Name: Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Keşfedin, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown yöntemleriyle SPIN4'ün histon bağlama substratlarını nasıl tanımlayacağınızı. Bu protokol, epigenetik okuyucu proteinlerin bağlanma özelliklerini hızlıca belirlemek için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>Genel deneyler</td></tr><tr><td>15 cm doku kültürü kabı</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903.300</td><td>Genel deneyler</td></tr><tr><td>15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.101</td><td>Genel deneyler</td></tr><tr><td>50 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004</td><td>Genel deneyler</td></tr><tr><td>500 mL Erlenmeyer Matarası</td><td>Stellar Scientific</td><td>CT229809</td><td>Sf9 hücre kültürü</td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 CCD Görüntüleyici</td><td>Cytiva</td><td>IMQ800</td><td>CCD görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Jeli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Biyokimyasal pulldown</td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0017</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Array Analyze Sofrware</td><td>Aktif Motif</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>MODified peptid dizi veri analizi</td></tr><tr><td>ASI Agarose LE</td><td>Alkali Scientific</td><td>A7700</td><td>DNA jeli</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus İfade Sistemi</td><td>Termo Bilimsel</td><td>10359016</td><td>Baculoviral ekspresyon</td></tr><tr><td>Benzamidin hidroklorür</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-W018781</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Protein nicelik standardı</td></tr><tr><td>Bromofenol Mavisi</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A18469.08</td><td>Lammeli tamponu</td></tr><tr><td>Coomassie Parlak Mavi R-250</td><td>Termo Bilimsel</td><td>20278</td><td>Protien jel boyama</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5545</td><td>Liz tamponu</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>RPI araştırma ürünleri</td><td>E58100</td><td>Liz tamponu</td></tr><tr><td>Geliştirilmiş Kemimilüminesans (ECL) altlığı</td><td>Cytiva</td><td>RPN2232</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ESF 921 Böcek Hücresi Kültür Ortamı</td><td>İfade Sistemleri</td><td>96-001</td><td>Sf9 hücre kültürü</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>ET107</td><td>DNA çökeltmesi</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Görüntüleme Sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>M5000</td><td>Genel görüntüleme</td></tr><tr><td>FLAG peptidi</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7006</td><td>Pulldown elyusiyonu</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G77893</td><td>Depolama tamponu</td></tr><tr><td>H3K4me1 antikor&nbsp;</td><td>Aktif Motif</td><td>39300</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>H3K4me2 antikor&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9725T</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>H3K4me3 antikor&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9751T</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>HEK293FT hücreleri</td><td>Termo Bilimsel</td><td>R70007</td><td>İnsan embriyonik böbrek fibroblasthücre hattı</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Liz tamponu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp; Java tabanlı görüntü işleme programı</td></tr><tr><td>Leupeptin hemisülfat</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-18234A</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Mikrokokkal Nükleaz (MNaz)</td><td>NEB&nbsp;</td><td>M0247S</td><td>Kromatin sindirimi için endonükleaz</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Sonikasyon</td></tr><tr><td>MODified Histon Peptit Dizisi</td><td>Aktif Motif</td><td>13005</td><td>Protein bağlanma testi</td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0018</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Peroksidaz IgG Fraksiyonu Monoklonal Keçi Anti-Fare IgG, hafif zincire özgü</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-174</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>pFastBac1-Bayrak-SPIN4</td><td>Termo Bilimsel</td><td>10360014</td><td>Baculoviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pFastBac1-Bayrak-SPIN4-D82H</td><td>Termo Bilimsel</td><td>10360014</td><td>Baculoviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>DNA arıtma</td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Test Kiti</td><td>Termo Bilimsel</td><td>PIA53226</td><td>Protein niceliklendirmesi</td></tr><tr><td>Pierce Gümüş Leke Kiti</td><td>Termo Bilimsel</td><td>24612</td><td>Protein tespiti</td></tr><tr><td>PMSF Proteaz İnhibitörü</td><td>Termo Bilimsel</td><td>36978</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Poliakrilamid Jel</td><td>Kendi yapım</td><td>Yok</td><td>Protein jeli</td></tr><tr><td>Sf9 böcek hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>Bakülovirüs ifadesi için böcek hücre hattı</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazı, 10K MWCO</td><td>Termo Bilimsel</td><td>69572</td><td>Protein diyalizi</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>DNA çökeltmesi</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP358-1</td><td>Genel tamponlar</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L3771</td><td>Genel tamponlar</td></tr><tr><td>Trypan Blue Çözeltisi (%0,4)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>15250061</td><td>Çekirdek boyama</td></tr></tbody></table>

değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (spin4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

identification-modified-histones-as-binding-substrates-human-spindlin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca...

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Keşfedin, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown yöntemleriyle SPIN4'ün histon bağlama substratlarını nasıl tanımlayacağınızı. Bu protokol, epigenetik okuyucu proteinlerin bağlanma özelliklerini hızlıca belirlemek için uyarlanabilir.

Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması (Video) | JoVE Journal

Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

Daha fazla video keşfet