ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+snapshots+of+natural+killer+cells+functions%2C+signaling%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization.</a> Signal Transduct Target Ther. , (2024).</li>
<li>Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fluorescent+protein+reporters+allow+parallel+quantification+of+natural+killer+cell-mediated+granzyme+and+caspase+activities+in+single+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells.</a> Front Immunol. , (2018).</li>
<li>Hartmann, J. A., Cardoso, M. R., Talarico, M. C. R., Kenney, D. J., Leone, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+NKG2D-mediated+cytotoxic+immunity+by+sarbecoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evasion of NKG2D-mediated cytotoxic immunity by sarbecoviruses.</a> Cell. , (2024).</li>
<li>Garcia-Beltran, W. F., Hölzemer, A., Martrus, G., Chung, A. W., Pacheco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+conformers+of+HLA-F+are+high-affinity+ligands+of+the+activating+NK-cell+receptor+KIR3DS1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1.</a> Nat Immunol. , (2016).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+natural+killer+cell+immunotherapy+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The application of natural killer cell immunotherapy for the treatment of cancer.</a> Front Immunol. , (2015).</li>
<li>Coënon, L., Villalba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CD16a+biology+to+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From CD16a biology to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity improvement.</a> Front Immunol. , (2022).</li>
<li>Ruggeri, L., Mancusi, A., Capanni, M., Martelli, M. F., Velardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+alloreactive+NK+cells+in+adoptive+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer.</a> Curr Opin Immunol. , (2005).</li>
<li>Liu, E., Marin, D., Banerjee, P., Macapinlac, H. A., Thompson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> N Engl J Med. , (2020).</li>
<li>Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+natural+killer+cells+engineered+with+chimeric+antigen+receptors+enhance+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity.</a> Cell Stem Cell. , (2018).</li>
<li>Marin, D., Li, Y., Basar, R., Rafei, H., Daher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+efficacy+and+determinants+of+response+of+allogeneic+CD19-specific+CAR-NK+cells+in+CD19%2B+B+cell+tumors%3A+a+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial.</a> Nat Med. , (2024).</li>
<li>Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+migration+in+the+context+of+hepatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells.</a> J Vis Exp. (156), e60714(2020).</li>
<li>Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+NK+cells+engineered+to+express+IL-15+and+a+CD19-targeted+CAR+show+long-term+persistence+and+potent+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+specifically+TCR-dressed+to+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells.</a> EBioMedicine. , (2019).</li>
<li>Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-NK+cells+targeting+HER1+%28EGFR%29+show+efficient+anti-tumor+activity+against+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).</a> Cancers (Basel). , (2023).</li>
<li>Granger, J. E., Appledorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurement+of+apoptosis+and+immune+cell+killing+using+live-cell+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis.</a> Methods Mol Biol. , (2021).</li>
<li>Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK%2B+LBCL+and+PBL+share+a+similar+plasmablastic+transcriptional+identity+but+show+divergent+signaling+dependencies+and+therapeutic+vulnerabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities.</a> Blood. , (2025).</li>
<li>Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+for+the+assessment+of+human+NK+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity.</a> J Vis Exp. (126), e56191(2017).</li>
<li>Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+for+immunotherapy+-+advantages+of+the+NK-92+cell+line+over+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells.</a> Front Immunol. , (2016).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. , (2004).</li>
<li>Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+and+structurally+distinct+NK+cell+receptor+repertoires+in+the+peripheral+blood+of+two+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors.</a> Immunity. , (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fratricide+of+NK+cells+in+daratumumab+therapy+for+multiple+myeloma+overcome+by+ex+vivo-expanded+autologous+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells.</a> Clin Cancer Res. , (2018).</li>
