Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres
5 Haziran 2026
Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.
Araştırmamız, osmotik stresten uzun vadeli kök iyileşmesini mümkün kılan genleri ve mekanizmaları inceleyerek ekinleri kuraklığa karşı güçlendirmektedir. Arabidopsis kökleri için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu protokol floresan protein belirteç hatlarına sahip sistemlere uyarlanabilir. Görüntüleme için hazırlanmış Arabidopsis thaliana fidelerini içeren büyüme plakalarını alın.
60 mikrolitre saf suyu cam bir slayta pipetleyin. Suya üç adet altı günlük A.thaliana fidanı kökü yerleştirin. Yaprakları kapatmadan köklerin üzerine 22x22 milimetre ölçümlüğünde 1.5 ölçülü bir örtü koyun.
Konfokal mikroskop ayarlarında, lazer pozlama süresini 1.000 milisaniyeye ayarlayın. Lazer birleştirici ayarlarında, 488 nanometrelik lazeri yeşil floresan protein (GFP) görüntüleme için %50'ye ayarlayın. 561 nanometrelik lazeri kırmızı floresan protein (RFP) görüntüleme için %50'ye ayarlayın.
Örneği optik zoom olmadan 20X objektif lens ile görüntüleyin. Z dilimi adım boyutunu 0.3 mikrometreye ayarlayın. Görüntüleme aralığını bir dakikaya, toplam görüntüleme süresini ise 10 dakikaya ayarlayın.
Kökleri bulun ve en fazla 20 Z dilimi seçin. 16-bit görüntüler yakalayın. Zaman geçişi kaydını başlatın ve zamanlamayı kayıpsız sıkıştırma ile TIFF dosyası olarak kaydedin.
Elde edilen verileri analiz için bir bilgisayara taşıyın. ImageJ veya Fiji yazılımını açın. VSI dosyasını ana ImageJ veya Fiji uygulama penceresine tıklayıp sürükleyin.
Bio Formatlar İç Aktarma Seçenekleri komutunda sağ alt köşedeki Tamam'a tıklayın. Sonra Bio Format Seri Seçenekleri isteğinde Seri 1'in seçildiğinden emin olun. Sol alt köşeden OK tuşuna tıklayın.
Görüntü yüklendikten sonra, sinyalleri Görüntü seçerek bölebilirsiniz. Color ve Split Channels'ı seçin. GFP etiketli çekirdekler ve RFP etiketli kromatin için oluşturulan ayrı pencereleri görüntüleyin.
İki görüntü penceresinden hangisinin kromatine karşılık geldiğini belirleyin. Kromatin görüntü penceresine tıkladıktan sonra, Image seçerek, Stacks'i seçerek ve ana ImageJ penceresinden Z Projesi'ne tıklayarak Z projesi işlemini uygulayın. Projeksiyon türünü maksimum yoğunluğa değiştirin.
Tüm Zaman Dilimleri'nin aktif olduğundan emin olun ve projeksiyonu oluşturmak için Tamam'a tıklayın. Kontrast menüsünü Control Shift C tuşuna basarak veya Image'i seçip Ayarlama seçeneğini seçerek ve ana ImageJ penceresinden Parlaklık veya Kontrast tuşlarına tıklayarak açın. Minimum çubuğu kromatin net görünene kadar sola kaydırın.
Eklentilere gidin. Eklentiler menüsünde aşağı okuna tıklayarak İzleme seçeneğine kaydırın. Tracking seçeneğini seç ve TrackMate'e tıkla.
Kalibrasyon ayarlarının doğru olduğundan emin olun ve Sonra'ya tıklayın. Thresholding Detector'ı seçin ve Sonraki'ye tıklayın. Görüntü penceresinde zaman geçişinin son karesine geç.
Yoğunluk Eşiği'nin yanındaki Otomatik tuşuna tıklayın ve Önizleme'ye tıklayın. Yoğunluk Eşiğini ayarlayın ve Önizleme'ye tıklayın. Tüm kromatin en az gürültüyle dahil edilene kadar ayarlama ve önizleme işlemini tekrarlayın ve Sonra'ya tıklayın.
İlk eşik algılamasının tamamlanmasına izin verin ve Sonra'ya tıklayın. Eşiği manuel olarak ayarlayın ve sadece kromatin görünene kadar kullanın ve Sonraki'ye tıklayın. Floresan görüntü ekranını ayarlayın ve Sonra'ya tıklayın.
Simple LAP Tracker'ı seçin ve Sonraki'ye tıklayın. Bağlantı Maksimum Mesafesini 5 mikron, Boşluk Kapatma Maksimum Mesafesini 15 mikron, Boşluk Kapatma Maksimum Çerçeve Boşluğunu 1 olarak ayarlayın ve Next'e tıklayın. İzlemeyi tamamla.
Orijinal görsel penceresinde gösterilen parçaları inceleyin ve Next'e tıklayın. Sol alt köşedeki yeşil artı düğmesine basarak bir filtre oluşturun. Pist modunda yer sayısını seçin.
Eşik kaydırıcısını ayarlayın. Filtre modunun Yukarı olarak ayarlandığından emin olun ve ardından Sonra'ya tıklayın. Display Options sayfasının altındaki İzler butonuna tıklayın.
CSV'ye Dışa Aktar'ı seçin. Yerleşik çizim sayfasını görmezden gelin ve Next'e tıklayın. TrackMate analiz sonuçlarını inceleyin.
Capture Overlay'e tıklayın ve ardından Execute'u seçin. Videoyu kaydetmek için Dosya seçip Kaydet, ardından GIF'i seçin. Tuzla işlenmiş kök hücreleri stresli görünüyordu ve centromerik odaklar kontrol koşullarındakilerden daha büyük görünüyordu.
Kromatin hızı, kontrol koşullarında 100 milimolar sodyum klorür ile işlenmiş koşullara göre anlamlı derecede yüksekti. Bu protokol, arabidopsis köklerinde zaman içinde floresan etiketlenmiş protein hareketlerinin izlenmesini ve nicelendirilmesini sağlar. Bu protokoldeki en önemli zorluk, fotoğraf ağartma ve örnek kayması takibi zorlaştırabileceği için yüksek kaliteli görüntüler elde etmektir.
Gelecekteki çalışmalar, çalışmamızda gözlemlenen azalmış kromatin hareketinin altında yatan mekanizmaları araştırmalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
