ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Tayvan Eğitim Bakanlığı'nın (MOE) Yüksek Eğitim Filiz Projesi (Higher Education Sprout Project) kapsamındaki Öne Çıkan Alanlar Araştırma Merkezi Programı aracılığıyla, Çin Tıp Üniversitesi Kanser Biyolojisi ve Hassas Terapi Merkezi tarafından desteklenmiştir (CBPTC-PROJ-5-2).
Fon sağladıkları ve akademik destek verdikleri için Kanser Biyolojisi ve Hassas Terapötikler Merkezi'ne teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Perou, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).</li><li>Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer.">Triple-negative breast cancer.</a> N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+Clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+distant+recurrence+and+clinical+outcomes+in+patients+with+metastatic+triple-negative+breast+cancer:+High+incidence+of+central+nervous+system+metastases.">Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases.</a> Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).</li><li>Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+landscape+of+triple-negative+breast+cancer+-+expanded+options,+evolving+needs.">Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs.</a> Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).</li><li>Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+function+of+tumor-associated+macrophages+as+a+key+determinant+of+tumor+progression+control:+A+review.">Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy.">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li><li>Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd24a+knockout+results+in+an+enhanced+macrophage-+and+cd8&#x207A;+t+cell-mediated+anti-tumor+immune+responses+in+tumor+microenvironment+in+a+murine+triple-negative+breast+cancer+model.">Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8&#x207A; t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model.</a> J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).</li><li>Majeti, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+is+an+adverse+prognostic+factor+and+therapeutic+antibody+target+on+human+acute+myeloid+leukemia+stem+cells.">CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.</a> Cell. 138 (2), 286-299 (2009).</li><li>Barkal, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24+signalling+through+macrophage+siglec-10+is+a+target+for+cancer+immunotherapy.">CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy.</a> Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24-siglec+axis+is+an+innate+immune+checkpoint+against+metaflammation+and+metabolic+disorder.">CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder.</a> Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).</li><li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+novel+role+of+CD24+as+an+oncogenesis+regulator+and+therapeutic+target+for+triple-negative+breast+cancer.">Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).</li><li>Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+CD24+function+on+tumor+and+immunotherapy.">Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy.</a> Front Immunol. 15, 1367959 (2024).</li><li>Weiskopf, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+critical+effectors+of+antibody+therapies+for+cancer.">Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer.</a> MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+antibody-dependent+cellular+phagocytosis+for+effective+macrophage-based+cancer+immunotherapy.">Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy.</a> Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Denardo, D. G., Ruffell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+regulators+of+tumour+immunity+and+immunotherapy.">Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).</li><li>Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+3d+imaging+of+phagocytosis+by+mouse+macrophages.">Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages.</a> J Vis Exp. (140), e57566 (2018).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Bu protokoldeki birkaç adım, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, PBMC izolasyonunun kalitesi ve saflığı, makrofaj verimini ve diferansiyasyon verimliliğini doğrudan etkiler. Seyreltilmiş kanın Ficoll gradyanı üzerine dikkatlice katmanlanması ve fren kapatılarak santrifüjleme yapılması, buffy coat arayüzünün korunması için gereklidir. RBC lizininin yetersiz olması veya liz tamponu ile aşırı inkübasyon, PBMC canlılığını tehlikeye atacaktır. İkinci olarak, proinflamatuar ...