<li>Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+NK+cells+maintain+high+cytotoxicity+and+enhance+in+vivo+tumor+control+in+concert+with+T+cells+and+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy.</a> Sci Transl Med. , (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633020</td><td>NK-92 ve primer insan NK-hücre kültür ortamı için bazal ortam (tam formülasyon için protokolü görün)</td></tr><tr><td>Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>Akış sitometrisi için degranülasyon markörü</td></tr><tr><td>Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>Hücre peletleme ve plaka santrifüjlendirme için kullanılır (100&ndash;300 &times; g)</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Hedef hücre etiketleme için hücre proliferasyon boyası</td></tr><tr><td>Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N7-00003</td><td>Akış sitometrisi edinimi ve analizi için kullanılır</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindole)</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>Canlı/ölü ayrımı için nükleer leke</td></tr><tr><td>Derin kuyu 96-kuyulu plaka</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>Antikor hazırlığı için kullanılır</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Kriopreservasyon reaktifi</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>Bazal ortam takviye etme; FACS tamponunda kullanılır (%2 FBS)</td></tr><tr><td>General Purpose Water Bath, 10 L (37 &deg;C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>Hücre eritme için</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-alanil-L-glutamin takviyesi)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Kararlı glutamin kaynağı</td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>Primer insan NK-hücre kültür ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>IncuCyte SX5 canlı hücre görüntüleme sistemi</td><td>Sartorius</td><td>4816</td><td>Gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme ve Hücre-Hücre analizi</td></tr><tr><td>LUNA-FL çift floresanlı hücre sayacı (veya eşdeğeri)</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Otomatik hücre sayımı</td></tr><tr><td>Parafilm M (4 in &times; 250 ft rulo)</td><td>Genesee</td><td>16-101</td><td>Plaka mühürleme ve depolama</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), steril (pH 7.2&ndash;7.4)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Yıkama ve FACS tamponu hazırlanması için kullanılır</td></tr><tr><td>Poly-D-lizin (0.1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td>Plaka kaplama reaktifi</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>Recombinant human interleukin-2 (IL-2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>Sitokin</td></tr><tr><td>RosetteSep Human NK-cell enrichment kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>İnsan NK-hücre zenginleştirme kokteyli</td></tr><tr><td>SYTOX Orange dead cell stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34861</td><td>Canlı hücre görüntüleme için canlılık boyası</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Hücre sayımı için canlılık boyası</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604039</td><td>Yapışkan hücre ayrılması için</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>FACS tamponu hazırlanması için kullanılır</td></tr><tr><td>15-mL konik tabanlı santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Steril</td></tr><tr><td>24-kuyulu doku kültürü plakası (doku kültürü&ndash;tedavi edilmiş)</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>NK-hücre geri kazanımı için kullanılır</td></tr><tr><td>96-kuyulu düz yuvarlak tabanlı berrak plaka (doku kültürü&ndash;tedavi edilmiş)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Eş-kültür ve akış sitometri analizleri için kullanılır</td></tr><tr><td>96-kuyulu düz berrak tabanlı siyah polistiren plaka (doku kültürü&ndash;tedavi edilmiş)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Canlı hücre görüntüleme sistemleri ile uyumlu</td></tr></tbody></table>

canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen nk-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a critical role in protective immunity against diverse intracellular pathogens and cancers. ...

