Name: Boncuk Tabanlı Aktin Kuyruk Motilitesi Deneyinde Miyozin-I Aracılı Dallanmış Aktin Düzenlenmesinin Yeniden Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin, boncuk tabanlı aktin kuyruk motilitesi deneyinde miyozin-I aracılı dallanmış aktin düzenlenmesini yeniden oluşturmayı. Bu yöntem, sitoskelet dinamiklerini nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Protein saflaştırma konusundaki mükemmel teknik yardımları için Dr. Daniel Safer ve Rick Wike'a teşekkür ederiz. Arp2/3 kompleksi ve CapZ proteinlerini cömertçe sağladıkları için Dr. Roberto Dominguez'e, özellikle Dr. Malgorzata Boczkowska ve Dr. Grzegorz Rebowski'ye teşekkür ederiz. Ayrıca, proje boyunca değerli katkıları için Dr. Luther Pollard'a, Dr. Faviolla A. Báez-Cruz'a ve Ostap ile Dominguez laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, National Institutes of Health grant R37 GM057247 (E.M.O.'ya) tarafından desteklenmiştir. E.M.O. ve M.X. kısmen National Science Foundation (CMMI-1548571) tarafından desteklenmiştir. Taslak revizyonu sırasında dil düzenlemesine yardımcı olmak için ChatGPT kullanılmıştır. Yazarlar, yapay zeka destekli tüm içeriği gözden geçirmiş, düzenlemiş ve nihai taslağın tüm sorumluluğunu üstlenmişlerdir.

