Name: Heksametildisiloksan Kolaylaştırmalı Difüzyon ve İyon Seçici Elektrot Ölçümleri Kullanarak Bir Murin Modelinde Serum, Kemik ve Dişlerdeki Florürün Kantifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Öğrenin, farelerde serum, kemik ve dişlerdeki florürü hekzametildisiloksan kolaylaştırmalı difüzyon ve iyon seçici elektrot ile hassas ve tekrarlanabilir şekilde kantifiye etme yöntemini. Bu protokol, küçük biyolojik örneklerde florür ölçümü için güçlü bir analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu yayında bildirilen araştırmalar; Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) ve National Institutes of Health bünyesindeki National Institute of Dental and Craniofacial Research; R01DE027648 (M.S.) ve K02DE029531 (M.S.) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x</li>
	<li>Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O&#39;Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2</li>
	<li>Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885</li>
	<li>Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273</li>
	<li>Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279</li>
	<li>Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038</li>
	<li>Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302</li>
	<li>Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629</li>
	<li>Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.</li>
	<li>Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948</li>
	<li>Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.</li>
	<li>Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.</li>
	<li>Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200</li>
	<li>Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600</li>
	<li>Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.</li>
	<li>Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436</li>
	<li>Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495</li>
	<li>Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2</li>
	<li>Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.</li>
	<li>Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486</li>
	<li>Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.</li>
	<li>Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.</li>
	<li>Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.</li>
	<li>Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2</li>
	<li>Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.</li>
	<li>Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339</li>
	<li>Mart&#237;nez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657</li>
	<li>Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.</li>
	<li>Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.</li>
	<li>Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.</li>
	<li>Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.</li>
	<li>Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.</li>
	<li>Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.</li>
	<li>Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel&#39;s Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.</li>
	<li>Ku&#269;era J, &#352;tef&#225;nik, M. &#38; Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.</li>
	<li>Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583</li>
	<li>Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.</li>
	<li>Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.</li>
	<li>Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Florür ölçümleri, lantan florür (LaF₃) kristal membran içeren florürle seçici bir iyon seçici elektrot (ISE) kullanılarak elde edilmiştir38,39. Bu membran, diğer halidlere kıyasla florür iyonlarına karşı güçlü bir tercih sağlayan, oldukça stabil La–F bağları oluşturur. Yerleşik elektrokimya literatürüne ve üretici spesifikasyonlarına göre, LaF₃ membran klorür için çok düşük seçicilik katsayıları sergilemektedir; bu da klorür iyonlarının bu protokolde kullanılan koşullar altında ölçülebilir bir girişime neden olmadığını göstermektedir. Klorür doğal olarak dişlerde ve kemikte bulunsa da, aktivitesi elektrot potansiyelini etkilemez ve kaydedilen sinyalle özellikle florür aktivitesi yansıtılır. 0,02 ppm alt saptama sınırı, Orion florür seçici elektrot için üretici tarafından onaylanmış minimum ölçülebilir konsantrasyona karşılık gelmektedir. Bu sınır, elektrodun stabil bir Nernst yanıtı ve kalibrasyon eğrisiyle doğrusal bir ilişki sürdürdüğü en düşük florür konsantrasyonunu yansıtır. Saptama sınırı, elektrodun membran özellikleri tarafından tanımlandığı ve üretici tarafından doğrulandığı için bu protokol için ek bir deneysel belirlemeye gerek duyulmamıştır; ancak üst saptama aralığına ilişkin olarak yazarlar, 50&#160;µL NaOH tuzağındaki yaklaşık 38.000&#160;ng'i aşan florür kütlelerinin doğrusal olmayan bir elektrot yanıtına yol açtığını gözlemlemişlerdir; bu da kalibrasyon eğrisinin çok yüksek florür yüklerinde artık güvenilir olmadığını göstermektedir. Bu doğrusallık kaybı, muhtemelen ISE'nin kendi içsel üst sınırını yansıtmaktan ziyade, verilen deneysel koşullar altında elektrot için optimal iyonik şiddet ve aktivite aralığının aşılmasından kaynaklanmaktadır. Bu eşiğin üzerinde florür kütleleri içermesi beklenen numuneler için, ölçümleri elektrodun doğrusal dinamik aralığında tutmak amacıyla NaOH tuzak hacminin artırılması önerilir.