Meme kanseri, dünya genelinde kadınlar arasında en sık teşhis edilen malignite olup, yıllık yaklaşık 2,3 milyon yeni vakadan sorumludur1. Hastalık klinik olarak heterojendir ve hormon reseptörlerinin —östrojen reseptörü (ER) ve progesteron reseptörü (PR)— durumuna ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) onkogeninin ekspresyonuna bağlı olarak en az dört ana moleküler alt tipe ayrılır2. Luminal A tümörleri, HER2 aşırı ekspresyonu olmaksızın ER ve/veya PR eksprese eder (ER/PR+ ve HER2−); luminal B tümörleri, ER/PR ve HER2'yi birlikte eksprese eder (ER/PR+ ve HER2+); HER2+ tümörleri, hormon reseptör durumundan bağımsız olarak yüksek HER2 ekspresyonu ile karakterizedir; ve triple-negatif meme kanseri (TNBC), üç belirtecin de ekspresyonundan yoksundur (ER−, PR− ve HER2−)2,3. Bu alt tipler arasında TNBC, klinik olarak en zorlayıcı formu temsil eder ve tüm meme kanserlerinin yaklaşık %15-20'sini oluşturur. Konvansiyonel kemoterapiye verilen zayıf yanıtlar ve etkili hedefli tedavilerin yokluğu nedeniyle, TNBC'li hastalar, en kötü prognoza ve en kısa 5 yıllık genel sağkalıma sahip olarak en agresif hastalık seyri sergilerler3,4. Ayrıca TNBC, özellikle tanıdan sonraki 5 yıl içinde akciğerlere doğru belirgin derecede yüksek bir visseral metastaz eğilimi gösterir ve ileri evre veya metastatik TNBC (mTNBC) hastalarının medyan sağkalım süresi nadiren 2 yılı aşar5,6. Bu istatistikler, TNBC için yeni terapötik stratejilere yönelik kritik ve karşılanmamış ihtiyacın altını çizmektedir.
Tümör mikroçevresi (TME), meme kanserinin ilerlemesinde ve bağışıklık sisteminden kaçışta merkezi bir rol oynar. Tümörle ilişkili makrofajlar, TME içindeki en bol bulunan bağışıklık hücreleri arasında yer alır ve son zamanlarda doğal anti-tümör bağışıklığının kritik mediyatörleri olarak kabul edilmiştir7,8,9. TAM'lar tarihsel olarak pro-inflamatuar “M1” ve pro-tümöral “M2” durumlarına ayrılmış olsa da, bu ikili model makrofaj heterojenliğinin gerçek kapsamını yakalamakta yetersiz kalmaktadır. Bunun yerine TAM'lar, TME içindeki çeşitli biyokimyasal sinyallere yanıt olarak gelişen dinamik bir fonksiyonel spektrumu doldururlar. Bu karmaşık ortamda kanser hücreleri, özellikle “beni yeme” sinyallerinin aşırı ekspresyonu gibi çeşitli bağışıklık kaçış stratejileri aracılığıyla makrofaj aktivitesini aktif olarak sabote ederler. CD47/SIRPα aksı, bu bağlamda tanımlanan ilk doğal bağışıklık kontrol noktasıydı6,10 ve daha yakın zamanda CD24, yeni ve güçlü bir antifagositik sinyal olarak ortaya çıkmıştır11,12. CD24, bir glikozilfosfatidilinositol bağı aracılığıyla hücre membranına ankrajlanmış, küçük ve yoğun glikozile edilmiş müsin tipi bir glikoproteindir13. Fizyolojik koşullar altında çeşitli bağışıklık hücresi soyçullarında eksprese edilir, ancak meme, yumurtalık, pankreas ve kolorektal kanserler dahil olmak üzere solid tümörlerde sıklıkla aşırı eksprese edilir14. Tümör hücreleri üzerindeki CD24, makrofajlarda eksprese edilen inhibitör reseptör siyalik asit bağlayan immünoglobulin benzeri lektin 10 (Siglec-10) ile etkileşime girer. Bu etkileşim, Siglec-10'un sitoplazmik kuyruğundaki