<ol>
	<li>Blanchoin L, Boujemaa-Paterski R, Sykes C, Plastino J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 2014;94(1):235-63.</li>
	<li>Svitkina T. The actin cytoskeleton and actin-based motility. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(1).</li>
	<li>Papalazarou V, Machesky LM. The cell pushes back: The Arp2/3 complex is a key orchestrator of cellular responses to environmental forces. Curr Opin Cell Biol. 2021;68:37-44.</li>
	<li>Krendel M, Gauthier NC. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 2022;77:102112.</li>
	<li>Yang C, et al. Actin polymerization promotes invagination of flat clathrin-coated lattices in mammalian cells by pushing at lattice edges. Nat Commun. 2022;13(1):6127.</li>
	<li>Clarke DN, Martin AC. Actin-based force generation and cell adhesion in tissue morphogenesis. Curr Biol. 2021;31(10):R667-R80.</li>
	<li>McConnell RE, Tyska MJ. Leveraging the membrane-cytoskeleton interface with myosin-1. Trends Cell Biol. 2010;20(7):418-26.</li>
	<li>Almeida CG, et al. Myosin 1b promotes the formation of post-Golgi carriers by regulating actin assembly and membrane remodelling at the trans-Golgi network. Nat Cell Biol. 2011;13(7):779-89.</li>
	<li>McIntosh BB, Ostap EM. Myosin-I molecular motors at a glance. J Cell Sci. 2016;129(14):2689-95.</li>
	<li>Pedersen RTA, Drubin DG. Type I myosins anchor actin assembly to the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis. J Cell Biol. 2019;218(4):1138-47.</li>
	<li>Barger SR, et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 2019;10(1):1249.</li>
	<li>Manenschijn HE, et al. Type-I myosins promote actin polymerization to drive membrane bending in endocytosis. eLife. 2019;8.</li>
	<li>Smith SL, et al. Class-I myosin responds to changes in membrane tension during clathrin-mediated endocytosis in human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026;123(9):e2532817123.</li>
	<li>Loisel TP, Boujemaa R, Pantaloni D, Carlier MF. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 1999;401(6753):613-6.</li>
	<li>Akin O, Mullins RD. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 2008;133(5):841-51.</li>
	<li>Boujemaa-Paterski R, et al. Directed actin assembly and motility. Methods Enzymol. 2014;540:283-300.</li>
	<li>Sykes C, Plastino J. Reconstitution of actin-based motility with commercially available proteins. J Vis Exp. 2022;(188).</li>
	<li>Xu M, et al. Myosin-I synergizes with Arp2/3 complex to enhance the pushing forces of branched actin networks. Sci Adv. 2024;10(37):eado5788.</li>
	<li>Kawska A, et al. How actin network dynamics control the onset of actin-based motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(36):14440-5.</li>
	<li>Cameron LA, Footer MJ, van Oudenaarden A, Theriot JA. Motility of ActA protein-coated microspheres driven by actin polymerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):4908-13.</li>
	<li>Bernheim-Groswasser A, et al. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 2002;417(6886):308-11.</li>
	<li>van der Gucht J, Paluch E, Plastino J, Sykes C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(22):7847-52.</li>
	<li>Achard V, et al. A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Curr Biol. 2010;20(5):423-8.</li>
	<li>Noireaux V, et al. Growing an actin gel on spherical surfaces. Biophys J. 2000;78(3):1643-54.</li>
	<li>Theriot JA, Mitchison TJ, Tilney LG, Portnoy DA. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature. 1992;357(6375):257-60.</li>
	<li>Bieling P, et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. EMBO J. 2018;37(1):102-21.</li>
	<li>Funk J, et al. A barbed end interference mechanism reveals how capping protein promotes nucleation in branched actin networks. Nat Commun. 2021;12(1):5329.</li>
	<li>Gautreau AM, Fregoso FE, Simanov G, Dominguez R. Nucleation, stabilization, and disassembly of branched actin networks. Trends Cell Biol. 2022;32(5):421-32.</li>
	<li>Nakamura F, Osborn E, Janmey PA, Stossel TP. Comparison of filamin A-induced cross-linking and Arp2/3 complex-mediated branching on the mechanics of actin filaments. J Biol Chem. 2002;277(11):9148-54.</li>
	<li>Colin A, et al. Friction patterns guide actin network contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(39):e2300416120.</li>
	<li>Colin A, et al. Recycling of the actin monomer pool limits the lifetime of network turnover. EMBO J. 2023;42(9):e112717.</li>
	<li>Suarez C, et al. Reconstitution of the transition from a lamellipodia- to filopodia-like actin network with purified proteins. Eur J Cell Biol. 2023;102(4):151367.</li>
	<li>Pollard LW, Boczkowska M, Dominguez R, Ostap EM. Myosin-1C differentially displaces tropomyosin isoforms altering their inhibition of motility. J Biol Chem. 2024;300(8):107539.</li>
	<li>Thompson CP, et al. Non-muscle tropomyosins inhibit myosin-19 and dynamically localize to mitochondrially associated actin filaments. J Biol Chem. 2026;302(5):111377.</li>
	<li>Bussonnier M, et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophys J. 2014;107(4):854-62.</li>
	<li>Paluch E, van der Gucht J, Joanny JF, Sykes C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophys J. 2006;91(8):3113-22.</li>
	<li>Lewis JH, Lin T, Hokanson DE, Ostap EM. Temperature dependence of nucleotide association and kinetic characterization of Myo1b. Biochemistry. 2006;45(38):11589-97.</li>
	<li>Baez-Cruz FA, Ostap EM. Drosophila class-I myosins that can impact left-right asymmetry have distinct ATPase kinetics. J Biol Chem. 2023;299(8):104961.</li>
	<li>Lin T, Tang N, Ostap EM. Biochemical and motile properties of Myo1b splice isoforms. J Biol Chem. 2005;280(50):41562-7.</li>
	<li>Lebreton G, et al. Molecular to organismal chirality is induced by the conserved myosin 1D. Science. 2018;362(6417):949-52.</li>
	<li>Spudich JA, Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J Biol Chem. 1971;246(15):4866-71.</li>
	<li>Boczkowska M, et al. X-ray scattering study of activated Arp2/3 complex with bound actin-WCA. Structure. 2008;16(5):695-704.</li>
	<li>Rao JN, Madasu Y, Dominguez R. Mechanism of actin filament pointed-end capping by tropomodulin. Science. 2014;345(6195):463-7.</li>
	<li>Putkey JA, Slaughter GR, Means AR. Bacterial expression and characterization of proteins derived from the chicken calmodulin cDNA and a calmodulin processed gene. J Biol Chem. 1985;260(8):4704-12.</li>
	<li>Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676-82.</li>
	<li>Greenberg MJ, Ostap EM. Regulation and control of myosin-I by the motor and light chain-binding domains. Trends Cell Biol. 2013;23(2):81-9.</li>
	<li>Lewis JH, et al. Calcium regulation of myosin-I tension sensing. Biophys J. 2012;102(12):2799-807.</li>
	<li>Manceva S, et al. Calcium regulation of calmodulin binding to and dissociation from the Myo1c regulatory domain. Biochemistry. 2007;46(42):11718-26.</li>
	<li>Mullins RD, Bieling P, Fletcher DA. From solution to surface to filament: actin flux into branched networks. Biophys Rev. 2018;10(6):1537-51.</li>
	<li>Mooren OL, et al. Reconstitution of Arp2/3-nucleated actin assembly with proteins CP, V-1, and CARMIL. Curr Biol. 2024;34(22):5173-86.e4.</li>
	<li>Pollard LW, et al. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Mol Biol Cell. 2020;31(5):335-47.</li>
	<li>Marcy Y, Prost J, Carlier MF, Sykes C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(16):5992-7.</li>
	<li>Dayel MJ, et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biol. 2009;7(9):e1000201.</li>
	<li>Hammer JA 3rd, Sellers JR. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;13(1):13-26.</li>
	<li>Buss F, Kendrick-Jones J. How are the cellular functions of myosin VI regulated within the cell. Biochem Biophys Res Commun. 2008;369(1):165-75.</li>
	<li>Spudich JA, Sivaramakrishnan S. Myosin VI: an innovative motor that challenged the swinging lever arm hypothesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(2):128-37.</li>
	<li>Self T, et al. Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of cochlear hair cells. Development. 1998;125(4):557-66.</li>
	<li>Crawley SW, et al. Intestinal brush border assembly driven by protocadherin-based intermicrovillar adhesion. Cell. 2014;157(2):433-46.</li>
	<li>Houdusse A, Titus MA. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 2021;31(10):R586-R602.</li>
	<li>Bohil AB, Robertson BW, Cheney RE. Myosin-X is a molecular motor that functions in filopodia formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(33):12411-6.</li>
	<li>Fitz GN, et al. Protrusion growth driven by myosin-generated force. Dev Cell. 2023;58(1):18-33.</li>
	<li>Quintero OA, et al. Human Myo19 is a novel myosin that associates with mitochondria. Curr Biol. 2009;19(23):2008-13.</li>
	<li>Zimmet A, et al. Cryo-EM structure of NPF-bound human Arp2/3 complex and activation mechanism. Sci Adv. 2020;6(23):eaaz7651.</li>