Protokol, olağandışı derecede yüksek florür içeriğine sahip örneklere uygulandığında bu husus göz önünde bulundurulmalıdır. Difüzyon basamağı tüm örnek hacmini tükettiği için, biyolojik örnekler üzerinde mükerrer ölçümler ve spike‑and‑recovery (ekleme ve geri kazanım) deneyleri gerçekleştirilememiştir. Analitik doğruluk ve kesinliği sağlamak amacıyla, bilinen florür konsantrasyonlarını içeren kalite kontrol (QC) standartları her ölçüm serisine dahil edilmiştir. Bu QC standartları, deneysel örneklerle aynı şekilde işlenmiş ve ölçülmüştür. Tüm çalıştırmalar boyunca, QC standartlarının ölçülen florür konsantrasyonları tutarlı bir şekilde beklenen değerlerin %5'i dahilinde kalmıştır. 10–20 örneklik her bir spesimen serisi için, spesimen örneklerle paralel olarak 5–6 kalibrasyon örneğinden oluşan iki bağımsız set hazırlanmış ve her ölçüm oturumu öncesinde bir kalibrasyon eğrisi kaydedilmiştir. Kalibrasyon aralığı; spesimen tipine, difüzyon kabına eklenen materyal kütlesine, hayvanın tedavi grubuna ve yaşına bağlı olarak değişen, spesimen örneklerin beklenen florür kütlelerine yakın olacak şekilde her çalıştırma için ayarlanmıştır. Serum ölçümleri için kalibrasyon standartları, spesimendeki yaklaşık 0.06–1.20 ppm florür konsantrasyonlarına karşılık gelmekteydi. Kemik ve diş ölçümleri için kalibrasyon standartları ise spesimendeki yaklaşık 19–7,600 ppm florür konsantrasyonlarına karşılık gelmekteydi.
Bu protokol, heksametildisiloksan destekli difüzyon ve ardından gelen ISE analizi kullanılarak serum, kemik ve dişlerdeki florür iyon kütlesinin miktarlarını belirlemek için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntem, çeşitli biyolojik matrislerden salınan florürü güvenilir bir şekilde yakalar ve kontrollü maruziyet sonrası florür birikiminin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. Ergen ve yetişkin farelerden elde edilen temsili sonuçlar, dokular genelindeki florür birikiminde belirgin yaş ve doz bağımlı farklılıklar olduğunu göstermekte; bu da yaklaşımın florür metabolizması ve in vivo toksikokinetiği çalışmadaki faydasını vurgulamaktadır.
Bu protokolün temel bir güçlü yönü, florür salım reaksiyonunu florür tutucu ortamdan fiziksel olarak ayıran difüzyon kaplarının kullanılmasıdır. Petrolatum ile mühürlenmiş tasarım, atmosferik değişimi minimize eder ve serbest kalan florür iyonlarının kapaktaki sodyum hidroksit damlacıkları tarafından verimli bir şekilde yakalanmasını sağlar. HMDS doyurulmuş sülfürik asit, kemik ve dişler gibi yüksek derecede kalsifiye olmuş yapılar da dahil olmak üzere mineralize dokulardan florür salınımı için güçlü ve tutarlı bir itici güç sağlar. Difüzyonla eşleştirilmiş standartlarla kalibre edilen ardından gelen ISE ölçümü, geniş bir dinamik aralıkta doğru miktar belirlemeye olanak tanır. Bu yaklaşımın bir başka avantajı ise son derece küçük biyolojik örneklerdeki florürü miktar belirleme yeteneğidir. Farelerden alınan mineralize dokular, özellikle mandibüler kesici dişler, diş başına yalnızca 3–5 mg kül verir. Geleneksel analitik yöntemler, güvenilir tespit elde etmek için genellikle daha büyük örnek kütleleri veya daha yüksek florür içeriği gerektirir. Buna karşılık, difüzyon tabanlı tasarım, tüm örnekten salınan tüm florürü küçük ve tanımlanmış bir hacimde yoğunlaştırarak, düşük mutlak florür kütlesine sahip küçük örneklerde bile doğru miktar belirlemeye imkan tanır. Bu özellik, özellikle küçük hayvanları içeren çalışmalar, sınırlı doku mevcudiyeti veya mikro-disekte edilmiş mineralize yapılar için oldukça değerlidir.
