Fototrombotik İnme Modelleme ve Davranış Eden Farelerde Nöronal ve Astrositik Aktivitenin In Vivo Optrode Kaydı İçin Entegre Bir Yöntem

Araştırmamız, davranış sergileyen farelerde iskemik inme sırasında astrosit ve nöron aktivitesini eş zamanlı olarak kaydetmek için entegre bir yöntem geliştirmektedir. Önceki yöntemler nöronları veya astrositleri ayrı ayrı kaydetmekteydi. Protokolümüz, inme başlangıcının ilk anlarından itibaren astrosit ve nöron sinyallerini eş zamanlı olarak yakalar.

Başlamak için, derin anestezi altındaki bir C57BL/6J faresini anestezi maskesiyle donatılmış stereotaksik çerçeveye aktarın. Geri bildirim kontrollü bir ısıtıcı ped ile fare vücut sıcaklığını 36 ile 37.5 °C arasında tutarken, her 10 dakikada bir anestezinin derinliğini izleyin. Gözlere oftalmik pomad uyguladıktan sonra fareyi kulak barları ve ağız barı ile stereotaksik çerçeveye sabitleyin.

Baş simetrik olarak sabitlendikten sonra, nazikçe yoklayarak baş immobilizasyonunu doğrulayın. Tüylerin temizlenmesi ve septik cilt hazırlığının ardından, orta hat boyunca bir insizyon yapmak için cerrahi makas kullanın. Bregma ve lambdayı ortaya çıkarmak için periostu salin ve pamuklu çubuklarla temizleyin.

Cam mikropipeti sırasıyla bregma ve lambda noktalarına değecek şekilde indirin. Dijital kumpas üzerindeki Z koordinatını not ettikten sonra, fark 0,04 milimetreden az olana kadar ağız çubuğunu ayarlayın. Cam mikropipeti bregma noktasına değecek şekilde indirin ve dijital kumpası sıfırlayın.

Mikropipeti sırasıyla bregmanın 2,3 milimetre soluna ve sağına hareket ettirin. Z koordinatını not ettikten sonra, bilateral farklar 0,04 milimetrenin altına düşene kadar kulak barlarını ayarlayın. Dijital kumpası bregmada sıfırladıktan sonra, motor korteks ön kol bölgesini anterior posterior artı 1,5 milimetre ve medial lateral artı 0,74 milimetre olarak işaretleyin.

İşaretlenen konuma yaklaşık 0.5 milimetre çapında küçük bir delik açmak için mikro matkap ve 0.5 milimetrelik yuvarlak uçlu matkap uçları kullanın. Yüklemeden önce, iki adeno-associated viral vektörü eşit hacimlerde karıştırın ve örneği kısa süreliğine santrifüjleyin. Mikroinfüzyon pompasına bağlı cam mikropipeti, beyin yüzeyinden eksi 0.94 milimetrelik bir dorsal-ventral derinlikte hedef bölgeye indirin.

Her bir vektörden 200 nanolitre içeren viral karışımın 400 nanolitresini dakikada 50 nanolitre hızla infüze edin. İnfüzyon tamamlandıktan 10 dakika sonra pipeti yavaşça geri çekin. Kafa derisini 4-0 20 milimetrelik, 3/8 daire şeklinde sütürle dikin ve fareyi tam iyileşme sağlanana kadar bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.

Viral enjeksiyondan üç ila dört hafta sonra, kafa derisi insizyonuna kadar olan kısmı önceden gösterilen prosedürü takip ederek uygulayın. Kafa derisi insizyonu sırasında, gözlerin çevresinde yeterli deri bırakarak 1,5 santimetre x 1,5 santimetre boyutunda kafa derisini çıkarın. Kafatasını hidrojen peroksit ve %0,9'luk salin ile temizleyin.

Bregma belirlendikten sonra, dijital kumpası sıfırlayın. Kafatası yüzeyini hafifçe pürüzlendirmek için 0,8 milimetrelik yuvarlak uçlu bir matkap kullanın. Motor korteksin ön kol bölgesini işaretleyin.

Anterior posterior eksende 1,5 milimetre ve medial lateral eksende 0,74 milimetre işaretleyin. Bu işareti merkez noktası olarak kullanarak beş milimetreye beş milimetre boyutunda bir kare çizin. Kareyi takip etmek için yaklaşık 10.000 devir/dakika hızında bir mikro matkap kullanın.

Matkap yoluna sürekli olarak buz gibi soğuk salin uygulayın ve kemik flebi gevşerse işlemi derhal durdurun. Kontralateral hemisfer ve serebellum üzerine 0,5 milimetre çapında üç küçük delik açın. Deliklere kraniyoplasti vidalarını yerleştirin.

Beyin dokusunun zarar görmesini önlemek için her bir vidanın dura mater'e ulaştığından ancak daha derinlemesine nüfuz etmediğinden emin olun. Gevşetilen kemik flebini çıkarmak için pens kullanın. Beyin dokusuyla doğrudan temastan kaçınarak, kranial penceredeki durayı çıkarmak için 0,03 mm x 0,01 mm'den daha küçük ultra ince uca sahip ultra ince pensler kullanın.