	<li>Giardini PA, Fletcher DA, Theriot JA. Compression forces generated by actin comet tails on lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(11):6493-8.</li>
	<li>Upadhyaya A, Chabot JR, Andreeva A, Samadani A, van Oudenaarden A. Probing polymerization forces by using actin-propelled lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(8):4521-6.</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkar veya çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Aktin kuyruklu yıldız boncuk hareketliliği deneyi, Arp2/3 kompleksi aracılı dallanmış aktin montajını ve bunun itici kuvvetler oluşturmadaki rolünü incelemek için iyi tanımlanmış bir in vitro yeniden yapılandırma sistemidir14,15,16,17. Bu sistem, dallanmış aktin montajının biyokimyasal düzenlemesini14,15,26,27,31,49,50,51 ve kuvvet üretimini20,21,22,23,52 çözümlemek için yaygın olarak uygulanmış, aynı zamanda aktin ağlarının ortaya çıkan aktif madde özelliklerinin kantitatif çalışmaları için bir çerçeve sağlamıştır19,35,36,53. Bu yeniden yapılandırılmış sisteme miyozinin, özellikle miyozin-I'in18 dahil edilmesiyle modifiye edilen deney, miyozin-aktin etkileşiminin membran arayüzündeki aktin montajını ve kuvvet üretimini nasıl modüle ettiğinin incelenmesine olanak tanır ki bu alan nispeten az araştırılmıştır. Özellikle, bu sistemdeki miyozin-I, aktin ağı yeniden şekillenmesi ve kuvvet üretimindeki rollerini incelemek amacıyla diğer miyozin motorları ile kolayca değiştirilebilir. Örneğin, farklı miyozin sınıflarının aktin organizasyonuna ve ilgili fizyolojik süreçlere nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için miyozin V (kargo taşınımı)54, miyozin VI (endositik trafik ve membran dinamiği)55,56, miyozin VII ve XV (stereosilya ve mikrovillüs organizasyonu)57,58,59, miyozin X (filopodyum oluşumu)60,61 ve miyozin XIX (mitokondriyal dinamikler)62 sisteme dahil edilebilir.
Birkaç kritik parametrenin dikkatle kontrol edilmesi şartıyla, assay yüksek düzeyde tekrarlanabilirdir. İlk olarak, güçlü kuyruklu yıldız (comet-tail) oluşumu için yüksek kaliteli monomerik G-aktin esastır. G-aktinin, yerleşik protokoller41 kullanılarak tavşan iskelet kası aseton tozundan saflaştırılmasını öneririz. 2–3 günlük diyalizden sonra, monomerik aktin, G-tamponunda (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; ve 0.5 mM DTT) Sephacryl S-300 ile jel filtrasyonu yoluyla daha da saflaştırılmalıdır. Elüsyon zirvesinin hemen ardından toplanan fraksiyonlar kullanılmalıdır. Saflaştırılmış G-aktin, 4°C'de buz üzerinde saklandığında tipik olarak 2–3 hafta boyunca güçlü polimerizasyon aktivitesini korur ve dördüncü haftaya kadar kullanılabilir kalabilir, ancak performans genellikle bundan sonra azalır. Seyrek, kırılgan aktin ağları ve tutarsız kuyruk büyümesi ile karakterize edilen azalmış kuyruklu yıldız sağlamlığı, genellikle bozulmuş aktin kalitesine işaret eder. İkinci olarak, NPF aktivitesi kuyruklu yıldız oluşumunu kritik düzeyde belirler. İnsan nöronal Wiskott–Aldrich sendromu proteininden (N-WASP) elde edilen ticari GST-etiketli WCA domaini (GST-VCA), güçlü ve sürdürülebilir bir nükleasyon aktivitesi sağlar ve GST dimerizasyonu bu aktiviteyi daha da artırır63. Boncuk kaplamasından önce, herhangi bir NPF konstrüktünün piren-aktin polimerizasyon assay'i ile doğrulanmasını öneririz. Ticari GST-VCA'nın aktivitesi bir referans standart olarak hizmet edebilir. Özellikle, burada kullanılan ticari GST-VCA, poliprolin bölgesinden yoksundur ve bu nedenle profilin–aktin kompleksleri ile etkileşime girmez26. Üçüncü olarak, kuyruklu yıldız büyümesinin güvenilir şekilde görüntülenmesi, dikkatli lam ve lamel hazırlığı gerektirir. Lam ve lamellerin su ve etanolle iyice temizlenmesini, ardından kullanımdan hemen önce plazma temizliği yapılmasını öneririz. Mevcut olduğunda, spesifik olmayan protein adsorpsiyonunu minimize ettikleri ve tekrarlanabilirliği artırdıkları için polietilen glikol–silanize lameller26 tercih edilir. Motilite karışımına yeterli konsantrasyonda BSA eklenmesi, spesifik olmayan yüzey etkileşimlerini daha da azaltabilir ve tutarlı assay performansını destekleyebilir. Dördüncü olarak, hazneye uygulanan örnek hacmi, güvenilir ölçümler için kritiktir15,16,17. Aşırı örnek hacmi, boncukların sürüklenmesine neden olarak kuyruklu yıldız uzamasının doğru şekilde izlenmesini engeller. Buna karşılık, yetersiz örnek hacmi boncukları lam ile lamel arasında sıkıştırarak sürtünmeyi artırır ve boncukları immobilize eder. Bu mekanik kısıtlama, kuyruklu yıldız morfolojisini bozabilir ve ölçülen büyüme kinetiğini değiştirebilir. Bu nedenle, tekrarlanabilir sonuçlar için hem hazne yüksekliğinin hem de örnek hacminin optimize edilmesi esastır. Her deneysel düzenek için örnek hacminin ampirik olarak optimize edilmesini öneririz. Burada açıklandığı gibi 22 mm × 22 mm'lik bir lamel kullanıldığında, 2.1–2.3 µL motilite karışımının uygulanması yaklaşık 4.3 µm'lik bir hazne yüksekliği oluşturur ve aşırı sürüklenme veya sıkışma olmadan 2.0-µm çapındaki boncukların stabil konumlanmasını sağlar.&#160;Farklı boyutta bir lamel kullanıldığında; eşit hazne dolumu, stabil boncuk konumlanması ve minimum örnek sürüklenmesi elde etmek için örnek hacmi buna göre ayarlanmalıdır.
Kuyruklu yıldız kuyrukları oluşmazsa, aktin polimerizasyon yeterliliğini ve NPF aktivitesini doğrulayın. Simetri kırılması gerçekleşmezse, ağ yoğunluğunu düzenlemek için CP konsantrasyonunu ayarlayın. Aşırı yoğun ağlar kırılmaya direnç gösterirken, çok seyrek ağlar yapısal bütünlükten yoksundur. Miyozin kaplı boncuklar kontrol boncuklarından farklılık göstermezse, miyozin yüzey yoğunluğunu ve motor aktivitesini teyit edin. Kalite kontrol için kabul kriteri, mutlak bir sayısal eşikten ziyade fonksiyonel temellidir. Yeni bir hazırlık, önceden doğrulanmış bir hazırlıkla gözlemlenen kuyruklu yıldız kuyruğu oluşumunu ve büyümesini (&#160;Şekil 3'te gösterildiği gibi) yeniden oluşturuyorsa&#160;kabul edilebilir sayılır. Ayrıca, miyozin, Arp2/3 kompleksi, NPF, CapZ veya aktinin her yeni hazırlığı, nicel deneyler arasında tutarlılığı sağlamak için kullanım öncesinde uygun kalite kontrol analizleri kullanılarak değerlendirilmeli ve önceden doğrulanmış bir hazırlıkla karşılaştırılmalıdır (bakınız Protokol bölüm 3.1).
Sonuçlar yorumlanırken bu deneyin birkaç sınırlaması göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, floresans yoğunluğu, aktin ağ yoğunluğu için göreceli ve kalibre edilmemiş bir vekil parametre olarak kullanılır; bu nedenle karşılaştırmalar yalnızca özdeş görüntüleme ayarları altında görüntülenen ve aynı eşikleme iş akışı kullanılarak analiz edilen örnekler arasında yapılmalıdır. İkinci olarak, boncuk hareketliliği, kuyruk büyümesi ve büyüme verimliliği, kuvvet üreten ağ davranışının dolaylı okumalarını sağlar ancak kuvvetin doğrudan ölçümlerini oluşturmaz. Ağ tarafından üretilen kuvvetleri nicelleştirmek için optik tuzaklama veya kuvvetle kalibre edilmiş membran deformasyon deneyleri64,65 gibi doğrudan mekanik ölçümler gereklidir. Üçüncü olarak, bu deney aktin ağı ultrastrüktürünü, örneğin filaman oryantasyonunu, dal yoğunluğunu veya yerel miyozin organizasyonunu doğrudan çözümlemez.&#160;Nanoscale yapı&#160;karakterizasyonu için elektron mikroskopisi veya süper çözünürlüklü görüntüleme gibi tamamlayıcı yaklaşımlar gerekebilir. Son olarak, sert mikron boyutundaki boncukların kullanımı, basitleştirilmiş ve deneysel olarak yönetilebilir bir arayüz sağlar ancak hücresel membranların deforme olabilirliğini, eğrilik heterojenliğini, lipid hareketliliğini veya moleküler karmaşıklığını yansıtmaz. Bu nedenle, sitoiskelet bileşenlerinin hücre ön kenarında nasıl koordine olduğunun araştırılması için fizyolojik olarak daha ilgili arayüzlerin gelecekte geliştirilmesi önemli olacaktır.
Genel olarak, bu yeniden oluşturma yaklaşımı, protein kompozisyonu ve konsantrasyonu üzerinde hassas kontrol sağlayarak, tekil bileşenlerin hücresel sistemlerde başarılması zor olan yöntemlerle mekanistik olarak analiz edilmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, moleküler motorların dallanmış aktin ağlarını nasıl yeniden şekillendirdiğini ve membran benzeri arayüzlerde kuvvet üretimini nasıl yönlendirdiğini incelemek için çok yönlü bir platform sunar. Uygun doğrulama işlemleriyle bu analiz, farklı miyozin sınıflarının, mutant veya hastalıkla ilişkili motor varyantlarının ve kuvvete duyarlı aktin bağlayıcı proteinlerin dinamik aktin ağları içindeki mekanik geri bildirimi nasıl düzenlediğini incelemek için genişletilebilir. Daha geniş açıdan bu sistem, moleküler ölçekli motor aktivitesini mezölçekli sitoskeletal organizasyon ve mekanik işlevle ilişkilendirmeye yardımcı olur; bu da hücre hareketliliği, endositoz ve membran yeniden şekillenmesi için önemli çıkarımlar sunar.

