Kombine Fizyolojik Pulsatil Kayma Stresi ve Salınım Hiperglisemi Altında Endotel Disfonksiyonunu Modellemek İçin Mikrofluidik Bir Sistem

Bu çalışma, senkronize salınımlı hiperglisemi ile pulsatil kesme stresinin birlikte diyabetik damar hastalıklarında endotel disfonksiyonunu nasıl yönlendirdiğini araştırmaktadır. Mevcut modeller başlangıç yüksek glikoz veya sabit laminar akış kullanır. Pulsatil kesme stresinin salınımlı glikoz hasarını nasıl karşı koyduğunu araştırıyoruz.

Başlamak için, mikrofluidik çip yapısını tasarlamak için bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanın. SU-8 ana kalıbını ticari bir şirket aracılığıyla yapın. Temiz bir karıştırma kabında, polidimetilsiloksan kürleme ajanı ve ön polimeri ağırlık oranında 10:1 oranında karıştırın ve karışımı el ile beş dakika boyunca sertçe karıştırın.

Daha sonra kabı 0.08 megapaskal basınçta en az 15 dakika boyunca vakum odasına yerleştirerek karıştırma sırasında sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarabilirsiniz. Polidimetilsiloksanı, cam Petri kabına yerleştirilen waferin üzerine dök. Polidimetilsiloksanın dedektasyonu, döküm sırasında oluşan kabarcıkları temizlemek için bir kurutucu ile waferin üzerine ek 15 dakika döküldü.

Kalıp ve polimeri içeren Petri kabını, 80 derece Celsius sıcaklığa ayarlanmış sıcak fırına iki saat boyunca yerleştirin. Bir bistüri kullanarak, ana kalıptan sertleşmiş polimer levhayı dikkatlice soyun. Çekirdek delme aracı kullanarak, polimer levhada belirlenen kanal uçlarında giriş ve çıkış portları oluşturun.

Cam kapak parçasını ve polimer plakanın desenli yüzeyini yapışkan bantla temizleyin. Sonra, hem polimer levhayı hem de cam kapak parçasını 65 watt gücünde plazma temizleyiciyle oda havasında 60 saniye boyunca işletin. Polimer kanal yüzeyini cam kapak slipinin işlenmiş tarafıyla hemen hizalayın.

Sonra nazikçe basarak kalıcı olarak kapalı bir mikrofluidik kanal oluşturun. Bağlanmış mikrofluidik çipi, deiyonize su ile doldurulmuş boronlu cam şişeye yerleştirin. 121 derece Celsius ve 15 pound/inç kare sıcaklıkta 20 dakika boyunca otoklavlama ile sterilize edin.

Sterilize edilmiş çipi, içinde PBS ve düşük glikozlu DMEM karışımı bulunan 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Sonra bir mililitrelik bir şırınga kullanarak kanala mililitrede 100 mikrogram fibronektin akın ve 37 derece Celsius'ta dört saat kuluçka yapın. Sonra, osmotik basıncı yükseltmek için düşük glikozlu DMEM'e 24,5 milimolar demanitol ekleyin.

Yüksek glikozlu DMEM'e beş milimolar D-glikoz ekleyin; böylece nihai konsantrasyon 30 milimolar glikoz elde edilir. %20 FBS ve %1 penisilin streptomisin takviyesi ile takviye edilmiş normal glukoz kültür ortamı ve yüksek glukozlu kültür ortamı hazırlayın. Sonra PBS, tripsin, normal glukoz kültür ortamı ve yüksek glukozlu kültür ortamını 37 derece Celsius'ta su banyosunda ısıtın.

İnsan göbek damarının endotel hücrelerini kültür kabından %90 birleşimde alın. Hücreleri %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın. Hücreler 37 derece Celsius'ta 30 saniye kuluçka edildikten sonra, toplanan hücreleri sayın ve onları normal glikoz ve yüksek glikoz ortamında ayrı ayrı tekrar askıya alın, konsantrasyonda mililitrede 1 kat 10 ile 6 hücre gücünde yeniden askıya alın.

Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, mikrofluidik çipin giriş portuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edilir; kontrol grubu için normal glukoz ortamı ve deneysel grup için yüksek glikoz ortamı kullanılır. Mikrofluidik çipleri 37 derece Celsius sıcaklığında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine ve %5 karbondioksit ile 48 saat boyunca yerleştirin. Sunulan denklemi kullanarak hedef darbesel kayma gerilimini elde etmek için gereken akış hızını hesaplayın.

Basınç kaynağını basınç kontrolörüne bağlayın. Sonra basınç kontrolcüsünü, bilgisayara bağlı valf kontrolörüne bağlayarak basınç dalgası formlarının otomatik kontrolü sağlanır. İki adet 100 mililitrelik rezervuarı doldurun; biri normal glikoz kültür ortamı, diğeri ise yüksek glukozlu kültür ortamı ile doldurun.

Rezervuarları basınç kontrolörünün ilgili kanallarına bağlayın. Sonra rezervuarları ve iki pozisyonlu üç yönlü manyetik valfi silikon boru ile birbirine bağlayın. Yaklaşık dakikada 200 mikrolitre akış hızına karşılık gelen hedef fizyolojik darbesel kesme gerilmesini ayarlayın.

Programlanabilir hava pompasını, pulsatil kayma gerilmesini korumak için sinüs dalgası fonksiyonu üretecek şekilde programlayın. Sonra, valf kontrolörünü her beş dakikada bir kanal değiştirecek şekilde programlayın ve dinamik uyarım sırasında kare dalga glikoz salınımı oluşturulur. İki pozisyonlu üç yönlü manyetik vana ile mikrofluidik çipi silikon boru ile bağlayın.

Sonra programlanabilir pompa sistemini başlatarak borunu astarlayın. Sonra, 1,3 milimetre çaplı 90 derece açılı paslanmaz çelik konnektörler kullanılarak, mikrofluidik çipin giriş ve çıkış portlarını boruya takılır. Mikrofluidik çip çıkışını atık deposuna bağlayın, ardından pompayı tekrar çalıştırarak toplam 30 dakika boyunca birleşik salınımlı glikoz ve pulsatil kesme gerilimi verin.

Akış alanı doğrulaması yapıldıktan sonra, üreticinin deneysel uç noktasında talimatlara uygun olarak kalsein ve propidium iyodid çalışma çözümünü hazırlayın. Kanal bir kez PBS ile durulandıktan sonra, kalsein ve propidium iyodid çalışma çözeltisini kanala sokun ve 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile 30 dakika karanlıkta inkübe yapın. Hemen 10 kat objektif lens ile donatılmış ters floresan mikroskopla lekelenmiş hücrelerin floresan görüntülerini yakalayın.

10x objektif lens ile donatılmış ters floresan mikroskopla lekelenmiş hücrelerin floresan görüntülerini hemen yakalayın. Kalsein için floressein izotiosiyanat yeşil filtresini, propidyum iyodid için ise tetrametilrhodamin veya rodamin kırmızı filtreyi kullanın. Kanalı PBS ile üç kez yıkandıktan sonra, canlı hücre oksidatif stres floresan prob çözeltisini kanala sokup daha önce gösterildiği gibi kuluçka yapın.

Kanalı PBS ile üç kez yuyup, bağlanmamış probu çıkarın. Hemen 20x objektif lens üzerinden uzak kırmızı filtre ayarıyla tüm gruplarda aynı pozlama parametrelerini koruyarak flüoresan görüntüleri yakalayın. Alınan kalsein yeşili ve propidyum iyodür kırmızı görüntüleri ImageJ'de açın.

Her kanal için eşik noktasını manuel olarak ayarlayarak floresan sinyalleri arka plandan ayırt edin. Hücre sayacı kullanarak floresan hücreleri niceliklerini ölçebilirsiniz; gözlemlere dayanarak minimum hücre boyutunu ayarlayarak birden fazla görüş alanında canlı ve ölü hücre sayısını belirleyebilirsiniz. Her deneysel durum için elektronik tablo yazılımı kullanarak canlı hücrelerin yüzdesini hesaplayın.

Sonra, grupları karşılaştırmak için istatistiksel analiz yazılımı kullanarak birden fazla görüş alanı boyunca ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. Seçtiğiniz görseli ImageJ'ye sürükleyin. Mikroskop metaverisi kullanarak piksel boyutunu kalibre etmek için Analyze ve Set Scale seçin.

Sonra, Süreç ve Arka Plan Çıkar seçeneğini seçerek tüm görüntüden belirsiz bir arka plan sinyalini çıkarın. Sonra, Image'ı seçin, Adjust ve ardından Threshold'u seçin; böylece eşik kaydırıcısını manuel olarak ayarlayın ve hücre içi reaktif oksijen türü sinyalini tanımlayın. Ölçümleri Analiz et'i seçerek ve Ölçümleri Alan ve Ortalama gri değeri dahil ederek ayarlayın.

Gözlemlenen hücre boyutlarına dayalı minimum hücre boyutunu belirlemek ve hücre monolayer ROI içindeki segmentli sinyalin ortalama yoğunluğunu ölçmek için Analiz ve Analiz Partikülleri seçin. Her deneysel durum için reaktif oksijen türleri seviyesini, çip başına en az üç rastgele seçilmiş görüş alanından elde edilen ölçülen değerlerin ortalaması olarak raporlayın. Nicel sonuçları veri analizi ve grafik yazılımına girin.

Deneysel grupları kontrol grubuyla karşılaştırarak istatistiksel anlamlılığı belirleyin; iki yönlü varyans analizi ve ardından 0,05 anlamlılık seviyesiyle Tukey post-hoc testi uygulanır. Analizi yapmak ve standart sapmayı temsil eden hata çubuklarıyla grafikler oluşturmak için yazılımı kullanın. Temsilli floresan görüntüleri, tüm gruplarda canlı hücrelerin yüksek oranında olduğunu gösterdi; normal glikoz ve normal glikozda pulsatil kayma stres gruplarında kayda değer hücre ölümü gözlemlendi; salınımlı glikoz ve titreşimli kayma stres gruplarına sahip glukozda ise ölü hücrelerde gözle görülür bir artış görüldü.

Nicel analizler, salınımlı glikoz maruziyetinin, kontrol grubuna kıyasla hücre canlılığında önemli bir azalmaya yol açtığını ve titreşimli kesme stresinin yalnızca salınımlı glukoza kıyasla canlılığı önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Normal glukoz koşullarında, hücre içi reaktif oksijen türleri düşük olup, kesme stresi uygulandıktan sonra daha da düştü. Oysa salınımlı glukoz koşulları kırmızı floresan yoğunluğunda belirgin bir artışa yol açtı ve bu da reaktif oksijen türlerinin arttığını gösteriyordu.

Hücre içi reaktif oksijen türlerindeki salınımlı glikoz kaynaklı artış, kesme stresinin uygulanmasıyla azalmıştır. Nicel analiz, kesme stresinin normal glukoz koşullarında reaktif oksijen türlerinin seviyelerini önemli ölçüde azalttığını ortaya koydu. Buna karşılık, salınımlı glukoz koşulları, normal glukoza kıyasla reaktif oksijen türleri seviyelerinde önemli bir artışa yol açmıştır.

Ayrıca, kesme stresi, salınımlı glikoz koşullarında bile reaktif oksijen türleri seviyelerini önemli ölçüde azaltmıştır. Bu protokol, ROS seviyelerini ve hücre kullanılabilirliğini niceleyerek endotel disfonksiyonunu salınımlı hiperglisemi ve pulsatil kesme stresi altında incelemeyi sağlar. Bu prosedürün ardından, NRF2 yolu veya iNOS sinyalizasyonu gibi moleküler analizler endotel koruma mekanizmalarını enülasyon etmek için yapılabilir.

Gelecekteki çalışmalar bu sistemi mekanobiyolojik yolları keşfetmek, akış geometrilerini veya düz kas hücresi ortak kültürünü dahil etmek için kullanabilir.