Laboratuvarımız, solid ve kan kanserlerinin tedavilerini geliştirmek amacıyla doğal öldürücü hücrelerin potansiyelinden yararlanmayı hedefleyerek, bu hücrelerin sağlık ve hastalıktaki rolünü incelemektedir. Mevcut NK hücresi sitotoksisite analizleri, platformlar ve düzenekler arasında standartlaşmadan yoksundur. Bu protokol, doğru sitotoksisite değerlendirmesi için tekrarlanabilir canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi yöntemleri sunmaktadır.Başlamak için, SYTOX Orange stok çözeltisini 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpünde NK-92 kültür medyası ile seyrelterek 10 mililitre 2x SYTOX Orange hazırlayın. Trypan Blue ile karıştırdıktan sonra bir Luna Sayıcı kullanarak hedef hücreleri sayın veya onaylanmış herhangi bir boya dışlama tabanlı hücre sayım yöntemini kullanın. Gerekli miktardaki hedef hücreyi 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Ardından, hedef hücreleri 2X SYTOX Orange ortamında mililitre başına 250.000 hücre olacak nihai konsantrasyona yeniden süspande edin. Efektör hücreyi hazırlamak için NK-92 hücre canlılığını ve konsantrasyonunu değerlendirin ve yalnızca canlılık %80'den yüksekse işleme devam edin; çünkü daha düşük canlılık assay performansını etkileyebilir.Gerekli sayıda NK-92 hücresini sayın ve her biri 15 mililitrelik konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarın. Santrifüjasyon sonrası hücreleri mililitre başına 500.000 hücre nihai konsantrasyona gelecek şekilde yeniden süspande edin. İkiye bir efektör-hedef oranlı hücreler için 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyucuklarına 240 mikrolitre efektör hücre ekleyerek efektör hücre dilüsyonlarını hazırlayın ve kalan kuyucuklara 120 mikrolitre medya ekleyin.İkiye bir, bire bir ve 0,25'e bir efektör-hedef oranlarında iki katlı seri dilüsyonlar gerçekleştirin; pipetleme ile en az beş kez iyice karıştırın ve her transfer arasında uçları değiştirin. Ardından, ko-kültürü kurmak için polilizin kaplı, düz tabanlı 96 kuyucuklu plakayı hazırlayın. Transferden hemen önce, hedef ve efektör hücreleri kabarcık oluşturmadan iyice yeniden süspanse edin, ardından her bir hücre süspansiyonundan 100 µL'yi ilgili kuyucuklara ekleyin.Ardından, çevredeki kullanılmayan kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 100G'de santrifüj edin. Plakayı canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirin.37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca her bir saatte bir görüntüler elde edin. İlk taramanın ardından görüntü kalitesini doğrulayın ve gerekirse görüntüleme ayarlarını düzenleyin. SYTOX Orange'ın yeşil kanala taşmasını düzeltmek için spektral ayrıştırmayı ayarlayın.Turuncu pozitif ölü hücrelerin, yeşil pozitif hücreler olarak yanlış tanımlanmadığını doğrulayın. Adherent olmayan hücrelerin hücre bazında analizini yapılandırmak için, beklenen nesne çapını yaklaşık hücre çapıyla uyumlu olacak şekilde 15 micrometers olarak ayarlayın. Hücre kümelerinin ayrılmasını kolaylaştırmak için eşik hassasiyetini ve doku hassasiyetini beş, kenar hassasiyetini ise 10 olarak ayarlayın.Döküntüleri ve büyük nesneleri hariç tutmak için kabul edilen nesne alanı filtre aralığını 50 ila 2.000 square micrometers olarak ayarlayın. Hücresel olmayan nesneleri hariç tutmak için maksimum eksantrisiteyi 0,95 olarak ayarlayın. 16 ila 24 saat boyunca kültüre edilmiş primer insan NK hücreleri temin edin.500.000 hedef hücreyi 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin.Ardından süpernatantı uzaklaştırın. Beş milimolar CFSE stok çözeltisinin bir mikrolitresini 10 mililitre PBS içinde seyrelterek, PBS içinde 0.5 mikromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester veya CFSC çalışma çözeltisi hazırlayın. Elde edilen pellet'i, CFSE çözeltisi içerisinde mililitre başına yaklaşık bir milyon hücre olacak şekilde yeniden süspansiyona getirin.Hücreleri, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılı halde 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ardından, beş ila 10 hacim kültür ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, 100 µL'nin 25.000 hücre içerecek şekilde, hücre peletini mililitrede 250.000 hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.Çok kanallı bir pipet kullanarak, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenen kuyucuklarına kuyucuk başına 100 µL hedef hücre ekleyin. Her koşulu üç tekrar şeklinde platlayın. Ardından, her test antikoru ve eşleşen izotip kontrolü için NK hücresi kültür ortamında 200 µL 4X antikor çözeltisi hazırlayın.Antikor çözeltilerini derin kuyucuklu bir plakaya aktarın. Hedef hücreleri içeren her bir kuyucuğa 50 microliter antikor çözeltisi ekleyin ve pipetle en az beş kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Antikor içermeyen kontrol kuyucuklarının her birine 50 microliter NK hücresi kültür medyumu ekleyin ve pipetleme yoluyla iyice karıştırın.Plakayı standart inkübasyon koşulları altında 25 ila 30 dakika inkübe edin. 200.000 NK hücresini sayıp elde edin ve yalnızca canlılık %75'e eşit veya daha büyükse işleme devam edin. Hücreleri, 800 µL birincil insan NK hücresi kültüründe mililitre başına 250.000 hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. İlgili kuyucuklara kuyucuk başına 50 µL NK hücresi ekleyin ve pipetle en az beş kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın.Ardından, kontrol kuyucuklarının her birine 50 µL kültür ortamı pipetleyin ve iyice karıştırın. Tüm kuyucukların 200 µL içerdiğini, menisküs seviyelerinin tekdüze olduğunu ve hava kabarcığı bulunmadığını onaylamak için yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakayı dikkatlice inceleyin. Plakayı 100G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin, ardından standart inkübasyon koşulları altında 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin.Plakayı 300G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Tüm kuyucukları, kuyucuk başına 200 µL floresan aktive hücre ayıklama veya FACS tamponu ile yıkayın. Burada sunulduğu şekilde, FACS tamponu içerisinde bir yüzey antikoru ana karışımı hazırlayın.Hücreleri, kuyuk başına 50 µL antikor master karışımı içerisinde tekrar süspanse edin ve pipetle en az beş kez aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın. Plakayı, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılı halde, 4 °C'de 15 dakika inkübe edin. Kuyuk başına 150 µL FACS tamponu ekleyin.Santrifüj işleminin ardından, hücreleri kuyuk başına 100 µL FACS tamponu içinde beş µM DAPI ile yeniden süspande edin. Ön inkübasyon yapmadan hemen akış sitometrisi veri toplama aşamasına geçin. Akış sitometrisini Cytek Aurora cihazını kullanarak gerçekleştirin ve CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI ile varsa diğer floroforlar için floresans kanallarını kaydedin.Ko-kültür sırasında efektör hücreler, canlı hedef hücreler ve ölü hücreler gerçek zamanlı canlı hücre mikroskopisi kullanılarak görselleştirildi. Eşit efektör/hedef oranında, özellikle erken zaman noktalarında, CAR2 ve CAR3 NK-92 hücreleri, CAR1-NK-92 hücrelerine kıyasla daha hızlı öldürme kinetiği sergiledi. Doğal sitotoksisite gösteren kontrol NK-92 hücreleri de dahil olmak üzere, hedef hücre öldürme oranı daha yüksek efektör/hedef oranlarıyla birlikte arttı.CAR2 ve CAR3 NK-92 hücreleri, daha geç zaman noktalarında daha düşük efektör/hedef oranlarında daha yüksek potansiyel göstermiştir. Önceki zaman noktalarında ise orta düzey efektör/hedef oranlarında artmış potansiyel gözlemlenmiştir. CAR-NK-92 hücresi potansiyelini, öldürme kinetiğini ve efektör popülasyonları genelindeki toplam sitotoksik performansı nicelleştirmek için KR50, KT50 ve IKI-50 şeklinde üç parametre tanımlanmıştır.Yalnızca daratumumab eklenmesi hedef hücre sağkalımını azaltmamıştır; bu da efektör hücrelerin yokluğunda antikorun hedef hücre canlılığı üzerinde doğrudan bir etkisinin olmadığını doğrulamıştır. Yalnızca NK hücreleri ile birlikte kültürleme, hedef hücre sağkalımını yaklaşık %70'e düşürerek temel doğal sitotoksisiteyi göstermiştir. Daratumumab eklenmesi, hücre sağkalımını yaklaşık %37'ye kadar daha da düşürmüştür; bu durum artan antikor aracılı sitotoksisite ile tutarlıdır.Buna karşılık, izotip kontrol koşulu, NK tek başına koşulu ile benzer şekilde yaklaşık %62 sağkalım göstermiştir. NK hücresi degranülasyonu, antikor içermeyen NK hücresi hedef hücre ko-kültüründe en düşük seviyede gerçekleşirken, daratumumab ile tedavi edilen koşulda yaklaşık %31 ile en yüksek seviyeye ulaşmıştır; izotip kontrolü ise yaklaşık %19 ile orta düzeyde bir degranülasyon göstermiştir. Bu protokol, araştırmacıların NK hücresi doğal sitotoksisitesini nicelleştirmesine, CAR-NK tasarımlarının tümör öldürme kapasitesini değerlendirmesine ve monoklonal antikorların ADCC etkinliğini karşılaştırmasına olanak tanır. Bu protokolü uygularken dikkat edilmesi gereken temel husus, güvenilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için NK ve hedef hücrelerin doğru ve tutarlı şekilde sayılması, pipetlenmesi ve plaklara eklenmesinin sağlanmasıdır.Gelecekteki çalışmalar, NK hücresi immün kaçışını araştırmak, tümör duyarlılığını karşılaştırmak ve farklı kanser türlerinde yeni NK hücresi tabanlı immünoterapileri değerlendirmek için bu protokollerden yararlanabilir.

quantifying-nk-cell-cytotoxicity-potentiated-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, doğal öldürücü hücrelerin floresan lekeli hedef hücrelere karşı litik aktivitesini göstermektedir. Yöntem, ölü hücreleri boyayarak ve canlı ve ölü hedef hücreleri ölçmek için bir akış sitometresi kullanarak NK hücresinin neden olduğu sitotoksisite ölçümünü mümkün kılar.

Akış Sitometrik Analizi için Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite Testi Numune Hazırlama

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Bu çalışma, insan kan örneklerinde NK (Doğal Öldürücü) hücre sayısının ve NK hücre sitotoksisitesinin doğru ve hızlı bir şekilde belirlenmesi için gelişmiş bir iş akışını açıklar.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard.  Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Daha fazla video keşfet