Aktinle ilişkili protein 2/3 (Arp2/3) kompleksi tarafından yönetilen dallanmış aktin polimerizasyonu; hücre hareketliliği, endositoz, fagositoz ve hücre adezyon komplekslerinin oluşumu dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçleri yönlendiren temel itici kuvvetleri oluşturur1,2,3,4,5,6. Göç eden hücrelerin ön kenarında, nükleasyonu teşvik eden faktörler (NPF'ler), plazma membranında Arp2/3 kompleksini aktive ederek membranı ileriye iten dendritik aktin ağı montajını başlatır. Miyozin-I motorları, membran arayüzlerinde bu dallanmış aktin ağları ile sıklıkla kolokalize olur ve &#160;aktin organizasyonunun&#160;düzenlenmesinde ve kuvvet üretiminin modüle edilmesinde rol oynadıkları belirtilmiştir7,8,9,10,11,12,13. Miyozin-I'nin aktine bağlı mekanik süreçlere katkıda bulunduğuna dair kanıtlar birikmesine rağmen, miyozin-I'nin ağ mimarisini ve mekanik çıktıyı modüle etmek için Arp2/3 aracılı dallanmış aktin montajı ile etkileşime girdiği moleküler mekanizmalar henüz yeterince anlaşılamamıştır.
Bu boşluğu gidermek için, myosin-I'i, mikron boyutundaki boncukların yüzeyinde myosin-I, aktin ve Arp2/3 kompleksi arasındaki etkileşimi yeniden oluşturmak amacıyla, iyi bilinen aktin kuyruk benzeri (comet-tail) boncuk hareketliliği sistemine14,15,16,17 entegre ettik. Bu yöntemin genel amacı; myosin-aktin eşleşmesinin, membran benzeri bir arayüzde dallanmış aktin montajını, ağ mimarisini, simetri bozulmasını ve boncuk hareketliliğini nasıl etkilediğini kantitatif olarak incelemektir. Bu analizde, plazma membranındaki kolokalizasyonlarını taklit etmek için myosin-I ve NPF'ler mikro ölçekli boncukların üzerine birlikte kaplanmaktadır18. Polimerizasyonun başlamasıyla birlikte, yüzeye bağlı NPF'ler Arp2/3 bağımlı dallanmış aktin montajını stimüle ederek aktin kabuğu oluşumuna, simetri bozulmasına ve boncuk itkisini sağlayan polarize bir kuyruk gelişmesine&#160;yol açar14,19,20,21,22,23. Myosin yüzey yoğunluğunun sistematik olarak değiştirilmesiyle18 ve capping protein (CP) konsantrasyonu aracılığıyla aktin ağ yoğunluğunun modüle edilmesiyle15,19,24, bu yöntem; aktin montaj kinetiğinin, büyüme verimliliğinin, ağ mimarisinin ve boncuk hareketliliğinin kantitatif analizine olanak tanıyarak myosin-I bağımlı mekanik çıktı değişikliklerine ilişkin dolaylı veriler sağlar.
Bu analiz yöntemi, tamamlayıcı yaklaşımlara kıyasla belirgin avantajlar da sunmaktadır. Pyrene-aktin analizleri gibi dökme polimerizasyon analizleri ile karşılaştırıldığında, bu boncuk hareketliliği sistemi, dallanmış aktin montajının ve aktin polimerizasyonu kaynaklı boncuk hareketinin doğrudan görselleştirilmesine olanak tanır. Üst üste binen protein işlevlerinin ve karmaşık hücresel ortamların bireysel katkıları gölgeleyebildiği ve yorumlamayı zorlaştırabildiği hücresel çalışmaların aksine, bu analiz yöntemi; protein kompozisyonu, konsantrasyonu ve yüzey organizasyonu üzerinde hassas kontrol sağlayarak, myosin-I'in tanımlanmış biyokimyasal koşullar altında Arp2/3 aracılı aktin montajı ile nasıl etkileşime girdiğinin sistematik olarak incelenmesini mümkün kılar.
Bu yöntem, aktin ağ mimarisini ve mekanik çıktıyı düzenlemek için hücre iskeleti bileşenlerinin membran benzeri bir&#160;arayüzde nasıl koordine olduğunu incelemek için en uygunudur. Mevcut protokol myosin-I aracılı dallanmış aktin montajı için optimize edilmiş olsa da, modüler tasarımı gelecekte diğer membrana ilişkili myosin sınıflarını (örneğin, myosin VI, VII, X, XV ve XIX) ve/veya aktine bağlanan proteinleri (örneğin, forminler, vazodilatörle stimüle edilen fosfoprotein (VASP), kortaktin, koronin veya tropomyosin) incelemek için uyarlanabilir. Bu tür uyarlamalar; protein immobilizasyonunun, aktivitesinin ve yüzey yoğunluğunun doğrulanmasını gerektirecektir. Ek olarak, analiz pulse-chase etiketleme stratejilerine uygundur. Fotokonvertibl veya fotoaktive edilebilir aktinin veya etiketli Arp2/3 alt birimlerinin dahil edilmesi, büyüyen ağ içindeki filament döngüsü ve dal dissociate oranlarının ölçülmesini sağlayabilir25. Genel olarak bu analiz, membrana ilişkili motorlar, aktin filamentleri ve aktine bağlanan proteinler arasındaki moleküler etkileşimi incelemek ve ayrıca motorların ile aktine bağlanan proteinlerin membran benzeri arayüzlerde ağ yeniden şekillenmesini ve kuvvet üretimini nasıl düzenlediğini araştırmak için çok yönlü bir platform sunar14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Daha geniş kapsamda, aktif actomyosin ağlarındaki simetri kırılması, kendi kendine organizasyon, mekanokimyasal geri besleme ve diğer belirgin davranışlar gibi motor kaynaklı dengedışı dinamiklerin temelindeki fiziksel ilkeleri araştırmak için aktif madde fiziği ve malzeme mühendisliği ile potansiyel ilgisi olan minimal, ayarlanabilir bir aktif madde platformu olarak da hizmet eder18,19,20,21,22,23,35,36.

