Tek Hücreli ve İmmünoflüoresans Analizi İçin Dişi Fare Üretral Epitelini İzole Etmek İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Grubumuz, genitourürinar trakttaki epitel desenlerini incelemekle ilgilenmektedir. Bu protokol, dişi fare üretrasının epitel tabakasını izole etmenin optimize edilmiş bir yöntemini moleküler ve hücresel analiz için temsil eder. Bu makalede açıklanan yöntemler, kadın üretra tabakası ve bağışıklık savunmasındaki rolü üzerine araştırmalara yardımcı olacaktır.

Başlamak için, 6 ila 12 haftalık ötanazi edilen dişi CD1 faresini diseksiyon masasına sırtüstü pozisyona yerleştirin. Karın bölgesine %70 etanol sprey ile saçları ıslatın. Penss kullanarak karın derisini kaldırın.

Sonra küçük makasla alt vücuda doğru dikey bir kesi yapın ve dış üretral açıklıkta sona erer. Mesanesi tespit edin ve pensle nazikçe kaldırın, boş ve idrarsız olduğundan emin olun. Makasla, mesane çevresindeki yağ ve bağ dokusunu keserek iki pubik kemiğin kasık simfizinde birleştiği kelebek şeklindeki yapıyı ortaya çıkarın.

Pubik simfizin altında akan üretra akışını gözlemleyin. Sonra forsepsle pubik simfizi kaldırıp makasla kesin. Vajinal duvarın ventral yüzeyinde bulunan ince üretrayı ortaya çıkarmak için pubik kemik parçalarını çıkarın.

İnce forseps kullanarak, mesaneyi vücut boşluğundan nazikçe yukarı doğru çekin. İratör ile vajinal duvar arasında makas geçirerek idrar ve üreme yollarını ayırın. Üretranın arkasını keserek vajinal duvardan ayırmak için mesanede hafif gerginlik kalın.

Tam uzunlukta fare üretrasını elde etmek için distal üretra açıklığına kadar kesmeye devam edin; uzunluğu 1,2 ila 1,5 santimetre arasındadır. Sonra, mesane boynunda tek bir kesik yaparak üretrayı mesaneden ayırın. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen taze HBSS içeren steril bir Petri kabında dört ila beş üretra biriktirin.

Bir disseksiya mikroskobu altında, üretra çevresindeki yağ ve bağ dokusunu ince nokta forseps ve makasla kesin. Sonra makasla, her üretrayı çapraz şekilde eşit boyutta iki parçaya kesin. Doku parçalarını 100 mikronluk naylon ağ süzgeçin üzerine yerleştirin.

Doku parçalarını bir mililitre HBSS ile yıkayın, ardından antibiyotik ve antimikotiklerle desteklenen HBSS'de hazırlanmış bir mililitre %1 tripsin içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sonra, örneği bir rotatorda dakikada 30 devir ve dört derece Celsius ile 15 ila 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Sindirimden sonra, HBSS'de hazırlanmış 10 milimolar magnezyum klorür tüpe ekleyin, ardından PBS'de hazırlanmış DNAse I mililitrede 10 mikrogram ekleyin.

Tüpü 37 derece Celsius hibritizasyon fırınına yerleştirilmiş bir rotator üzerinde 15 ila 30 dakika kuluçka yapın. Tripsini söndürmek için, üretral dokuları oda sıcaklığında HBSS'de %10 koyun serumu içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Beş dakika sonra, üretra dokularını buz gibi HBSS içeren yeni bir tüpe ve ardından buz gibi HBSS içeren steril bir Petri kabına aktarın.

Örneği mikroskop altında incelerken, üretra parçasının bir ucunu bir çift forsepsle tutun. Başka bir forseps çifti kullanarak, üretral parçanın tüm uzunluğu boyunca geçirerek şeffaf epitel tabakasını dışarıya çıkarın. İzole edilmiş üretral epitel tabakalarının bazılarını doğrudan tam montaj immünboyama için işleyerek epitel hücreleri ve epitelyal ilişkili makrofajları yerinde görselleştirin.

Epitel parçalarını, dört ila beş birikmiş fare üretrasından izole edilmiş bir damla HBSS ile steril Petri kabına aktarmak için küçük bir plastik pipet kullanın. Epitelyi küçük parçalara bölmek için makas kullanın. Kıyma epitel parçaları, 37 derece Celsius'ta 1,5 mililitre önceden ısıtılmış Accutase sindirim çözeltisi içeren iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Örneği bir rotator üzerinde 37 derece sıcaklıkta bir saat boyunca kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, tüm içeriği kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X PBS ile %1 BSA'dan oluşan iki mililitre yıkama tamponu içeren beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Süspansiyonu 600 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta salınan bir kovalı rotor kullanarak santrifüjleyin.

