Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

SPIN4, kemik gelişimini düzenleyen bir histon okuyucudur. SPIN4 mutasyonları aşırı büyümeye neden olur, ancak patojenik rolü belirsizdir. Bu protokol, histon bağlayan proteinlerin bağlanma substratlarını tüm alanlarda incelemek için uyarlanabilir ve uygulanabilir.

Başlamak için, bloklayıcı tamponu beş gram sığır serum albümini (BSA) tartarak hazırlayın ve 100 mililitre BC-150 protein depolama tamponuna çözün. Sonrasında, reaktifleri korumak için peptid dizisinde reaksiyon alanını belirtmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Sonra filtre kağıtlarını 15 santimetre Petri kabına koyup suyla nemlendirin.

Dizileri nemli filtre kağıtlarına yerleştirin ve her dizi alanına dikkatlice 300 mikrolitre bloklama tamponu ekleyin. Petri kabını kaplayın ve oda sıcaklığında bir ila üç saat kuluçka yapın. Bloklama tamponunda bir mikromolar rekombinant FLAG etiketli Spindlin-4 veya FLAG SPIN4 proteini ve 1X FLAG peptid kontrolü hazırlanır.

Reaktifleri ve dizi çanaklarını soğuk odaya aktararak arka planı azaltın ve sinyal-gürültü oranını iyileştirin. Dizilerden fazla bloklama tamponu çıkarın. Her bloka FLAG SPIN4 proteini veya FLAG peptid kontrolünü ekleyin.

Petri kabını soğuk odada gece kuluçka için kapatın. Bir yıkama kutusuna 50 mililitre peptid dizisi yıkama tamponu ekleyin. Protein çözeltisini dizilerden atın ve reaksiyon tarafı yukarı iken yıkama tamponuna aktarın.

Dizileri beş kez yıka. İlk iki yıkamayı bir dakika boyunca yapın, ardından beş dakikalık üç yıkama takip edin. Sonra kalan deterjanları çıkarmak için bloklama tamponu ile durulayın.

Dizileri tekrar Petri kabına yerleştirin. Her bloka 300 mikrolitre anti-FLAG antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın. Antikor çözeltisini at, dizileri yıkama tamponuna aktarın ve daha önce gösterildiği gibi yıkamaları tekrarlayın.

Her bloka 300 mikrolitre HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-fare karşıtı IgG ikincil antikor sosyolu ekleyip oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın. Antikor çözeltisini atın ve diziyi daha önce gösterildiği gibi beş kez yıkayın. Dizileri şeffaf bir tabaka koruyucuya yerleştirin ve bir mililitre geliştirilmiş kemimilüminesans veya ECL alt tabakası ekleyin, böylece eşit kapsama sağlanın.

Sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarın. Dijital görüntüleyici kullanarak parlak alan görüntülerde kemimilüminesans görüntüler yakalayın. Ham veri dosyasını MODified Histone Peptide Array Analysis yazılımına yükledikten sonra, Spot Alignment sekmesinde, her ızgaranın kendi peptid noktasında merkezlendiğini doğrulayın.

Spot İstatistikler'de, tekrarlanan spot korelasyonunu kontrol edin ve hatanın %5'ten az olduğundan emin olun. Çeşitli histon modifikasyonları arasında bağlanmayı değerlendirmek için Reaktivite sekmesini kullanın. Daha sonra hedef peptidin farklı histon modifikasyonları arasında göreceli bağlanma tercihini belirlemek için Özgüllük sekmesini kullanın. 2X boncuk engelleme tamponu hazırlamak için, 10 mililitre BC-150 lizis tamponu ve girdabına bir gram BSA ekleyerek çözünür.

FLAG SPIN4 vahşi tip ve FLAG SPIN4 D82H mutant boncuklarını, ekmolar konsantrasyonlara sahip ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Vahşi tip örneklere, eşit hacimde 100 milimolar 1X FLAG peptid negatif kontrol boncukları ekleyin. Tüm örnekleri uygun miktarda BC-150 lizis tamponu kullanarak uniform hacimlere ayarlayın.