immünoreseptör tirozin bazlı inhibitör motif bölgelerinin fosforilasyonunu tetikleyerek, aşağı akış fagozitik sinyalini baskılayan SHP-1 ve SHP-2 fosfatazlarını aktive eder11. CD24/Siglec-10 etkileşiminin monoklonal antikorla blokajının, CD24 eksprese eden insan tümörlerinin makrofajlar tarafından fagozitosunu güçlü bir şekilde artırdığı gösterilmiştir. Yakın zamanda yaptığımız çalışma, meme kanseri hücrelerinde CD24a'nın nakavt edilmesinin, bir murine triple-negatif meme kanseri modelinde bu hücrelerin makrofaj fagozitosuna karşı duyarlılığını artırdığını da göstermiştir9.
Antikor bağımlı hücresel fagositoz (ADCP), antikorların makrofajları tümör hücrelerini fagosite etmeleri için yönlendirdiği temel bir mekanizmadır15,16. Tümörde eksprese edilen antijenlere bağlandığında, antikorun Fc bölgesi makrofajlar üzerindeki Fcγ reseptörlerini (FcγRs) etkileyerek, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi, fagositik çukur oluşumu ve hedef hücrenin yutulması ile sonuçlanan hücre içi sinyal yolaklarını tetikler17.
Bu çalışmada, meme kanseri hücrelerinin antikor güdümlü makrofaj fagositozunu ölçmek için bir time-lapse canlı hücre görüntüleme protokolü geliştirdik ve valide ettik. Yöntem, sağlıklı insan donörlerden elde edilen, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile farklılaştırılan ve ardından lipopolisakkarit (LPS) ve interferon gama (IFN-γ) ile stimüle edilen periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) kaynaklı makrofajları kullanmaktadır. Akış sitometrisi analizi, stimülasyon sonrası CD11b⁺ popülasyonu içinde CD80'in yukarı regüle olduğunu onaylayarak (Şekil 1) klasik olarak aktive edilmiş fenotipi desteklemiştir. Bu aktivasyon durumu, güçlü bir antikor aracılı fagositik kapasite sağlar ve yöntemi antikor bağımlı hücresel fagositozu (ADCP) değerlendirmek için uygun hale getirir. GFP etiketli CD24-pozitif meme kanseri hücreleri hedef hücreler olarak görev yapar ve ko-kültür öncesinde terapötik bir anti-CD24 monoklonal antikor ile opsonize edilir. Fagositik olaylar, kontrollü çevresel koşullar altında otomatik bir mikroskop kullanılarak 16 saatlik bir süre boyunca kaydedilir. Dinamik görselleştirmeyle paralel olarak kantitatif değerlendirmeye olanak sağlamak için, özdeş ko-kültür koşulları altında ayrı bir uç nokta (endpoint) analizi gerçekleştirilir; bu da internalize olmamış hedef hücrelerin uzaklaştırılmasının ardından fagositozun titizlikle ölçülmesine imkan tanır. Bu protokol, bir anti-CD24 antikoru tarafından aracılan ADCP'yi değerlendirmek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve görsel olarak bilgilendirici bir platform sunmaktadır. Önemli bir nokta olarak, time-lapse görüntülemenin tamamlayıcı bir uç nokta bazlı kantifikasyon stratejisiyle entegrasyonu, fagositik kinetiğin ve büyüklüğün eş zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Yöntem, diğer makrofaj yönelimli immünoterapötik hedeflerin araştırılması için adapte edilebilir. Bu protokol, kanser hücrelerindeki yüzey antijenlerine karşı terapötik monoklonal antikorlar tarafından aracılan ADCP'nin değerlendirilmesi için en uygundur. Aday antikorların karşılaştırmalı taraması, doz-yanıt karakterizasyonu ve "beni yeme" sinyal blokajının (örneğin, CD47–SIRPα) etkileri dahil olmak üzere Fc–FcγR etkileşiminin mekanistik çalışmaları için oldukça uygundur. Analiz primer insan makrofajlarını kullandığından, klinik geliştirme öncesinde donörler arası değişkenliğin değerlendirilmesini gerektiren translasyonel çalışmalar için de uygundur.