<table><tbody><tr><td>Adenozin 5&amp;prime;-trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>ATP içeren tamponların hazırlanmasında kullanılır; alikotlara ayrılarak &amp;minus;20&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Arp2/3 kompleksi</td><td>Kurum içi hazırlandı</td><td>N/A</td><td>Dallanmış aktin ağlarını nüklelemek için kullanılır; Ref. 42'ye göre saflaştırılmıştır.</td></tr><tr><td>Biyotin-CF640 floresan boya</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Kontrol boncuklarını floresanla işaretlemek için kullanılır; ışıktan korunmalı ve &amp;minus;80&amp;deg;C'de saklanmalıdır.</td></tr><tr><td>Biyotinile Myo1d</td><td>Kurum içi hazırlandı</td><td>N/A</td><td>Miyozin kaplı boncukları dekore etmek için kullanılan motor protein; Ref. 18 ve 38&amp;ndash;40'ta açıklandığı gibi hazırlanmıştır.</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Boncuk bloklama ve boncuk saklama tamponları için kullanılır; filtrelenmiş bir stok çözelti hazırlayın.</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>X tamponunda ve kalsiyum bozma deneylerinde kullanılan tampon bileşeni.</td></tr><tr><td>Kalmodulin</td><td>Kurum içi hazırlandı</td><td>N/A</td><td>Miyozin içeren reaksiyonlara ve boncuk saklama tamponuna eklenir; Ref. 44'e göre saflaştırılmıştır.</td></tr><tr><td>Karboksilat polistiren boncuklar (2,0 &amp;micro;m çapında)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>NPF, NeutrAvidin, floresan boya ve miyozin kaplama için katı destek olarak kullanılır; 4&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Time-lapse mikroskopi sırasında floresans görüntüleme için kullanılır.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue boyası</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Densitometrik analiz öncesinde SDS-PAGE jellerini boyamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Lamel, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Sıkıştırma hücrelerini oluşturmak için mikroskop lamlarıyla birlikte kullanılır.</td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Tamponlarda ve mobilite karışımlarında kullanılan indirgeyici ajan; &amp;minus;20&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Kuru scroll vakum pompası</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Plazma temizleme sistemini çalıştırmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>M tamponu, mobilite tamponu ve aktin ön işlemesinde kullanılan kalsiyum şelatörü.</td></tr><tr><td>Harici ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Floresans mikroskobu için metal halojenür ışık kaynağı.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Açık kaynak</td><td>N/A</td><td>Kuyruklu yıldız kuyruk uzunluğu, floresans yoğunluğu ve ağ yoğunluğu analizi için kullanılır (versiyon 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Floresans mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Aktin kuyruklu yıldız kuyruklarını görüntülemek için kullanılan ters epifloresans mikroskobu.</td></tr><tr><td>Buzul asetik asit</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>SDS-PAGE jel boya giderme çözeltisinin bileşeni; korozif olduğundan uygun önlemlerle kullanın.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Arp2/3 aracılı aktin montajı için kullanılan nükleasyon teşvik edici faktör; alikotlara ayrılarak &amp;minus;80&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>X tamponu, M tamponu ve mobilite tamponunda kullanılan tamponlama reaktifi.</td></tr><tr><td>İnsan CapZ</td><td>Kurum içi hazırlandı</td><td>N/A</td><td>Aktin ağ yoğunluğunu düzenlemek için kullanılan kapaklama proteini; Ref. 43'e göre saflaştırılmıştır.</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Reaksiyon tamponlarında ve aktin ön işlemesinde kullanılan tampon bileşeni.</td></tr><tr><td>MetaMorph görüntüleme yazılımı</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Mikroskop kontrolü ve görüntüleme için kullanılır (versiyon 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>SDS-PAGE jel boya giderme çözeltisinin bileşeni; yanıcıdır, kurum güvenlik prosedürlerine göre kullanın.</td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Çözelti viskozitesini artırmak için mobilite tamponuna eklenir (1500 cP).</td></tr><tr><td>Mikroskop lamları</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Mikroskopi için sıkıştırma hücreleri oluşturmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>NeutrAvidin proteini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Biyotinile proteinlerin boncuk yüzeylerine immobilizasyonu için kullanılır; alikotlara ayrılarak &amp;minus;80&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>SDS-PAGE analizi için kullanılan moleküler ağırlık markörü; &amp;minus;20&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Hücre montajı öncesinde mikroskop lamlarını ve lamellerini plazma ile temizlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Polietersülfon şırınga filtresi, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Sığır serum albümini stok çözeltisini alikotlara ayırmadan önce filtrelemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Analiz tamponlarında iyonik gücü korumak için kullanılan tuz.</td></tr><tr><td>Tavşan iskelet kası aktini</td><td>Kurum içi hazırlandı</td><td>N/A</td><td>Ref. 41'e göre saflaştırılmış ve aktin kuyruklu yıldız kuyruğu montaj analizleri için G-aktin olarak kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Boncuk hazırlama ve yıkama aşamalarında boncukları çöktürmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Döner tüp karıştırıcı (tezgah üstü rotatör)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Boncuk süspansiyonunu korumak için boncuk kaplama inkübasyonları sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Tris/Glisin/SDS yürütme tamponu (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>SDS-PAGE elektroforezi öncesinde 1&amp;times; olacak şekilde seyreltin.</td></tr><tr><td>Vakum gresi</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Floresans görüntüleme öncesinde sıkıştırma hücrelerini sızdırmaz hale getirmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>%4&amp;ndash;%20 gradyanlı SDS-poliakrilamid jel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Boncukla ilişkili proteinlerin SDS-PAGE analizi için kullanılır; 4&amp;deg;C'de saklanır.</td></tr></tbody></table>