Sonra, süpernatantı nazik bir vakum ile aspire edin. Sonra bir mililitrelik filtre ucu pipeti kullanarak peleti bir mililitrelik yıkama tamponuna yeniden süskü tuttur. Pelleti yukarı aşağı pipetle parçalayın, ta ki kümeler küçülsün.

Süspansiyon, her iğne için dört darbe kullanılarak bir mililitrelik şırıngaya bağlanan 23.5 ve 26.5 gauge iğnelerden geçirin. Sonra, beş mililitrelik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 30 mikronluk ön ayırma filtresinin yüzeyini ıslatmak için bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. 26.5 gauge iğneye bağlı şırıngayı kullanarak hücre süspansiyonundan bir mililitre filtre aktarın.

Sonra tüpü bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın ve filtreden geçirin. Hücreleri, salınan bir kovalı rotorla 600 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjle pellet edin. Üst natantı aspire edin.

Pelleti 100 mikrolitre yıkama tamponuna geri bırakın ve 100 mikrolitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin. Tam üç dakika sonra, dört mililitre yıkama tamponu ekleyin ve karıştırın. Hücreleri, sallanan bir kovalı rotor kullanarak 600 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjle hasat edin.

Pellet boyutuna bağlı olarak 50 ila 200 mikrolitre yıkama tamponu ile tekrar süslemeden önce süpernatantı çıkarın. Beş mikrolitrelik bir hücre alikotunu beş mikrolitre tripan mavisiyle karıştırın ve karışımı hemositometreye yükleyerek hücre verimi ve canlılığını değerlendirin. Akış sitometrisi kullanarak hücre yaşamlılığını değerlendirin ve farklı hücre popülasyonlarını nicelikle ölçerin.

Üretral epitel tek hücreleri, bazal membran matrisi ve organoid genleşme ortamında kültürleyerek üç boyutlu üretral epitel organoidleri üretir. Gömülü organoid kesitlerde hematoksilin eozin boyama ve floresan immünboyama işlemi uygulayarak organoid yapıyı ve hücresel bileşimi görselleştirin. İzole üretral epitel kılıfları, ayrıldıktan sonra stromal dokudan daha yüksek şeffaflığa sahipti.

Epitel kılıflarının tüm montaj immünboyamasında E-kadherin CDH1 antikoru ile güçlü etiketlenme gösterildi. Levhaların F480 antikoruyla etiketlenmesi, makrofajların üretra epitel hücreleri arasında dallanan dendritik yapılar oluşturduğunu gösterdi. Üretral epitelden izole edilen tek hücreler, hemositometrede tripan mavisi dışlanması ve amin reaktif Ghost Dye V 450 kullanılarak akış sitometrisi ile sürekli yüksek canlılık gösterdi.

İzole edilen hücreler, canlı hücrelerde kapatıldıktan sonra zenginleştirilmiş epitel hücre popülasyonu içeriyordu. CD45 pozitif bağışıklık hücrelerinin yaklaşık %1,3'ü ve %1,18'i makrofajlar tek hücreli süspansiyonlarda gözlemlendi. Üretradan izole edilen tek epitel hücreleri canlı kaldı ve kültürde altıncı güne kadar organoid büyümesi gözlemlenen üç boyutlu bir matriks içinde organoidler oluşturdu.

Hematoksilin eozin boyama, üretral epitel organoidlerinin iki farklı morfolojisini gösterdi; bunlar arasında büyük boş organoidler ve daha küçük katı organoidler bulundu. Hem boş hem de katı üretral epitel organoidleri tabakalanarak bazal tabakada KRT5 ve P63 ifade edildi. KRT-13'ü suprabazal ve ara hücre katmanlarında ifade ettiler.

Proksimal üretradan üretilen organoidler daha yüksek oranda boş organoidler gösterirken, distal üretradan gelen organoidler daha fazla katı küre oluşturdu. Bu protokol, araştırmacıların proksimal ve distal üretradan epitel hücrelerin üretral hücre tiplerini ve kendini yenileme kapasitesini incelemelerine olanak tanır. Bu protokolün en önemli hususlarından biri, tam uzunlukta üretra ve optimal enzimatik sindirimin dikkatli diseksiyon edilmesi ve aşağı akış analizi için canlı üretral epitel hücreleri elde edilmesidir.

Bu protokolle üretilen epitel hücreleri, tek hücreli RNA dizileme, toplu RNA dizileme, akış sitometrisi, immünboyama ve organoid kültür gibi birçok uygulama için kullanılabilir.