Optrodu optodeyi stereotaksik çerçevesinin mikromanipülatör koluna sabitleyin ve kraniyal pencerenin üzerine hareket ettirin. Optrodun gümüş şase ve referans tellerini üç kraniyoplasti vidasına güvenli bir şekilde dolayın. Kraniyal pencere yüzeyini steril salin ile temizleyin.

Optro'yu, saniyede 1 milimetre hızla, -0,94 milimetre olan istenen dorsal-ventral derinliğe yavaşça indirin. İmplantasyon sonrası kraniyal pencerenin üzerine bir kat agaroz uygulayın. Üç ila dört kat diş dolgu malzemesi uygulayın.

Dental siman sertleştikten sonra, üç ila beş gün boyunca analjezi uygulayın ve farenin bir ila iki hafta boyunca iyileşmesini bekleyin. GCaMP6s'i uyarmak için çift veya üç dalga boylu bir fiber fotometri sistemi kullanın. Sinyal kanalını 470 nanometreye, kontrol kanalını ise 410 nanometreye ayarlayın.

Örnekleme hızını saniyede 60 kareye ayarlayın. Şimdi, tüm kayıt sistemi bileşenlerini uygun şekilde topraklayın. Kayıt sırasında ortak bir medyan referansı kullanın.

Kayıt oturumu boyunca gürültü takibi yaparken, kayıt yazılımında geniş bant ve yerel alan potansiyeli sinyallerinin seçili olduğunu doğrulayın. Fareyi kısa süreliğine anesteziye aldıktan sonra, optro'yu bir adaptör aracılığıyla kayıt hattına bağlayın. Kayıt için fareyi ev kafesine benzer bir ortama yerleştirin.

Uyandıktan sonra 10 dakika adaptasyon süresi tanıyın. Beş dakika boyunca dakikada bir çekiş gerektiren kavrama kuvveti testini gerçekleştiren fareyi kaydedin. Davranışsal testleri hem çok kanallı hem de fiber fotometri sistemlerinde hassas bir şekilde zaman damgasıyla işaretleyin.

1,5% Rose Bengal boya çözeltisini kilogram başına 10 ila 20 miligram dozunda intraperitonal olarak uygulayın ve beş dakika bekleyin. Derin anestezi sağlandıktan ve korunduktan sonra optrod probunu lazer kaynağına bağlayın. Fokal iskemi oluşturmak için implantlanmış optrod üzerinden 530 nanometre lazer ışınını 15 miliwatt gücünde beş ila sekiz dakika boyunca uygulayın.

Optogenetik stimülasyonu gerçekleştirmek için lazer stimülatörünü optroda ile bağlayın. 488 nanometrelik optogenetik lazer stimülatörünü açın ve Opto-vTrap için beş dakika boyunca 10 miliwatt olarak ayarlayın. Son olarak, fareyi toparlanması için ısıtmalı bir pedin üzerine yerleştirin.

Bazal değerlerle karşılaştırıldığında, serebral kan akımı fototrombosis sonrası azalmış ve inmeden bir gün ve yedi gün sonra baskılanmış halde kalmıştır. Ön kol kavrama kuvveti, inmeden bir gün sonra oldukça belirgin bir düşüş göstermiş ve yedi gün sonra baskılanmış halde kalmıştır. Fiber fotometri ile kaydedilen astrositik kalsiyum geçişleri ve elektrofizyolojiden elde edilen nöronal spike'lar zaman damgalarına göre hizalanmıştır.

Fototrombotik inme sonrası, ön ekstremite kavrama görevi sırasındaki bazal ateşleme ile karşılaştırıldığında, hem piramidal nöronlarda hem de internöronlarda ateşleme hızları önemli ölçüde baskılanmıştır. Bazal seviyede, astrositik kalsiyum geçişleri görev başlangıcından sonraki dört ila altı saniye içinde zirveye ulaşmıştır. Ancak, fototrombotik inme sonrası genlik önemli ölçüde azalmış olup, bu durum zayıflamış kalsiyum aktivitesini yansıtmaktadır.

Raster grafikleri ve peri-stimulus zaman histogramları, optik stimülasyon sırasında nöronal aktivitedeki değişimleri göstermiştir. Hem piramidal nöron hem de internöron ateşleme hızları, stimülasyon öncesi bazal seviyeye kıyasla optik stimülasyondan sonra belirgin bir azalma göstermiştir; bu durum, astrosit modülasyonunun lokal devre uyarılabilirliği üzerinde ölçülebilir bir alt akış etkisi olduğunu doğrulamaktadır. Bu protokol, akut başlangıç evresinden kronik evreye kadar olan inme zaman çizelgesi boyunca egzersizin ve nöroaktivitenin kesintisiz olarak kaydedilmesine olanak tanır.

Bu protokoldeki başarı, hassas veya koordinatlı hizalamaya bağlıdır. Monoküler optrot implantasyonu ve cerrahiler boyunca yeterli virüs ekspresyon süreleri önemlidir. Gelecekteki çalışmalar, daha geniş beyin bölgelerini izlemek veya çeşitli davranışsal analizlerle farklı hücre tiplerini hedeflemek için birden fazla implant kullanabilir.