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Şekil 1. Periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilen IFN-γ/LPS stimüle edilmiş makrofajların üretimi ve akış sitometrisi doğrulaması. Üst panel: Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), tüm reaktifler 20°C ± 2°C'ye önceden dengelenmiş şekilde, Ficoll solüsyonu kullanılarak 20°C'de 30 dk boyunca 400 × g'de yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile sağlıklı donörlerden izole edilir. İzole edilen PBMC'ler, makrofaj diferansiyasyonunu sağlamak için 100 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmiş ImmunoCult-SF besiyerinde 7 gün boyunca kültüre edilir (Gün 0–7) ve 5. Günde besiyeri takviyesi yapılır. 8. Günde, diferansiye olmuş makrofajlar 100 ng/mL IFN-γ ve 1 µg/mL LPS ile 48 saat boyunca stimüle edilir (Gün 8–10). Ardından hücreler akış sitometrisi analizine tabi tutulur. Alt panel: Makrofajların akış sitometrisi analizi. Hücreler, CD11b-FITC, CD80-PE ve CD206-PerCP-Cy5.5'ten oluşan bir yüzey paneli ile boyanmış, ardından ölü hücrelerin dışlanması için veri toplama öncesinde DAPI eklenmiştir. Gating stratejisi: Hücreler önce canlı hücreler (DAPI⁻) üzerinden seçilmiş, ardından makrofaj kimliğini doğrulamak için CD11b-FITC'ye karşı FSC-A grafiğinde CD11b⁺ tanımı yapılmıştır. Canlı CD11b⁺ olaylar daha sonra, IFN-γ/LPS stimülasyonu tarafından indüklenen CD80⁺CD206⁻ popülasyonunu doğrulamak için CD80'e karşı CD206 nokta grafiğinde analiz edilmiştir. Sağ: Gated hücrelerin %99,8'inin CD11b⁺ olduğunu gösteren ve makrofaj kimliğini doğrulayan CD11b-FITC'ye karşı FSC-A temsili nokta grafiği. Sol: CD11b⁺ hücrelerin çoğunluğu CD80⁺CD206⁻ kapısı (Q1: %95,2) içinde yer almış olup, bu durum uygulanan stimülasyon koşulları altında beklenen pro-enflamatuar fenotipi göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Kullanıcılar, bu tekniği uygularken birkaç kısıtlamayı göz önünde bulundurmalıdır. İlk olarak, PBMC kaynaklı makrofajlardaki donör değişkenliği, fagositoz çıktısında önemli sapmalara yol açabilir; bu nedenle, birleştirilmiş sonuçların yanında bireysel donör verilerinin de raporlandığı çoklu donör (n ≥ 3) kullanımı önerilir. İkinci olarak, 2D ko-kültür formatı tümör mikroçevresini tam olarak yansıtmaz ve bulgular, klinik çıkarımlar yapılmadan önce 3D veya in vivo modellerde doğrulanmalıdır. Üçüncü olarak, 16 saatlik görüntüleme penceresi erken fagositoz olaylarını yakalar ancak antijen sunumu veya sekonder immün aktivasyon gibi daha uzun süreli süreçleri yansıtmaz. Dolayısıyla, gerçek zamanlı görüntüleme ve uç nokta kantifikasyonunun birlikte kullanımı, ADCP ölçümlerinin hem yorumlanabilirliğini hem de tekrarlanabilirliğini artıran tamamlayıcı bir çerçeve sağlar.

