden küçük ekstrahücre veziküllerini izole etmeye odaklanmaktadır. Bu protokol, fare modellerinde yaşlanma, kas yenilenmesi, egzersiz fizyolojisi ve kemik iliği patofizyolojik çalışmalarıyla ilgili çalışmalara uygulanabilir. Başlamak için, fırın femur ve tibia örneklerini bir biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
1,5 mililitrelik santrifüj tüplerini önceden tartın ve etiketleyin. Sonra, 0,2 mililitrelik bir tüpün altını, tabana dik tutulan steril 16 kalibre iğneyle delin, böylece tek bir eşit açıklık elde edilir. Delikli tüpü önceden tartılmış 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne sıkı bir şekilde yerleştirerek delinmiş tüp kurulumunu hazırlayın.
Bacak kemiklerini steril bir Petri kabına yerleştirin. Eklem boşluğunu keserek uyluk kemiği ve tibia'yı ayırın. Kırmızı iliği ortaya çıkarmak için uyluk kemiği ve tibianın her iki ucunu kesin.
Kemikleri, 1,5 mililitrelik tüpün içinde bulunan delinmiş PCR tüpüne yerleştirin ve montajı parafilm ile mühürleyin. Numuneyi yaklaşık 8.000 g oda sıcaklığında bir tezgah üstü mikrosantrifüjde 10 saniye boyunca santrifüjlendirin. Üst tüpte kalıntı kırmızı iliği olmayan görünür beyaz kemikler ve alt tüpün altındaki koyu kırmızı ve kompakt pelet bulunarak başarılı ilik çekimini doğrulayın.
Daha sonra 1,5 mililitrelik tüpü tekrar tartarak çıkarılan iliğin kütlesini belirleyin ve fare başına yaklaşık 15 ila 30 miligram beklenen aralıkta olduğundan emin olun. Kemik iliği içeren her tüpe 250 mikrolitre RPMI 1640 ekleyin ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin. P1000 pipeti ile 10 ila 15 kez nazikçe pipetle iliği tekrar askıya alın, ta ki kalan küme veya sağlam doku parçası olmadan homojen bir süspansiyon elde edilene kadar.
Numuneyi 300 g'de 10 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlenerek sindirilmemiş kalıntıları, sağlam hücreleri ve kalan doku parçalarını pellet olarak parçalayın. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın, pelleti rahatsız etmeden. Aktarılan süpernatantı 2.000 g ile 15 dakika boyunca santrifüjlenerek büyük kalıntıları temizleyin.
Süpernatantı yeni bir tüpe toplayın ve tekrar 10.000 g sıcaklığında 30 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Sonra son süpernatanttan en az 200 mikrolitre taze bir tüpte toplayın. Boyut dışlama kromatografi kolonunu altı mililitre filtrelenmiş PBS ile yıkayarak dengeleyin; böylece kolon ve PBS oda sıcaklığında korun.
Tüm hacmin yerçekimiyle kolonun içinden geçmesine izin verin. Daha sonra 150 mikrolitre filtrelenmiş süpernatantı kolona yükleyin ve numunenin reçineye tamamen girmesine izin verin. Uç nokta, sıvı meniskusun reçine yatağının yüzeyine ulaştığı ve ıslak reçinenin üzerinde görünür bir sıvı kalmadığında ulaşılır.
Hemen 550 mikrolitre PBS ekleyin, elüsyonu başlatın ve 700 mikrolitre boşluk hacmini toplayın. Boşluk hacmini atabilir veya ekstraselülük vezikül fraksiyonu olarak tutabilir. 700 mikrolitrelik boşluk hacmi kaçtıktan hemen sonra hücre dışı vezikül zenginleştirilmiş fraksiyonu toplamaya başlayın.
850 mikrolitre ekstraselüler vezikül zenginleştirilmiş elyutun toplandığından emin olun. Ekstraselülük vezikülü konsantre etmek için, örneği önceden durulanmış bir santrifüj filtreye yükleyin ve 100 kilodalton moleküler ağırlık kesmesi uygulanır. Numuneyi 4.000 g ve dört derece Celsius'ta santrifüjle yapın, istenen son hacme ulaşana kadar her iki-üç dakikada bir kontrol edilsin.
Sonra nazik pipetleme ile retentatı geri alın. Hücre dışı vezikül zenginleştirilmiş fraksiyonları acil testler için buz üzerinde tutun, örneğin iletim elektron mikroskopisi. Western blot analizi, erken fraksiyonlarda küçük ekstrasellüler vezikülleri veya SEV belirteçlerinin bulunduğunu gösterdi.
Birinci ile beşinci fraksiyonlar, küçük ekstrasellüler veziküllerin sonraki karakterizasyonu için toplanmıştır. Bu fraksiyonlarda kalneksin ve bağlanan immünoglobulin protein sinyallerinin olmaması, hücre içi membranlardan ve endoplazmik retikulum bileşenlerinden kontaminasyonu ekart etmiştir. SEV ile zenginleştirilmiş F1 ile F5 fraksiyonlarının geçirim elektron mikroskobisi, 200 nanometrenin altında net tanımlanmış membran çift katmanlı ve çapları sağlam yuvarlak veziküller ortaya çıkarmıştır.