Bu yöntemin temel bir kısıtlaması, bu çalışmada kullanılan ISE'nin tespit limitidir (0.02 ppm). Florür içermeyen kontrol hayvanlarından alınan serum örnekleri sıklıkla bu eşiğin altında kalmış ve bu durum oldukça düşük florür konsantrasyonlarının miktar tayininin yapılmasını engellemiştir. Mevcutsa, difüzyon kabına eklenen numune kütlesinin veya hacminin artırılması ya da tespit limitine yakın veya altındaki eser konsantrasyonların ölçümünde alternatif analitik tekniklerin kullanılması gerekebilir. Ayrıca yöntem, gece boyunca süren bir difüzyon süreci ve korozif reaktiflerin dikkatli kullanımını gerektirir; bu durum yüksek hacimli çalışmalarda işlem kapasitesini sınırlayabilir. ISE, toplam florür miktarının hassas bir şekilde belirlenmesini sağlasa da dokular içindeki uzamsal dağılımı değerlendiremez. Mikro ve makro ölçekte florür dağılımını görselleştirmek ve haritalamak için enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi ile birleştirilmiş taramalı elektron mikroskopisi (SEM-EDX) veya parçacıkla uyarılmış gama ışını emisyonu (PIGE) gibi tamamlayıcı yaklaşımlar sisteme dahil edilebilir. Bu görüntüleme tabanlı modaliteler, mineralize veya yumuşak dokulardaki lokalize florür birikiminin değerlendirilmesine olanak tanıyarak ISE ölçümlerini tamamlar ve doku florür içeriğinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.
Bu protokolde florür difüzyonunun ve ölçümünün doğruluğu ile güvenilirliği birkaç tekrarlayan teknik faktörden etkilenebilir; gözlemlerimiz kalibrasyon hazırlığının, difüzyon kabı sızdırmazlığının, pH kontrolünün, elektrot performansının ve numune işlemenin veri kalitesini kolektif olarak nasıl şekillendirdiğini vurgulamaktadır. Lineer olmayan bir kalibrasyon eğrisi (R2 &#60; 0,99) veya beklenen aralığın dışındaki doku örneği okumalarının olası nedenleri arasında, difüzyon kabına eklenen NaF stok çözelti hacminin yanlış hesaplanması veya kalibrasyon standartlarının hazırlanması sırasındaki pipetleme hataları yer alır. Önerilen işlem: Her çalışma için en az iki bağımsız kalibrasyon numune seti hazırlayarak, bir kalibrasyon eğrisi beklenen aralığın dışına çıktığında yedek bir setin mevcut olmasını sağlayın. Difüzyon kabının sızdırmazlığının yetersiz olması, difüzyon sırasında florür kaybına neden olarak yapay olarak düşük okumalarla sonuçlanabilir. Bu durum genellikle difüzyon kabı kapağının kenarına yetersiz petrolatum uygulandığında meydana gelir. Önerilen işlem: Difüzyon kabı kapağının kenarına bol miktarda petrolatum jeli uygulayın ve tam sızdırmazlık sağlamak için sıkıca bastırın. NaOH tuzağına asetik asit çözeltisi eklerken yapılan pipetleme hataları, numune pH'ını pH 5,0 olan optimal aralığın dışına çıkarabilir ve bu da yanlış florür geri kazanımına yol açabilir. Önerilen işlem: Her numunenin pH'ını pH kağıdı ile kontrol edin ve pH 5 dışındaki tüm numuneleri atın. Kalibrasyon numuneleri ayrıca florür seçici elektrodun geçerli kayıt sınırlarının dışında kalabilir. 