Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Araştırmamız, osmotik stresten uzun vadeli kök iyileşmesini mümkün kılan genleri ve mekanizmaları inceleyerek ekinleri kuraklığa karşı güçlendirmektedir. Arabidopsis kökleri için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu protokol floresan protein belirteç hatlarına sahip sistemlere uyarlanabilir. Görüntüleme için hazırlanmış Arabidopsis thaliana fidelerini içeren büyüme plakalarını alın.

60 mikrolitre saf suyu cam bir slayta pipetleyin. Suya üç adet altı günlük A.thaliana fidanı kökü yerleştirin. Yaprakları kapatmadan köklerin üzerine 22x22 milimetre ölçümlüğünde 1.5 ölçülü bir örtü koyun.

Konfokal mikroskop ayarlarında, lazer pozlama süresini 1.000 milisaniyeye ayarlayın. Lazer birleştirici ayarlarında, 488 nanometrelik lazeri yeşil floresan protein (GFP) görüntüleme için %50'ye ayarlayın. 561 nanometrelik lazeri kırmızı floresan protein (RFP) görüntüleme için %50'ye ayarlayın.

Örneği optik zoom olmadan 20X objektif lens ile görüntüleyin. Z dilimi adım boyutunu 0.3 mikrometreye ayarlayın. Görüntüleme aralığını bir dakikaya, toplam görüntüleme süresini ise 10 dakikaya ayarlayın.

Kökleri bulun ve en fazla 20 Z dilimi seçin. 16-bit görüntüler yakalayın. Zaman geçişi kaydını başlatın ve zamanlamayı kayıpsız sıkıştırma ile TIFF dosyası olarak kaydedin.

Elde edilen verileri analiz için bir bilgisayara taşıyın. ImageJ veya Fiji yazılımını açın. VSI dosyasını ana ImageJ veya Fiji uygulama penceresine tıklayıp sürükleyin.

Bio Formatlar İç Aktarma Seçenekleri komutunda sağ alt köşedeki Tamam'a tıklayın. Sonra Bio Format Seri Seçenekleri isteğinde Seri 1'in seçildiğinden emin olun. Sol alt köşeden OK tuşuna tıklayın.

Görüntü yüklendikten sonra, sinyalleri Görüntü seçerek bölebilirsiniz. Color ve Split Channels'ı seçin. GFP etiketli çekirdekler ve RFP etiketli kromatin için oluşturulan ayrı pencereleri görüntüleyin.

İki görüntü penceresinden hangisinin kromatine karşılık geldiğini belirleyin. Kromatin görüntü penceresine tıkladıktan sonra, Image seçerek, Stacks'i seçerek ve ana ImageJ penceresinden Z Projesi'ne tıklayarak Z projesi işlemini uygulayın. Projeksiyon türünü maksimum yoğunluğa değiştirin.

Tüm Zaman Dilimleri'nin aktif olduğundan emin olun ve projeksiyonu oluşturmak için Tamam'a tıklayın. Kontrast menüsünü Control Shift C tuşuna basarak veya Image'i seçip Ayarlama seçeneğini seçerek ve ana ImageJ penceresinden Parlaklık veya Kontrast tuşlarına tıklayarak açın. Minimum çubuğu kromatin net görünene kadar sola kaydırın.

Eklentilere gidin. Eklentiler menüsünde aşağı okuna tıklayarak İzleme seçeneğine kaydırın. Tracking seçeneğini seç ve TrackMate'e tıkla.

Kalibrasyon ayarlarının doğru olduğundan emin olun ve Sonra'ya tıklayın. Thresholding Detector'ı seçin ve Sonraki'ye tıklayın. Görüntü penceresinde zaman geçişinin son karesine geç.

Yoğunluk Eşiği'nin yanındaki Otomatik tuşuna tıklayın ve Önizleme'ye tıklayın. Yoğunluk Eşiğini ayarlayın ve Önizleme'ye tıklayın. Tüm kromatin en az gürültüyle dahil edilene kadar ayarlama ve önizleme işlemini tekrarlayın ve Sonra'ya tıklayın.

İlk eşik algılamasının tamamlanmasına izin verin ve Sonra'ya tıklayın. Eşiği manuel olarak ayarlayın ve sadece kromatin görünene kadar kullanın ve Sonraki'ye tıklayın. Floresan görüntü ekranını ayarlayın ve Sonra'ya tıklayın.

Simple LAP Tracker'ı seçin ve Sonraki'ye tıklayın. Bağlantı Maksimum Mesafesini 5 mikron, Boşluk Kapatma Maksimum Mesafesini 15 mikron, Boşluk Kapatma Maksimum Çerçeve Boşluğunu 1 olarak ayarlayın ve Next'e tıklayın. İzlemeyi tamamla.

Orijinal görsel penceresinde gösterilen parçaları inceleyin ve Next'e tıklayın. Sol alt köşedeki yeşil artı düğmesine basarak bir filtre oluşturun. Pist modunda yer sayısını seçin.

Eşik kaydırıcısını ayarlayın. Filtre modunun Yukarı olarak ayarlandığından emin olun ve ardından Sonra'ya tıklayın. Display Options sayfasının altındaki İzler butonuna tıklayın.

CSV'ye Dışa Aktar'ı seçin. Yerleşik çizim sayfasını görmezden gelin ve Next'e tıklayın. TrackMate analiz sonuçlarını inceleyin.

Capture Overlay'e tıklayın ve ardından Execute'u seçin. Videoyu kaydetmek için Dosya seçip Kaydet, ardından GIF'i seçin. Tuzla işlenmiş kök hücreleri stresli görünüyordu ve centromerik odaklar kontrol koşullarındakilerden daha büyük görünüyordu.

Kromatin hızı, kontrol koşullarında 100 milimolar sodyum klorür ile işlenmiş koşullara göre anlamlı derecede yüksekti. Bu protokol, arabidopsis köklerinde zaman içinde floresan etiketlenmiş protein hareketlerinin izlenmesini ve nicelendirilmesini sağlar. Bu protokoldeki en önemli zorluk, fotoğraf ağartma ve örnek kayması takibi zorlaştırabileceği için yüksek kaliteli görüntüler elde etmektir.

Gelecekteki çalışmalar, çalışmamızda gözlemlenen azalmış kromatin hareketinin altında yatan mekanizmaları araştırmalıdır.