CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu
June 16th, 2026
Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.
Araştırmamız, canlı ve ayrılmış Drosophila larvalarında tanımlanmış sinirsel düğüm ortakları arasındaki fonksiyonel sinaptik bağlantıyı değerlendirmeye odaklanmaktadır. Geleneksel yöntemler, ayrıştırma veya fiziksel stimülasyon gerektirir. Bu protokol, dokunulmamış larvalarda optogenetik kullanır ve bu sayede yapaylıkları azaltır.
Başlamak için, mısır unu agar ortamını, mikrodalga fırında kaynamadan 8-10 saniye eritin ve odanın sıcaklığında katılaşmadan soğumaya bırakın. Tamamen soğumadan önce, csChrimson aktivasyonu gerektiren sinekler için ortama 0.5 milimolar konsantrasyonunda all-trans-retinal veya ATR ekleyin. Uçucu ışıktan korunması için şişeleri tamamen alüminyum folyo ile örtün.
CaMPARI ve csChrimson genlerini taşıyan bakir dişileri, GAL4 ve LexA driver genlerini taşıyan erkeklerle, hazırlanmış ortam içeren plastik şişelerde çaprazlayın. Kontroller için ATR içermeyen paralel şişeler hazırlayın. Larvalar üçüncü erime aşamasına ulaşana kadar şişeleri 25 derece Celsius'ta inkübe edin.
Üçüncü erime aşamasında bir larva toplamak için bir boya fırçası kullanın. Larvaları, yapışan yiyecekleri çıkarmak için 0.1 molar PBS içeren üç kuyucukluk bir mikro nokta plakasında yıkayın. Temiz bir 18 x 18 milimetrelik kapak camının her köşesine az miktarda modelleme hamuru yerleştirin.
Larvayı kapak camının üzerinde PBS damlasının üzerine yerleştirin ve ventral tarafı aşağı olacak şekilde yönlendirilmesine izin verin. Larva içeren kapak camının üzerine temiz bir mikroskopik slayt yerleştirin. Lavaboyu, larvaları ezmeden veya camı kırmadan sabitlemek için yeterli bir basınçla köşelerine modelleme hamuru uygulayarak sabitleyin.
Larvayı içeren slaydı, 40x/1.2 objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskobun üzerine yerleştirin. Mikroskop yazılımı arayüzünde Canlı seçeneğine tıklayın. Ardından Z Stack panelinde Öncelikli Ayarla ve ardından Son Ayarla seçeneklerine tıklayın ve CaMPARI'yi eksprese eden postsinaptik nöronların temel Z Stack'ini elde etmek için Dur'a tıklayın.
Kanallar menüsünde, 0.8% lazer gücü ile 488 nanometre yeşil kanalı ayarlayın. Ardından, 0.8% lazer gücü ile 561 nanometre kırmızı kanalı ayarlayın. Z Stack menüsünde Aralık değerini 1 mikrometre olarak ayarlayın.
Kasıma menüsünde, 256 x 256 piksel çözünürlüğünü ayarlamak için Presets'i seçin. 2'lik bir çizgi Ortalama değeri, çift yönlü tarama ve piksel zamanının otomatik güncellemesine izin veren 9'luk bir tarama hızı ile. Tüm görüntülemeyi karanlık bir ortamda, deney boyunca aynı kazanım parametrelerini koruyarak gerçekleştirin.
405 nanometre fotokonversiyon ışığını 0.5% lazer gücüne ve 561 nanometre optogenetik stimülasyon ışığını 0.8% lazer gücüne ayarlayın. Ardından Canlı seçeneğine tıklayın ve Ardından Histogram panelindeki En İyi Uyumu seçin.
Her iki lazerin larvayı 30 saniye boyunca eşzamanlı olarak stimüle etmesine izin verin, ardından stimülasyonu durdurun. Stimulasyon sonrası ZStack alımı sırasında, temel ile aynı parametreleri kullanarak, ATR beslenmiş larvaların lazerle uyarılan nöronlarında minimal fotokonversiyon ve kontrollerdeki kırmızı CaMPARI floresanını gözlemleyin. Fiji ImageJ yazılımında Dosya'ya tıklayın ve ardından Aç'ı seçin.
Varsayılan ayarlarla BioFormats içe aktarma seçenekleri penceresinde, kazanılan ZStack görüntüsünü açmak için Tamam'a tıklayın. Görüntü menüsünde Renk'i seçin ve ardından Renk Kanallarını Böl'ü seçerek kazanılan görüntünün kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüleyin. Arka plan çıkarmak için İşlem'i seçin ve ardından Arka Plan Çıkart'ı seçin.
Açılır pencerede, toplama topu yarıçapını 50 piksel olarak ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın ve İşlem Stack penceresinde Evet'i seçin. Ardından Analiz menüsünde Araçlar'ı seçin ve ardından ROI Yöneticisi'ni seçerek ROI penceresini açın. Bireysel hücrelerin etrafındaki ilgi alanlarını özgürce seçim aracıyla çizerek çizebilirsiniz.
ROI penceresinde, seçili çizişi kaydetmek için Ekle'yi seçin. Ardından Alan, Ortalama, Standart Sapma ve entegre yoğunluk sonuçlarını oluşturmak için Ölç'e tıklayın. Aynı larvanın birden fazla hücresinin yeşil ve kırmızı kanalları ayrı ayrı ölçüm sürecini tekrarlayın.
Sonuçları bir elektronik tabloya aktardıktan sonra, her hücre için entegre yoğunlukların kırmızı ila yeşil veya R G oranını ölçün ve bu değerleri ortalamak için her larva için stimülasyon öncesi ve sonrası görüntülerin ortalama R G oranını hesaplayın. Son olarak, postsinaptik kalsiyum aktivitesini ölçmek için stimülasyon öncesi R G oranından stimülasyon sonrası R G oranını çıkararak floresan değişikliğini veya delta R G'yi hesaplayın. Üçüncü erime aşamasındaki sınıf IV dendritik ağaçlaşması veya cIVda nöronları ile basin-4 internöronları arasındaki fonksiyonel bağlantı çalışmaları, basin-4 internöronlarının fotokonversiyon ve optojenik
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.