<table><tbody><tr><td>0,5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) stok çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich (veya eşdeğeri)</td><td>E7889 (veya eşdeğeri)</td><td>Hücre ayırma işlemi için PBS içerisinde 10 mM EDTA çalışma çözeltisi hazırlamak amacıyla kullanılır</td></tr><tr><td>24 kuyucuklu doku kültürü plakaları (TC-işlemli)</td><td>Corning (veya eşdeğeri)</td><td>3524</td><td>Fagositoz testi sırasında makrofajların ve kanser hücrelerinin ko-kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-insan CD206 antikoru (akış sitometrisi)</td><td>BioLegend (veya eşdeğeri)</td><td>321122 (veya eşdeğeri)</td><td>Alternatif makrofaj fenotipi belirteci</td></tr><tr><td>Anti-insan CD24 monoklonal antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)</td><td>MA1-91384 (veya eşdeğeri)</td><td>Antikor bağımlı fagositoz için kanser hücrelerini opsonize etmek amacıyla kullanılır</td></tr><tr><td>Çevresel kontrol odacıklı otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi (örneğin, Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (veya dengi)</td><td>BioTek Lionheart FX Otomatik Mikroskop</td><td>Kontrollü sıcaklık ve [eksik metin] altında uzun süreli zaman atlamalı görüntülemeye olanak tanır &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; koşullar</td></tr><tr><td>Otomatik canlı hücre görüntüleme için görüntüleme yazılımı (örneğin, Gen5)</td><td>Agilent Technologies (veya eşdeğeri)</td><td>Girdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.</td><td>Time-lapse görüntüleme verilerinin elde edilmesi ve analizi için kullanılır</td></tr><tr><td>Santrifüj (salıncak kovalı rotor)</td><td>Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)</td><td>TX-1000 rotorlu (veya eşdeğeri) Multifuge X4R Pro</td><td>PBMC izolasyonu ve hücre yıkama basamakları için kullanılır</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkübatör (37&amp;deg;C, %5 &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)</td><td>Forma Doğrudan Isıtma &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; İnkübatör (veya eşdeğeri)</td><td>Hücre kültürü için fizyolojik koşulları korur</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; regülatörlü gaz kaynağı</td><td>Agilent Technologies (veya eşdeğeri)</td><td>Giriş yok.</td><td>Malzemeler &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkübatör ve görüntüleme sistemi çevresel kontrolü için</td></tr><tr><td>Konik tüpler (15 mL ve 50 mL)</td><td>Corning (veya eşdeğeri)</td><td>352070 (veya eşdeğeri)</td><td>PBMC izolasyonu, yıkama ve santrifüjleme adımları için kullanılır</td></tr><tr><td>EDTA kaplı kan toplama tüpleri (vakutaynerler)</td><td>BD Biosciences (veya eşdeğeri)</td><td>367863 (veya eşdeğeri)</td><td>Donörlerden tam kan örnekleri toplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (veya eşdeğeri)</td><td>17144003 (veya eşdeğeri)</td><td>PBMC izolasyonu için yoğunluk gradyanı medyumu</td></tr><tr><td>Akış sitometresi (örn. FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (veya eşdeğeri)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Makrofajların fenotipik analizi için kullanılır</td></tr><tr><td>Kompanzasyon boncukları (akış sitometrisi)</td><td>Biolegend (veya eşdeğeri)</td><td>424602</td><td>Tek renkli kompanzasyon kontrolleri için kullanılır</td></tr><tr><td>FITC anti-human CD11b antikoru (akış sitometrisi)</td><td>BioLegend (veya eşdeğeri)</td><td>101205 (veya eşdeğeri)</td><td>Makrofajları tanımlamak için kullanılan belirteç</td></tr><tr><td>PE anti-insan CD80 antikoru (akış sitometrisi)</td><td>BioLegend (veya eşdeğeri)</td><td>375410 (veya eşdeğeri)</td><td>Aktive makrofaj fenotipi ile ilişkili marker</td></tr><tr><td>GFP eksprese eden meme kanseri hücre hattı (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (veya eşdeğeri)</td><td>HTB-132 (veya eşdeğeri)</td><td>Fagositoz analizinde kullanılan hedef hücreler; GFP görselleştirmeyi sağlar</td></tr><tr><td>ImmunoCult-SF makrofaj besiyeri</td><td>STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)</td><td>10961 (veya eşdeğeri)</td><td>Makrofaj farklılaşması için kullanılan serumsuz ortam</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Dulbecco Modifiyeli Eagle Ortamı (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)</td><td>12100046</td><td>Kanser hücrelerinin kültürü ve resüspansiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>İzotip kontrol antikoru (IgG)</td><td>Bio X Cell (veya eşdeğeri)</td><td>BE0297 (veya eşdeğeri)</td><td>Antikor bağımlı fagositoz testi için negatif kontrol</td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (veya eşdeğeri)</td><td>L2630 (veya eşdeğeri)</td><td>IFN- ile kombinasyon halinde makrofajları aktive etmek için kullanılan stimülüs&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Rekombinant insan interferon gama (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)</td><td>78020 (veya eşdeğeri)</td><td>Makrofaj aktivasyonu için kullanılan sitokin</td></tr><tr><td>Rekombinant insan makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)</td><td>78057 (veya eşdeğeri)</td><td>Makrofaj farklılaşması için kullanılan büyüme faktörü</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri veya serolojik pipetler</td><td>Jetbiofil (veya eşdeğeri)</td><td>GSP010010 (veya eşdeğeri)</td><td>PBMC izolasyonu ve hücre kültürü sırasında sıvı aktarımı için kullanılır</td></tr><tr><td>PBS (Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-içermeyen)</td><td>Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)</td><td>BP399-500 (veya eşdeğeri)</td><td>Hücrelerin yıkanması ve dilüsyon basamakları için kullanılan tampon çözelti</td></tr><tr><td>Petri kapları (100 mm, non&amp;ndash;doku kültürü işleminden geçmiş)</td><td>Corning (veya eşdeğeri)</td><td>430591</td><td>Adherans seçimi yoluyla makrofaj farklılaşması için kullanılır</td></tr><tr><td>Kırmızı kan hücresi (eritrosit) liziz tamponu</td><td>BioLegend (veya eşdeğeri)</td><td>420301 (veya eşdeğeri)</td><td>PBMC izolasyonu sırasında kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Viability 405/452 Sabitleyici Boya</td><td>Miltenyi Biotec (veya eşdeğeri)</td><td>130-130-404 (veya eşdeğeri)</td><td>Akış sitometrisi analizi sırasında hücre canlılığını değerlendirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (veya eşdeğeri)</td><td>D9542 (veya eşdeğeri)</td><td>Akış sitometrisinde ölü hücrelerin dışlanması için kullanılır</td></tr></tbody></table>

