Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Odaklanıyoruz, yapışkan invaziv E.coli'nin bağırsak epitel hücrelerini nasıl istiladığını ve bu sürece katkıda bulunan bakteriyel faktörleri belirlemeye odaklanıyoruz. Gentamisin dirençli izolasyonlar geleneksel invazion testlerini sınırlar. Bu amikacin tabanlı protokol, hücre içi bakterilerin doğru şekilde nicelenmesini sağlar.

Başlamak için, işgal testi için gereken tüm reaktifleri ve medyayı toplayın. Sonra, 80 derece Santi-Celsius dondurucudan yapışkan invaziv Escharicia colli (AIEC) suşunun dondurulmuş gliserol stokunu alın. Steril bir tahta çubuk veya pipet ucu kullanarak, saptan bakterileri nazikçe kazıyıp Luria-Bertani veya LB burgu plakasına çizerek tek koloniler elde edin.

Plakayı gece boyunca 37 derece Celsius'ta kuluçka yapın. Ertesi gün, steril bir tahta çubuk veya pipet ucu kullanarak, burgu plakasından tek bir koloni seçin. Koloniyi 3 mililitre LB çorbasına aşılayın ve kültürü 37 derece Celsius'ta 200 devir/dakika hızla gece boyunca kuluçka yapın.

Sonra gece kültüründe 1 mililitre LB çorbasında 1 ila 10 seyreltme işlemi yapıldı. Seyreltilmiş kültürün optik yoğunluğunu spektrofotometre kullanarak 600 nanometre ölçün. Gece kültüründen 100 mikrolitre 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 6.000 G'de 4 derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj yapın.

Süpernatantı hücre pelletini rahatsız etmeden dikkatlice aspire edin ve pelleti 1 mililitre serum ve antibiyotik-antimikotiksiz ortamda yeniden askıya alın. Verilen formülü kullanarak enfeksiyon çokluğu veya MOI 10 elde etmek için gerekli bakteri süspansiyon hacmini hesaplayın. Enfeksiyon ortamını hazırlamak için, hesaplanan bakteri süspansiyon hacmi steril 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tübüne aktarılır ve hacmi serum ile antibiyotik-antimikotiksiz ortamla 1 mililitre kadar doldurur.

Nazikçe pipetle birkaç kez yukarı aşağı karıştırın. Steril 1X PBS ile on kat seri seyreltme uygulayarak gece boyunca seyreltilmiş bakteri kültürünün mililitre başına koloni oluşum birimlerini belirlemek için 96 delikli bir plaka hazırlayın. Gece boyunca seyreltilmiş kültürden 200 mikrolitre tabakanın ilk kuyusuna aktarın.

20 mikrolitre kültürü bir sonraki sıraya 180 mikrolitre 1X PBS içeren pipetleyin. 10 kez pipetle yukarı ve aşağı karıştırın ve her seferinde yeni bir pipet ucu kullanarak 10'a kadar 6'ya kadar seyreltme işlemini tekrarlayın. Şimdi 10 mikrolitre spot seyreltme üçlü olarak 10'dan 2 ile 10 gücüne ve 6 seyreltme gücüne LB burgu plakalarına yerleştirin.

Lekelerin alev yakınındaki burgu içine emmesine izin verin. Koloni aşırı büyümesini önlemek ve net bireysel koloniler elde etmek için plakaları gece boyunca 27 ila 30 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka edin. Sağlıklı birleşen Caco-2 epitel hücresi monokatmanlarını, kollajen kaplı 24 kuyu kültür plakasında kültürlendirilmiş inkubatörden çıkarın ve her kuyunun tüm ortamını aspire edin.

Her kuyuya bir mililitre serum ve antibiyotik-antimikotiksiz madde pipetleyin. Medya izlerini çıkarmak için ortamı aspire edin ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapın. Şimdi, Caco-2 hücrelerini içeren 24 kuyu plakasının her kuyusuna önceden hazırlanmış AIEC içeren enfeksiyon ortamından 1 mililitre ekleyin.