boncuk tabanlı aktin kuyruk motilitesi deneyinde miyozin-i aracılı dallanmış aktin düzenlenmesinin yeniden oluşturulması

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

Aktinle ilişkili protein 2/3 (Arp2/3) kompleksi aracılığıyla gerçekleşen dallanmış aktin polimerizasyonu; hücre göçü, endositoz ve fagositoz dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için temel itme kuvvetlerini sağlar. Hücrenin ön kenarında dallanmış aktin ağlarıyla sıklıkla aynı bölgede bulunan Miyozin-I motorlarının da bu süreçlere katıldığı gösterilmiştir ve aktin ağı organizasyonunu ve mekanik çıktıyı düzenledikleri düşünülmektedir. Ancak, Miyozin-I'in dallanmış aktin montajını ve kuvvet üretimini modüle etmek için Arp2/3 kompleksi ile etkileşime girdiği moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, hücre ön kenarındaki Miyozin-I, aktin ve Arp2/3 kompleksi arasındaki etkileşimi mikron boyutundaki boncukların yüzeyinde yeniden oluşturan, yüksek düzeyde ayarlanabilir bir in vitro aktin kuyruklu yıldız boncuk hareketliliği deneyi tanımlıyoruz. Bu yöntem, Miyozin-I'i boncuk yüzeylerinde nükleasyon destekleyici faktörlerle (NPF'ler) birlikte immobilize ederek, böylece membran benzeri bir aktin montaj arayüzü oluşturarak, iyi tanımlanmış aktin kuyruklu yıldız deneylerinden uyarlanmıştır. Deney; aktin ağı montajının, ağ yoğunluğunun, boncuk hareketliliğinin ve büyüme verimliliğinin görselleştirilmesine ve kantitatif analizine olanak tanır. Ayrıca, dallanmış aktin ağlarında Miyozin-I aracılı kuvvet artışına dair dolaylı, kalitatif veriler sağlar. Bu protokol; membran benzeri arayüzlerde Miyozin-I tarafından düzenlenen aktin montajını incelemek için tekrarlanabilir bir platform sunan boncuk fonksiyonelleştirme, reaksiyon kurulumu, floresan görüntüleme, kantitatif görüntü analizi ve sorun giderme stratejilerini içermektedir.

Aktin kuyruklu yıldız boncuk hareketliliği deneyi, membranla ilişkili miyozin-I'nin membran çıkıntısını yönlendirmek için aktin polimerizasyonu ile koordineli çalıştığı senaryoları yeniden canlandırarak7,8,9,10,11,12,13, miyozin-I aktivitesinin hücre ön kenarında Arp2/3 kompleksi aracılı dallanmış aktin montajı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır. Miyozin-I ve NPF'lerin membran-aktin arayüzündeki kolokalizasyonunu taklit etmek için her iki protein de mikro ölçekli boncukların yüzeyine birlikte kaplanmış ve böylece kontrollü bir in vitro sistemde mekânsal yakınlıkları yeniden kurulmuştur (Şekil 1A,B).
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Şekil 1. Mikroölçekli boncuklar üzerinde miyozin-I aracılı dallanmış aktin montajının yeniden oluşturulması. (A) Hücre ön kenarında miyozin-I, nükleasyon destekleyici faktörler (NPF'ler), aktinle ilişkili protein 2/3 (Arp2/3) kompleksi, kapaklama proteini (CP) ve globüler aktin (G-aktin) arasındaki etkileşimleri gösteren şematik. (B) Boncuk fonksiyonelleştirme şematiği. Kontrol boncukları ve miyozin kaplı boncuklar NPF ve neutravidin ile kaplanmıştır. Neutravidin, kontrol boncukları için biyotinli uzak-kırmızı floresan boyaya veya miyozin kaplı boncuklar için biyotinli Drosophila Myo1d'ye konjuge edilmiştir. (C) Bir kontrol boncuğu ve bir miyozin kaplı boncuk için simetri kırılmasından polarize kuyruklu yıldız kuyruğu oluşumuna kadar aktin kuyruklu yıldız kuyruğu büyümesini gösteren temsili zaman serisi. Son panel, her iki boncuğu aynı görüş alanında göstermektedir. Ölçek çubuğu, 5 µm. B ve C panelleri Xu ve ark., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS'dan izinle yeniden üretilmiş/düzenlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Miyozin-I'nin aktin montajına olan spesifik katkısını daha iyi değerlendirmek için, buna karşılık gelen bir kontrol boncuğu da oluşturulmuştur. Kontrol boncukları, miyozin-I'nin yerini neutravidine konjuge biyotinize uzak-kırmızı floresan boyanın alması dışında, miyozin kaplı boncuklarla aynıdır (Şekil 1B). Her iki boncuk türünün aynı reaksiyon odasında karıştırılması ve aynı görüş alanında görüntülenmesi, dallanmış aktin montajının özdeş deneysel koşullar altında miyozin-I varlığında ve yokluğunda doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlamıştır (Şekil 1C). Ayrıca, boncuk yüzeyindeki miyozin-NPF oranı değiştirilerek, miyozin-I'nin farklı yüzey yoğunluklarındaki etkisi sistematik olarak incelenebilmiştir (Şekil 2A,B). Ek olarak, CP konsantrasyonu ayarlanarak aktin ağı yoğunluğu optimize edilmiş; böylece yoğun paketlenmiş, simetri kırılmasına dirençli yapılardan, gevşek organize olmuş ve kırılmaya eğilimli mimarilere kadar değişen ağlar oluşturulmuştur15,19,24. Bu yaklaşım, miyozin-I'nin farklı yoğunluk ve yapısal bütünlüğe sahip ağlarda dallanmış aktin montajını nasıl etkilediğinin araştırılmasına imkan tanımıştır (Şekil 2A,B).
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Şekil 2. Farklı miyozin yüzey yoğunlukları ve capping proteini konsantrasyonlarında aktin kuyruklu yıldız morfolojisi&#160;. (A) Farklı miyozin yüzey yoğunluklarıyla kaplanmış ve 30–200 nM capping proteini (CP), %5 rhodamine işaretli aktin içeren 4 µM aktin ve 200 nM Arp2/3&#160;kompleksi içeren reaksiyonlarda birleştirilmiş 2-µm çaplı boncukların temsilci floresan görüntüleri. Her koşul için, kontrol boncukları ve miyozinle kaplanmış boncuklar aynı görüş alanında görüntülenmiştir. Miyozin ve nükleasyon teşvik edici faktör (NPF) yüzey yoğunlukları, Adım 2.3'te açıklandığı gibi sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel elektroforezi ile belirlenmiştir. Görüntüler reaksiyon başlangıcından 20–35 dk sonra alınmıştır. Parlaklık ve kontrast, her kontrol–miyozin boncuk çifti içinde doğrusal ve özdeş olarak ayarlanmış, ancak daha iyi görselleştirme için koşullar arasında bağımsız olarak ölçeklendirilmiştir. Ölçek çubuğu, 5 µm. (B) CP konsantrasyonları ve miyozin yüzey yoğunlukları genelindeki kuyruklu yıldız sonuçlarını özetleyen kalitatif analiz haritası. Her veri noktası, belirtilen koşul altındaki eşleşmiş bir kontrol–miyozin boncuk çiftini temsil eder. Semboller; simetri kırılmasını teşvik eden miyozinle kaplı boncuklar, daha uzun kuyruklar, benzer kuyruklar, daha kısa kuyruklar, kuyruklu yıldız oluşmaması veya aster benzeri yapılar dahil olmak üzere gözlemlenen sonuçları belirtir. Veriler, her koşul için 10'dan fazla boncuk çiftinin analiz edildiği 20'den fazla bağımsız deneyden toplanmıştır. Bu şekil, izinle Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS'den yeniden üretilmiş/düzenlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
Analiz bileşenleri karıştırıldığında, yüzeye bağlı NPF'ler boncuk yüzeyi çevresinde Arp2/3 kompleksi aracılı dallanmış aktin montajını stimüle etti. Tipik ve başarılı bir reaksiyonda aktin, ilk olarak boncuğu çevreleyen seyrek bir kabuk şeklinde görüldü. Polimerizasyon ilerledikçe kabuk genişledi ve ağ daha yoğun şekilde birbirine dolandı. Boncuk yüzeyindeki sürekli aktin montajı, dışa doğru ağ büyümesini tetikledi; bu durum simetri kırılmasına ve polarize bir kuyruklu yıldız kuyruğu oluşumuna yol açabiliyordu. Bir kuyruklu yıldız kuyruğu oluştuktan sonra, boncuk yüzeyindeki süregelen aktin nükleasyonu ve polimerizasyonu, sürekli boncuk hareketini destekledi (Şekil 1C). Aktin kabuğu oluşumu, simetri kırılması, kuyruk uzaması ve boncuk itişi şeklindeki bu ardışık özellikler, analiz yönteminin düzgün çalıştığının görsel göstergeleri olarak hizmet etti.
Orijinal çalışmamızda raporlandığı18 ve Şekil 2A,B'de gösterildiği üzere, kuyruklu yıldız morfolojisi hem CP konsantrasyonuna hem de miyozin yüzey yoğunluğuna karşı duyarlıydı. Standart analiz koşulları altında (200 nM Arp2/3 kompleksi, 50 nM CP, miyozin:NPF oranı = 0,43:1), miyozin kaplı boncuklar genellikle kontrol boncuklarına göre daha seyrek veya daha yaygın aktin kuyrukları oluşturdu (Şekil 2A). Düşük CP konsantrasyonlarında (&lt;30 nM), aktin yoğun ve kırılmaya dirençli kabuklar şeklinde birleşti. Bu koşullar altında, kontrol boncukları genellikle kapsüllenmiş halde kaldı ve simetri kırılması yaşamadı; buna karşın miyozin kaplı boncukların simetriyi kırma ve çevreleyen aktin kabuğundan kurtulma olasılığı daha yüksekti (Şekil 2A,B). Yüksek CP konsantrasyonlarında (&gt;200 nM), ağ kohezyonu azaldı ve miyozin varlığı aktin ağını daha da destabilize ederek aktin dökülmesini teşvik etti ve stabil kuyrukların oluşumunu engelledi (Şekil 2A,B). Koşullara bağlı olan bu sonuçlar, araştırmacıların uygun analiz rejimlerini belirlemek ve analiz performansındaki sorunları gidermek için kullanabilecekleri faydalı referanslar sağlamaktadır.
Myosin-I'nin aktin kuyruklu yıldız morfolojisi üzerindeki etkisi, kuyruklu yıldız kuyruğunun ortalama floresan yoğunluğu ölçülerek değerlendirilebilir. Kuyruklu yıldız kuyruğu bölgesi, Adım 4.2'de açıklandığı üzere bir yoğunluk eşiği kullanılarak tanımlanmış ve ardından bu bölgedeki ortalama floresan yoğunluğu ölçülmüştür (Şekil 3A). Kontrol ve myosin kaplı boncukların aynı görüş alanında görüntülendiği eşleştirilmiş görüntüleme koşulları altında, bu değer aktin ağ yoğunluğu için göreceli, kalibre edilmemiş bir temsilci olarak kullanılmış olup, daha düşük ortalama yoğunluk daha seyrek bir ağı göstermiştir. Standart analiz koşulları altında, myosin kaplı boncuklar tipik olarak kontrol boncuklarına göre daha düşük ortalama floresan yoğunluğa sahip kuyruklu yıldız kuyrukları oluşturmuştur ve bu durum azalmış görünür ağ yoğunluğu ile tutarlıdır (Şekil 3C).
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Şekil 3. Aktin kuyruk büyüme kinetiği ve birleşme verimliliği için nicelleştirme iş akışı. (A) 50 nM capping protein (CP) varlığında, bir kontrol boncuğu ve 0,43:1 myosin kaplı bir boncuktan elde edilen kuyruk büyümesinin temsilci zaman serileri. Siyah dış hatlar, floresans yoğunluğu ölçümleri için Fiji kullanılarak belirlenen kuyruk ilgi alanlarını (ROI'ler) göstermektedir. Reaksiyon koşulları: %5 rhodamine işaretli aktin içeren 4 µM aktin, 200 nM actin-related protein 2/3 (Arp2/3) kompleksi ve 50 nM CP. Ölçek çubuğu, 5 µm. (B) Panel (A)'da gösterilen temsilci kontrol-myosin boncuk çifti için zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiş kuyruk uzunluğu. İç ek, lineer uyum için kullanılan zaman penceresini göstermektedir ve kuyruk büyüme hızları, uyum çizgilerinin eğimlerinden belirlenmiştir. (C) Panel (A)'da gösterilen temsilci kontrol-myosin boncuk çifti için zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiş normalize edilmiş toplam kuyruk floresans yoğunluğu. Kontrol ve myosin boncukları, 1100 ile 1300 s arasındaki kontrol boncuklarının ortalama floresans yoğunluğuna göre normalize edilmiştir. İç ek, lineer uyum için kullanılan zaman penceresini göstermektedir ve floresans birleşme hızları, uyum çizgilerinin eğimlerinden hesaplanmıştır. (D) Panel (A)'da gösterilen temsilci kontrol-myosin boncuk çifti için kuyruk büyüme hızını, floresans birleşme hızını ve büyüme verimliliğini gösteren özet tablo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Myosin-I'nin kuyruklu yıldız tipi (comet-tail) büyüme kinetiği üzerindeki etkisi, hem kuyruk uzaması hem de zamanla aktin floresans birikimi ölçülerek nicelendirilebilir. Çoğu deneyde, kuyruklar simetri kırılmasını takip eden ilk ~10 dk boyunca yaklaşık sabit bir hızla büyümüştür. Polimerizasyon bileşenleri tükendikçe, uzama kademeli olarak yavaşlamış ve genellikle reaksiyon başlangıcından yaklaşık 30 dk sonra durmuştur. Büyüme kinetiğini nicelendirmek için, kuyruk uzunluğu ve toplam floresans yoğunluğu zamanın bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür (Şekil 3B,C). Başlangıçtaki lineer faza karşılık gelen ilk 7–10 veri noktası, lineer regresyon kullanılarak fit edilmiştir (Şekil 3B,C, ekler). Bu fitlerin eğimleri, sırasıyla başlangıç kuyruk büyüme hızını ve aktin floresans montaj hızını temsil etmektedir. Büyüme verimliliği, aktin polimerizasyonunun ne kadar etkili bir şekilde üretken boncuk yer değiştirmesine dönüştürüldüğünü nicelendirmek amacıyla, kuyruk büyüme hızının aktin floresans montaj hızına bölünmesi olarak tanımlanmıştır (Şekil 3D). Şekil 3A–D'de gösterilen temsilci örnekte, myosin kaplı boncuk 0,60 µm/min (0,010 µm/s) büyüme hızı sergilerken, kontrol boncuğu için bu değer 0,57 µm/min (0,0095 µm/s) olarak görülmüştür (Şekil 3B,D). Karşılık gelen büyüme verimlilikleri sırasıyla 5,6 ve 4,5 µm/yoğunluk birimi olup, myosin kaplı boncuk için yaklaşık 1,2 kat daha yüksek bir değere tekabül etmektedir (Şekil 3D). Standart koşullar altında, orijinal çalışmamızda18 daha önce bildirildiği üzere, myosin kaplı boncuklar genellikle kontrol boncuklarıyla karşılaştırılabilir büyüme hızları (myosin: 0,69 ± 0,10 µm/min; kontrol: 0,66 ± 0,20 µm/min), beraberinde daha düşük bir aktin floresans montaj hızı (kontrolün yaklaşık 0,76 katı) ve yaklaşık 1,4 kat daha yüksek bir büyüme verimliliği sergilemiştir. Bu değerler, beş bağımsız deneyde her koşul için elde edilen 11 boncuk çiftinden ortalama ± SD olarak rapor edilmiştir. İstatistiksel analiz, orijinal çalışmada18 açıklandığı üzere, iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Miyozin güç vuruşunun katkısını değerlendirmek ve gözlemlenen etkilerin miyozin yüzey doluluğuna bağlı sterik engellemeden kaynaklanma olasılığını dışlamak için, boncuk hareketlilik deneyi miyozin-I güç vuruşu aktivitesini bozan koşullar altında gerçekleştirilebilir. Bu protokolde, reaksiyon karışımına 1.1 mM Ca2+ eklenerek miyozin-I motor aktivitesi inhibe edilmiştir. Yükseltilmiş Ca2+, kalmodulinin miyozin-I kaldıraç kolundan ayrılmasını teşvik ederek kaldıraç kolu rijitliğini azaltmış ve kuvvet üretme yeteneğini bozmuştur46,47,48. Bu koşullar altında miyozin-I, aktin ile dinamik olarak ilişkili kalmış ancak aktin kaymasını desteklememiştir (Şekil 4A,B); bu durum, motor aktiviteye bağımlı etkilerin değerlendirilmesi için kullanışlı bir kontrol sağlamıştır18.
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Şekil 4. Boncuk hareketliliği deneyinde Myo1d motor aktivitesini değerlendirmek için kalsiyum tabanlı kontrol. (A) Yükseltilmiş kalsiyum yokluğunda Myo1d kaplı bir yüzey üzerinde hareket eden aktin filamentlerinin veya 100 µM serbest kalsiyum varlığında verimsiz girdap desenleri oluşturan filamentlerin zamanla birleştirilmiş görüntüleri. Gökkuşağı renk çubuğu, 5 s aralıklarla elde edilen 61 kare boyunca zaman ilerlemesini göstermektedir. Ölçek çubuğu, 5 µm. (B) 100 µM serbest kalsiyum yokluğunda ve varlığında aktin kayma hızının nicelendirilmesi (N = 2 bağımsız deney; n = 25 filament). Bu koşullar altında, 100 µM serbest kalsiyum varlığında verimli aktin kayması gözlemlenmemiştir. Hata çubukları SD'yi temsil eder. (C) 100 µM serbest kalsiyum yokluğunda veya varlığında birleştirilmiş temsili kontrol ve miyozin kaplı boncuk çiftleri. Her koşul için beş temsili boncuk çifti gösterilmiştir. Her çift içerisinde, kontrol boncuğu ve miyozin kaplı boncuk aynı görüş alanında görüntülenmiştir. Görüntüler, reaksiyon başlangıcından yaklaşık 15–20 dk sonra elde edilmiştir. Parlaklık ve kontrast, her kontrol-miyozin boncuk çifti içinde doğrusal ve özdeş olarak ayarlanmış ancak koşullar arasında bağımsız olarak ölçeklendirilmiştir. Reaksiyon koşulları: %5 rodamin etiketli aktin içeren 4 µM aktin, 200 nM aktin ilgili protein 2/3 (Arp2/3) kompleksi ve 50 nM kapama proteini (CP). Ölçek çubukları, 5 µm. A ve B panelleri Xu ve ark., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS'tan izin alınarak yeniden üretilmiş/düzenlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
Deney doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, yüksek Ca2+ koşulları altında analiz edilen miyozin kaplı boncuklar, kontrol boncuklarınkilerle karşılaştırılabilir ağ yoğunluklarına sahip daha kısa aktin kuyrukları oluşturmuştur (Şekil 4C). İki bağımsız deneyden alınan beş temsili kontrol ve miyozin kaplı boncuk çifti gösterilmiştir. Bu kalitatif sonuç, tekrarlanan deney hazırlıkları boyunca tutarlı bir şekilde gözlemlenmiş olup orijinal çalışmada bildirilen kantitatif analizle desteklenmektedir18. Bu beklenen sonuç, standart koşullar altında gözlemlenen ağ farklılıklarının, yalnızca miyozin yüzey doluluğundan ziyade aktif bir miyozin güç vuruşuna bağlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, yüksek Ca2+ koşulu, dallanmış aktin ağı organizasyonundaki değişikliklerin miyozin motor aktivitesinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını değerlendirmek için temel bir kontrol görevi görür.