Toplanan örneklemin nanoparçacık takip analizi, 200 nanometrenin altında merkezlenmiş tek modlu boyut dağılımını ve medyan parçacık çapının 147,8 nanometre olduğunu gösterdi. Parçacık konsantrasyonu, doku kütlesine normalize edilmiş SEV ile zenginleştirilmiş F1'den F5'e kadar fraksiyonlarda en yüksekti; doku dokusunda mililitrede sekiz parçacık sayısına karşı 3,7 kat 10 oranında ve sonraki F6'dan F8'e kadar olan fraksiyonlarda dokuda mililitrede sekiz parçacık gücünde 3,7 kat 10 oranında hafifçe azaldı. Bu protokol, araştırmacıların kas ve kemik iliğinden ekstraselüllü veziküllerin büyüklüğünü, konsantrasyonunu ve moleküler yükünü ölçmelerine olanak tanır.
Gelecekteki araştırmalar, bu protokolü hastalık modellerine genişletebilir ve izole vezikülleri biyobelirteçler ile terapötik hedefler belirlemek için kullanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, fare iskelet kası (SkM) ve kemik iliği (BM) dokularından küçük hücre dışı veziküllerin (sEV'ler) izole edilmesi için tekrarlanabilir bir iş akışını detaylandırmaktadır. SkM enzimatik sindirime tabi tutulurken, BM doğrudan işlenmekte; ardından EV açısından zenginleştirilmiş fraksiyonlar elde etmek için diferansiyel santrifüj ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) uygulanmaktadır. Bu yöntem, minimum doku girdisiyle yüksek saflıkta sEV izolasyonu sağlayarak alt akıştaki moleküler ve fonksiyonel analizleri desteklemektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre dışı vezikül biyolojisi
- Dokuya özgü vezikül izolasyonu
- Nanopartikül karakterizasyonu
Arka Plan
- sEV'ler; proteinlerin, lipidlerin ve RNA'ların transferi yoluyla hücreler arası iletişimi sağlar.
- SkM ve BM gibi katı dokulardan sEV'lerin izole edilmesi, düşük verim ve kontaminasyon nedeniyle zordur.
- Mevcut yöntemler genellikle yüksek miktarda doku girdisi gerektirir ve tekrarlanabilirlikten yoksundur.
- SEC, EV'leri boyutlarına göre kontaminanlardan ayırmak için etkilidir.
- EV saflığının doğrulanması, birden fazla ortogonal teknik gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Fare iskelet kası (SkM) ve kemik iliğinden (BM) sEV izolasyonu için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Verimi ve saflığı maksimize ederken doku girdi gereksinimlerini minimize etmek.
- Diferansiyel santrifüjasyon ve SEC kullanan standartlaştırılmış bir protokol sağlamak.
- Doku kaynaklı sEV'lerin aşağı akış moleküler ve fonksiyonel analizlarına olanak tanımak.
- Kas-iskelet ve hematopoetik sistemlerdeki hücreler arası iletişim araştırmalarını desteklemek.
Kullanılan Yöntemler
- İskelet kası dokusunun enzimatik sindirimi.
- Kemik iliğinin enzimatik işlem uygulanmadan doğrudan işlenmesi.
- Hücreleri ve döküntüleri uzaklaştırmak için diferansiyel santrifüjleme.
- EV zenginleştirmesi için boyut dışlama kromatografisi (SEC).
- Boşluk hacimlerinin (SkM: ~2.5 mL; BM: 700 µL) atılması ve ardından EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların toplanması.
- Sıralı alikotlar halinde alt fraksiyonlara ayırma (SkM: F1–F4; BM: F1–F5).
- Morfoloji değerlendirmesi için transmisyon elektron mikroskopisi (TEM).
- Boyut ve konsantrasyon belirleme için nanopartikül takip analizi (NTA).
- Kanonik EV belirteçleri (örneğin, tetraspaninler) için Western blotting.
- Tetraspanin ile tanımlanan alt popülasyon miktarının belirlenmesi için tek parçacıklı interferometrik tespit (SPID).
Temel Sonuçlar
- ~500 µL quadriceps ve ~150 µL havuzlanmış femur/tibia BM'den izole edilen sEV'ler.
- Doku başına ~10⁸ particles·mL⁻¹·mg⁻¹ verim.
- Parçacık çapları ağırlıklı olarak <200 nm.
- EV zenginleştirilmiş fraksiyonlar TEM, NTA ve Western blotting ile valide edilmiştir.
- SPID, tetraspanin-pozitif sEV alt popülasyonlarının kantifikasyonunu sağlamıştır.
- Yöntem, downstream omiks ve fonksiyonel analizler için uygun olan yüksek saflıkta sEV'ler sağlar.
Sonuçlar
- Bu protokol, yapısal olarak karmaşık dokulardan tekrarlanabilir ve yüksek saflıkta sEV izolasyonuna olanak tanır.
- Güçlü bir EV verimi için minimum girdi doku hacimleri yeterlidir.
- Diferansiyel santrifüjasyon ve SEC'in birlikte kullanımı kontaminasyonu azaltır.
- Ortogonal doğrulama, vezikül bütünlüğünü ve saflığını teyit eder.
- Bu yaklaşım, sağlık ve hastalık durumlarında dokuya özgü sEV fonksiyonlarının ileri düzey çalışmalarını destekler.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
İskelet kası ve kemik iliği gibi katı dokulardan küçük hücre dışı veziküllerin (sEV'ler) izole edilmesi, düşük verim ve kontaminasyon nedeniyle biyobelirteç keşfi ve mekanistik çalışmalarda bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu protokol, minimum doku girdisiyle tekrarlanabilir, yüksek saflıkta sEV izolasyonuna olanak tanıyarak kas-iskelet ve hematopoetik hastalık modellerinde hedef doğrulamayı ve fenotipik taramayı destekler. Biyolojik gürültüyü azaltan ve vezikül saflığını artıran bu yöntem, sonraki omik ve fonksiyonel analizlerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Proteinlerin, lipidlerin ve RNA'ların sEV aracılı transferi yoluyla dokuya özgü hücreler arası iletişim yolaklarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Diferansiyel santrifügasyon ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak fare iskelet kası ve kemik iliğinden sEV'lerin izole edilmesi için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.
- Bilimsel Değer: TEM, NTA, Western blotting ve tek partikül interferometrik deteksiyonu içeren ortogonal yöntemlerle EV zenginleştirmesini doğrulayarak biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Ağırlıklı olarak <200 nm partikül çaplarına sahip EV-zenginleştirilmiş fraksiyonlar ve ~10⁸ partikül·mL⁻¹·mg⁻¹ doku verimi sağlayarak tarama kampanyaları için tutarlı bir girdi oluşturur.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış boş hacim bertarafı ve ardışık fraksiyonalama (SkM: F1–F4; BM: F1–F5) yoluyla sEV izolasyonunu standartlaştırarak laboratuvarlar arası analiz tekrarlanabilirliğini artırır.
- Bilimsel Değer: Dokudan türetilen veziküllerin proteomik ve RNA profillemesi gibi alt moleküler analizler için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Kas-iskelet ve hematopoetik patofizyoloji için merkezi dokular olan iskelet kası ve kemik iliğinden sEV'lerin izolasyonunu sağlayarak hastalıkla ilgili sistemleri destekler.
- Operasyonel Değer: Minimum girdi malzemesi (~500 µL quadriceps, ~150 µL birleştirilmiş femur/tibia kemik iliği) kullanarak sınırlı preklinik örneklerin ölçeklenebilir şekilde işlenmesine olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Tek parçacıklı interferometrik tespit yoluyla miktarları belirlenebilen tetraspanin tanımlı sEV alt popülasyonlarını izole ederek translasyonel biyobelirteç uyumunu artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan preklinik mekanistik çalışmalara kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, hipotez testi ve yolak aydınlatması için doku kaynaklı sEV'lerin güvenilir şekilde izole edilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: İskelet kası ve kemik iliği mikroortamlarında hücreler arası iletişimi sağlayan sEV'leri izole ederek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Kontaminasyonu azaltılmış, boyuta göre ayrıştırılmış ve analize hazır EV fraksiyonları sağlayarak bileşik veya stimülasyon yanıt değerlendirmelerinin güvenilirliğini artırır.
- Analitikler: Farklı koşullar arasında karşılaştırmalı analizlere olanak sağlamak için partikül konsantrasyonu, boyut dağılımı (<200 nm) ve tetraspanin alt popülasyon verilerini içeren nicel çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerinde fonksiyonel alım ve sinyalizasyon analizleri için uygun, saflaştırılmış sEV'ler sağlayarak keşif aşamasını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kas-iskelet ve hematopoetik araştırma programları genelinde uygulanabilir, standartlaştırılmış ve yeniden kullanılabilir bir izolasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Birden fazla ortogonal teknikle doğrulanmış yüksek saflıkta sEV izolasyonu yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış SEC fraksiyonlama ve boş hacim bertaraf protokolleri aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken keşif aşamasında dokuya özgü vezikül kargosunun güvenilir değerlendirmesine olanak tanıyarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Biomarker ve hedef doğrulama çalışmaları için tutarlı sEV girdileri sağlayarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Doku işleme, enzimatik sindirim (iskelet kası için) ve santrifüj tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Boyut dışlama kromatografisi kolonlarına, nanoparçacık takip analizine ve Western blotting altyapısına erişime bağlıdır.
- EV marker zenginleştirmesine dayalı fraksiyon toplama ve havuzlama kriterlerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Ekstraselüler matriks yoğunluğu ve hücresellik farklılıkları nedeniyle, diğer katı dokulara uygulanırken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlama: Küçük doku girdilerinden elde edilen düşük mutlak verim, omik uygulamaları için hassas alt analiz tespit yöntemlerini zorunlu kılar.