24 kuyu plakasını 500G ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjlenerek epitel monotabaka ile bakteriyel teması senkronize edin ve plakayı 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile üç saat boyunca inkübe yapın ki bakteriyel istila oluşsun. Önceden ısıtılmış serum ve antibiyotik-antimikotiksiz ortama mililitrede 240 mikrogram amikasin ekleyerek antibiyotik içeren ortam hazırlayın. Enfeksiyon döneminden sonra, Caco-2 hücre monokatmanlarından medya aspirasyonu alın ve her birini 1 mililitre serum ile antibiyotik-antimikotiksiz ortamla yıkayın.

Medyayı aspire edin ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapın. Sonra her kuyuya mililitrede 240 mikrogram amikasin içeren bir mililitre pipetleyin. Paralel olarak, karşılaştırma için mililitrede 100 mikrogram gentamisin içeren başka bir hücre seti işleyin ve hücreleri 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile 1 saat boyunca kuluçka yapın ki hücre dışı bakteriler yok edilsin.

Kuluçkadan sonra, her kuyunun ortamını aspire edin. Yapışkan bakterileri yıkamak için 1 mililitre PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapın.

Şimdi her kuyuya PBS ile seyreltilmiş 200 mikrolitre %1 Triton X100 ekleyin ve epitel hücrelerini lizize etmek için dakikada 90 devir hızında bir yörünge sallayıcısında 10 dakika kuluçka yapın. Hücreleri plakadan ayırmak için her kuyu başına yaklaşık 30 kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Sonra, PBS kullanarak 96 kuyuyla bir plakada hücre lizatlarının on kat seri seyreltilmesi gerçekleştirilir.

Plaka 10 mikrolitre spot seyreltme üçlü olarak seyreltilmemişten 3 seyreltme gücüne kadar LB burgu plakalarına ulaşır. Lekeler kuruduktan sonra, plakaları gece boyunca 27 ila 30 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka altına alın ve net bireysel koloniler elde edilir. Kuluçkadan sonra, plakaları çıkarın ve uygun nokta seyreltmelerinden iyi izole edilmiş kolonileri sayın; bu koloniler her noktada yedi koloniden fazla koloni içerir.

Son olarak, denklemleri kullanarak mililitre başına inokulum ve alınan koloni oluşum birimleri ile yüzde istilayı hesaplayın. Caco-2 hücre monokatmanlarının invaziv AIEC NRG857c stüşu veya invaziv olmayan Escherichia coli DH5 alfa kontrol suşuyla enfeksiyonunun ardından gentamisin veya amikasin ile yapılan tedavi, benzer invazion profillerine yol açtı. Bu bulgular, amikasinin hücre dışı bakterileri yok etmede gentamisin kadar etkili olduğunu ve hücre içi bakteri yükünü doğru şekilde yansıttığını gösterdi.

Gentamisin ile inflamatuar bağırsak hastalığı olan hastalardan elde edilen gentamisin dirençli klinik Escherichia coli izolatlarının tedavisi, yaklaşık %21 ile %2,788 arasında değişen yüksek değişkenlikli bakteriyel iyileşme değerleri sağladı; buna karşılık, amikasin tedavisi tüm izolatlarda bakteriyel iyileşmeyi önemli ölçüde azalttı, etkinliğini gösterdi ve daha güvenilir istila ölçümlerini mümkün kıldı. Bu protokol, hücre içi bakterilerin doğru şekilde nicelenmesini ve epitel hücrelerinde bakteri istilasının değerlendirilmesini sağlar. İmmünofluoresans mikroskopisi gibi ek yöntemler, bakteriyel invaziyanı daha doğrulamak ve hücre içi lokalizasyonu doğrulamak için kullanılabilir.

Gelecekteki çalışmalar, yeni virülans faktörlerini belirleyebilir ve yapışkan inzivaziv E.coli enfeksiyonu sırasında hedef alınan konak yollarını inceleyebilir.