Her tüpte eşit hacimde 2X boncuk engelleme tamponu ekleyin ve son hacmi bir mililitre kadar elde edin. Dört derece Celsius ve 20 RPM'ye ayarlanmış bir tüp rotatöründe gece boyunca kuluçka yapın. Nükleozom bağlanmasını başlatmak için, buz üzerindeki HEK293FT hücreden çıkarılan 1X mononükleozomu eritirin.

İlk optimizasyon için, 1X nükleozomun SPIN4 proteinine karşı birde bir molar oranını hesaplayın. 1X nükleozomu eşit hacimde 2X boncuk engelleme tamponu ile karıştırın. Daha sonra karışımı önceden bloklanmış boncuklarla 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve dört derece Celsius ve 20 RPM'de bir tüp rotatorunda dört saat boyunca inkübe yapın.

Karışımı 3000G'de üç dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Süpernatant atıldıktan sonra, boncukları bir mililitre BC-150 liz tamponuna geri askıya alın ve 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Boncukları üç kez yıkamak için, 3000G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın.

Süpernatant atıldıktan sonra, pelleti bir mililitre BC-150 lizis tamponu ile yeniden askıya alın. Tekrar yıkamalar arasında boncukların eşit dağılımı için tüpü ara sıra karıştırın. Sonra, resüspansiyon ile santrifüj aşamaları arasında 20 RPM ve dört derece Celsius sıcaklıkta bir rotator üzerinde 10 dakikalık bir kuluçka aşaması dahil olmak üzere iki ek yıkama işlemi yapılır.

Son yıkamadan sonra, boncukları BC-150 lizis tamponu dokuz sütunlu cildde yeniden askıya alın. Her örnekten 160 mikrolitre boncuk, 40 mikrolitre 5X Laemmli tamponu ile karıştırın. Denatürasyon için 95 derece Celsius'ta beş dakika ısıtın.

İsteğe göre, azaltılmış arka planla daha temiz sonuçlar elde etmek için protein nükleozom kompleksinin FLAG peptid illüzyonunu gerçekleştirin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3000G santrifüj yapın. Sonra gümüş boyama ve Western blotlama uygulayarak modifiye edilmiş histon SPIN4 bağlanmasını doğrulamak ve tespit etmek için yapılır.

SPIN4, histon H3 Lizin 4 veya H3K4, monometil, dimetil ve trimetil peptitlere anlamlı şekilde bağlanır. Buna karşılık, SPIN4 D82H fonksiyon kaybı mutantı tüm hedeflere azalmış bağlanma gösterdi ve bu da Tudor alan 1'in substrat bağlanması için vazgeçilmez olduğunu doğruladı. SPIN4'ün bağlanma afinitesi, H3R2me2s ve H3R2me2a gibi diğer translasyonel değişikliklerin israr ettiği doğrulamalar tarafından olumsuz etkilenir.

Tutarlı peptid dizisi gözlemleriyle, SPIN4 D82H, vahşi tip SPIN4'e göre nükleozom bağlanmasında genel bir azalma göstermiştir. Western blot analizi, SPIN4 ve SPIN4 D82H pulldown örneklerini karşılaştırarak, SPIN4 D82H'nin monometil, dimetil veya trimetil H3K4 peptitlerine ölçülebilir bir bağlanma olmadığını gösterdi ve bu ikili yaklaşımları, göreceli histon translasyonel sonrası modifikasyon substratlarını hızla belirlemek için doğrulandı. Histon bağlayıcı proteinlerin bağlanma substratlarının hızlı ve hedefli doğrulanması.

Her adayın histon bağlayan proteinlerinin ekspresyonu ve saflaştırılması için gereken koşullar değişkenlik gösterebilir. Doğal mononükleozom pulldown'ını takip eden histon kütle spektrometrisi, histon PTM'lerin tam kapsamını verir.