Bu protokol, miyozin motor aktivitesinin, membran benzeri bir arayüzde dallanmış aktin montajını ve ağ mimarisini nasıl etkilediğini nicel olarak incelemek için ayarlanabilir bir aktin kuyruklu yıldız-boncuk hareketlilik testi tanımlamaktadır.

Boncuk Tabanlı Aktin Kuyruk Motilitesi Deneyinde Miyozin-I Aracılı Dallanmış Aktin Düzenlenmesinin Yeniden Oluşturulması

Aktinle ilişkili protein 2/3 (Arp2/3) kompleksi tarafından aracılık edilen dallanmış aktin polimerizasyonu, çeşitli hücresel ... için birincil itme kuvvetlerini sağlar.

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

reconstituting-myosin-i-mediated-branched-actin-assembly-bead-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, aktin-miyozin etkileşimlerini analiz etmek için bir in vitro motilite testi gerçekleştiriyoruz. Aktin filamentlerinin hareketsizleştirilmiş miyozin molekülleri üzerindeki kayma hareketi, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Ters Motilite Testi: İmmobilize Aktin Filamentleri Üzerinde Miyozin Hareketini Görselleştirmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Burada sunulan miyosin 5a'yı ifade etmek ve arındırmak için bir prosedür ve ardından hem topluluk hem de tek moleküllü in vitro floresan mikroskopi bazlı tahliller kullanılarak karakterizasyonu ve bu yöntemlerin nonmuscle miyosin 2b'nin karakterizasyonu için nasıl değiştirilebileceği tartışılmıştır.

İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Aktomiyozin demetlerinin in vitro oluşumu ve optik cımbız kullanılarak miyozin topluluk kuvveti oluşumunun ölçülmesi sunulmuş ve tartışılmıştır.

Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen protein bileşenlerini kullanarak boncukların yüzeylerinde aktin kuyruklu yıldızlarının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu tür sistemler, hücrelerde bulunan çıkıntılı yapıları taklit eder ve kuvvet üretiminin fizyolojik mekanizmalarını basitleştirilmiş bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Bu çalışmada, kontrollü koşullar altında aktomiyosin jellerinin poroelastisitesini incelemek için in vitro rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Aktomiyosin jelinin ve gömülü çözücünün dinamikleri, ağ poroelastisitesinin gösterildiği şekilde ölçülür. Ayrıca deneysel zorlukları, ortak tuzakları ve hücre hücre iskeleti mekaniği ile olan ilgisini tartışıyoruz.

Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Öğrenin, boncuk tabanlı aktin kuyruk motilitesi deneyinde miyozin-I aracılı dallanmış aktin düzenlenmesini yeniden oluşturmayı. Bu yöntem, sitoskelet dinamiklerini nicel olarak analiz etmenizi sağlar.

Boncuk Tabanlı Aktin Kuyruk Motilitesi Deneyinde Miyozin-I Aracılı Dallanmış Aktin Düzenlenmesinin Yeniden Oluşturulması

Daha fazla video keşfet