yeşil floresan proteinle İşaretlenmiş Üçlü negatif meme kanseri hücrelerinin antikor aracılı makrofaj fagositozunun zaman atımlı görüntülenmesi

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

Antikor bağımlı hücresel fagositoz, makrofajların antikorla opsonize edilmiş kanser hücrelerini yuttuğu temel bir mekanizmadır. Bu protokol, yeşil floresan protein ile işaretlenmiş, CD24 eksprese eden triple negatif meme kanseri hücrelerinin antikor bağımlı makrofaj fagositozunu görselleştirmek için bir zaman ayarlı canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklamaktadır. Makrofajlar, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilmiş, makrofaj koloni uyarıcı faktör ile diferansiye edilmiş ve pro-inflamatuar bir fenotip oluşturmak için interferon gama ve lipopolisakkarit kullanılarak polarize edilmiştir. Kanser hücreleri, belirlenmiş bir efektör-hedef oranında makrofajlarla birlikte kültüre edilmeden önce bir anti-CD24 monoklonal antikor ile opsonize edilir. Fagositoz olayları, fizyolojik koşulları korumak için çevresel kontrol sistemine sahip otomatik bir mikroskop kullanılarak 16 h süresince kaydedilir. Görüntüleme, kanser hücrelerinin tanımlanmasına ve makrofajlar tarafından içselleştirilmelerinin izlenmesine olanak tanıyan parlak alan ve floresan kanalları kullanılarak gerçekleştirilir. Temsili zaman ayarlı görüntüler, floresan kanser hücrelerinin zamanla kademeli olarak yutulduğunu göstermektedir. Kantitatif değerlendirmeyi mümkün kılmak için, aynı ko-kültür koşulları altında paralel bir uç nokta deneyi gerçekleştirilir; burada, fagositoz olaylarının doğru ölçümüne izin vermek için görüntülemeden önce içselleştirilmemiş kanser hücreleri uzaklaştırılır. Bu yöntem, in vitro ortamda antikor kaynaklı makrofaj fagositozunu görselleştirmek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Önemli bir nokta olarak, zaman ayarlı görüntülemenin uç nokta tabanlı kantifikasyon ile entegrasyonu, fagositozun kinetiğinin ve büyüklüğünün tamamlayıcı değerlendirmesine olanak tanır. Bu protokol, kontrollü bir in vitro ortamda terapötik antikorların ve makrofaj hedefli kanser immünoterapilerinin değerlendirilmesini desteklemektedir.

PBMC'lerden makrofajların başarılı bir şekilde üretildiği ve polarize olduğu, morfolojik değerlendirme ve akış sitometrisi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 1). Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edilen PBMC'ler, M-CSF takviyeli ortamda kültüre edilmiş ve 7. güne gelindiğinde karakteristik makrofaj morfolojisine sahip adherent hücreler elde edilmiştir. IFN-γ ve LPS ile stimülasyonun ardından hücreler, uygulanan koşullar altında aktivasyonla uyumlu bir fenotip sergilemiştir. Akış sit...

Bu protokol, periferik kan mononükleer hücresi kaynaklı makrofajlar ve otomatik bir mikroskop kullanarak, yeşil floresan proteinle işaretlenmiş üçlü negatif meme kanseri hücrelerinin antikor bağımlı makrofaj fagositozunu görüntülemek için kullanılan bir zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklamaktadır.

Yeşil Floresan Proteinle İşaretlenmiş Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinin Antikor Aracılı Makrofaj Fagositozunun Zaman Atımlı Görüntülenmesi

Antikor bağımlı hücresel fagositoz, makrofajların antikorla opsonize edilmiş kanser hücrelerini yuttuğu temel bir mekanizmadır. Bu protokol, bir ... işlemini açıklamaktadır.

time-lapse-imaging-antibody-driven-macrophage-phagocytosis-green

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu videoda, bağımsız makrofaj aracılı kırmızı kan hücresi (RBC) fagositoz olaylarını izlemek için yapılan bir test gösterilmektedir. Fare immünoglobulin G (IgG) ile opsonize edilmiş insan RBC'leri fare makrofajları ile inkübe edilir ve konfokal mikroskop altında gözlenir. RBC'ler, fagositik bir kap oluşumu yoluyla makrofajlar tarafından yutulur ve lizozomal bozunma için hedeflenir.

IgG-opsonize Kırmızı Kan Hücrelerinin Makrofaj Fagositozunun Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Yeşil Floresan Proteinle İşaretlenmiş Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinin Antikor Aracılı Makrofaj Fagositozunun Zaman Atımlı Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet