CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Araştırmamız, canlı ve disseksiya edilmiş Drosophila larvalarında tanımlanmış sinir düğümü partnerleri arasındaki fonksiyonel sinaptik bağlantıyı değerlendirmeye odaklanmaktadır. Geleneksel yöntemler ise disseksiyon veya fiziksel uyarım gerektirir. Bu protokol, sağlam larvalarda optogenetik kullanarak artefaktları azaltır.

Başlamak için, mısır unu agar ortamını mikrodalgada 8-10 saniye kaynatmadan eritin ve oda sıcaklığında soğumasına izin verin, katılaşmadan. Tam soğutmadan önce, csChrimson aktivasyonu gerektiren sinekler için ortamı desteklemek amacıyla 0,5 milimolar konsantrasyona all-trans-retinal (ATR) ekleyin. Şişeleri tamamen alüminyum folyo ile kaplayın, böylece ışığa maruz kalmayı önleyin.

CaMPARI ve csChrimson genlerini taşıyan çapraz bakire dişiler, erkekler ise hazırlanmış ortamı içeren plastik şişelerde GAL4 ve LexA sürücü genlerini taşıyor. ATR olmadan paralel şişeleri hazırlayın. Şişeleri 25 derece Celsius sıcaklığında inkubka edin, larvalar üçüncü instar aşamasına ulaşana kadar.

Üçüncü bir instar larvasını toplamak için fırça kullanın. Larvayı, yapışan yiyecekleri çıkarmak için 0.1 molar PBS içeren üç kuyruklu mikro spot plakada durulayın. Temiz 18 x 18 milimetrelik bir örtü parçasının her köşesine az miktarda modelleme kilini yerleştirin.

Larvayı kapak kılıfı üzerine bir damla PBS ile yerleştirin ve ventral tarafı aşağıya doğru konumlanmasına izin verin. Larvanı içeren kapak parçasının üzerine temiz bir mikroskop slaytı yerleştirin. Kapak kayışını, larvanı ezmeden veya camı kırmadan hareketsiz hale getirmek için yeterince basınç uygulayarak köşelere modelleme kilini uygulayarak sabitleyin.

Larvanı içeren slaytı, 40x/1.2 objektif lensle donatılmış konfokal mikroskobin sahnesine yerleştirin. Mikroskop yazılım arayüzünde Canlı seçeneğine tıklayın. Sonra Z Yığını panelinin altında, Set First, ardından Set Last ve ardından Stop tuşuna tıklayarak CaMPARI'yi ifade eden postsinaptik nöronlardan oluşan bir temel Z Yığını elde edin.

Kanallar menüsünde, %0,8 lazer gücüne sahip 488 nanometre yeşil kanalı ayarlayın. Sonra, 561 nanometrelik kırmızı kanalı %0,8 lazer gücüne ayarlayın. Z Stack menüsünden Aralık değerini 1 mikrometre olarak ayarlayın.

Acquisition menüsünde Preset'leri seçerek 256 x 256 piksel çözünürlüğü ayarlayın. Çizgi ortalaması değeri 2, çift yönlü tarama ve 9 tarama hızı, böylece piksel süresinin otomatik güncellenmesini sağlar. Tüm görüntülemeyi karanlık bir ortamda gerçekleştirin, deney boyunca aynı toplama parametrelerini koruyun.

405 nanometrelik fotodönüşüm ışığını %0,5 lazer gücüne ayarlayın. Ve 561 nanometrelik optogenetik uyarılma ışığı %0,8 lazer gücüne ulaştırıyor. Live'a tıklayın, ardından Histogram panelinin altında En İyi Uyum'u seçin.

Her iki lazerin larvanı 30 saniye boyunca aynı anda uyarmasına izin verin, ardından uyarıyı durdurun. Uyarılma sonrası ZStack alımı sırasında, başlangıç parametreleriyle aynı parametrelerle ATR ile beslenen larvaların lazerle uyarılmış nöronlarında minimal fotodönüşüm ve kontrol sistemleriyle kırmızı CaMPARI floresansı gözlemlenin. Fiji ImageJ yazılımında Dosya'ya tıklayın, ardından Aç'ı seçin.

BioFormats iç aktarma seçenekleri penceresinde varsayılan ayarlarla, alınan ZStack görselini açmak için OK'a tıklayın. Görsel menüsünden Color'u seçin ve ardından Split Channels'ı seçerek alınan görselin kırmızı ve yeşil kanallarını görebilirsiniz. Arka plan çıkarma için İşlem'e tıklayın, ardından Arka Planı Çıkar seçeneğini seçin.

Açılır pencerede, yuvarlanan top yarıçapını 50 piksele ayarlayın, sonra Tamam'a tıklayın ve Süreç Yığını penceresinden Evet'i seçin. Sonra, Analiz menüsünden Araçlar'ı seçin, ardından ROI Yöneticisi'ni seçerek ROI penceresini açın. Bireysel hücrelerin etrafındaki ilgi alanlarını belirlemek için serbest el seçim aracını kullanın.

ROI penceresinde, seçilen taslağı kaydetmek için Ekle seçeneğini seçin. Sonra Ölçü tuşuna tıklayarak alan, ortalama, standart sapma ve entegre yoğunluk sonuçlarını üretin. Aynı larvanın birden fazla hücresi için yeşil ve kırmızı kanallarda ayrı ayrı tekrarlanıyor.

Sonuçları bir elektronik tabloya aktardıktan sonra, her hücre için entegre yoğunlukların kırmızı-yeşil veya R x G oranını ölçün ve bu değerleri ortalamalayarak hem uyarılma öncesi hem de sonrası görüntüler için larva başına ortalama R x G oranını hesaplayın. Son olarak, spivarasyon sonrası R ile G oranından önce R ile G oranını çıkararak floresans veya delta R ile G değişimini hesaplayarak post-sinaptik kalsiyum aktivitesini nicelikle ölçülür. Üçüncü instar larvalarda sınıf IV dendritik arborizasyon veya cIVda nöronları ile basin-4 internöronlar arasındaki fonksiyonel bağlantı çalışmaları, basin-4 internöronların fotodönüşüm ve optojenik ışık uyarısından önce sitozolik CaMPARI ekspresyonundan kaynaklanan yeşil floresans gösterdiğini göstermiştir.

Başlangıç koşullarında kırmızı floresans tespit edilmedi, bu da uyarı öncesinde fotodönüşümün olmadığını doğrulamaktadır. Eşzamanlı fotodönüşümlü ışık maruziyeti ve optogenetik uyarım, CaMPARI fotodönüşümünü yeşilden kırmızıya çevirmiştir. Kontrolde kırmızı floresansın yokluğu, fotodönüşümün özellikle csChrimson aracılı nöron aktivitesi tarafından yönlendirildiğini gösterir.

Delta kırmızı ve yeşil floresans, deneysel hayvanlarda ATR kontrol olmadıklarına göre anlamlı şekilde daha yüksekti. Bu protokol, canlı gelişen hayvanlarda presinaptik uyarılmanın ardından hemen post-sinaptik yanıtların izlenmesini mümkün kılarak sinaptik ortaklığı doğrulamak için kullanılabilir. En zor adım, hayvanın doğru hareketsizleştirilmesi, hayvana zarar vermeden hareketi önlemek için yeterli baskı gerektirecektir.

Gelecekteki çalışmalar, gelişmekte olan bir hayvan sırasında belirli nöronal popülasyonlar arasında sinaptik bağlantıların izlenmesini, oluşumunu, güçlendirilmesini ve hatta ortadan kaldırılmasını mümkün kılabilir.