0,02 ppm altındaki konsantrasyonlar elektrodun saptama sınırının altındadır. Önerilen işlem: 0,02 ppm'den daha az florür içeren kalibrasyon numuneleri kullanmayın. Aksine, aşırı yüksek florür konsantrasyonlarına sahip kalibrasyon numuneleri çözeltinin iyonikleliğini değiştirebilir ve lineer olmayan elektrot yanıtları üretebilir. Önerilen işlem: Projenin başlangıcında, kullanılan özel elektrodun lineer çalışma aralığını belirlemek için geniş bir florür konsantrasyon aralığını kapsayan kalibrasyon çözeltileri hazırlayın. Eğer doku numuneleri bu lineer aralığı aşarsa, doku kütlesini azaltın veya NaOH tuzağı hacmini artırın ve pH 5'i korumak için asetik asit hacmini buna göre ayarlayın. 0,02–1 ppm aralığında lineer kalibrasyon eğrileri elde etmedeki zorluk: Yaygın bir neden elektrot yaşlanmasıdır. Eski florür seçici elektrotlar, çok düşük florür konsantrasyonlarında hassasiyetlerini kaybederler. Önerilen işlem: Florür seçici elektrodu değiştirin. Kararsız potansiyometre okumaları (sinyal kayması veya sıçramaları), genellikle elektrodun algılama yüzeyi numune çözeltisine tamamen daldırılmadığında meydana gelir. Önerilen işlem: Algılama yüzeyi sıvı numune tarafından tamamen örtülecek şekilde elektrodu indirin.
Genel olarak bu protokol, çeşitli biyolojik matrislerde florür miktarını belirlemek için kalibrasyon tabanlı, sağlam bir yaklaşım sunmakta olup; fare modellerinde florür maruziyetini, doku birikimini ve toksikolojik sonuçları araştıran çalışmalar için oldukça uygundur.

Florür doğal olarak oluşan bir anyondur ve optimal florür seviyesi dental karyosların önlenmesinde etkilidir1,2,3,4,5. Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD), karyos insidansını azaltmak ve ağız sağlığını geliştirmek amacıyla bir halk sağlığı stratejisi olarak 0.7 ppm düzeyinde toplu su florürlemesi uygulanmaktadır6. Ancak, aşırı miktarda florürün uzun süreli alımı birçok dokiyi olumsuz etkileyebilir. Yüksek florür maruziyeti mine oluşumunu bozar7,8,9, kemik oluşumunu değiştirir10 ve iskelet bütünlüğünü tehlikeye atar11.
Hücresel düzeyde florür maruziyeti; oksidatif stres12, endoplazmik retikulum stresi13, gen ekspresyonunu değiştiren epigenetik modifikasyonlar14 ve ameloblastlarda apoptoz15,16,17,18 dahil olmak üzere çeşitli metabolik bozukluklara yol açar. Küresel olarak, yer altı sularındaki yüksek florür konsantrasyonları (&gt;1.5 ppm) ciddi bir sağlık sorunu teşkil etmektedir. Yakın tarihli bir öngörücü modelleme çalışması, dünya genelinde yaklaşık 180 milyon kişinin aşırı florür maruziyetinden potansiyel olarak etkilendiğini ve en yüksek yükün Asya ve Afrika'da olduğunu tahmin etmiştir1. Florür maruziyeti, içme suyunun yanı sıra gıdalar (örneğin, deniz ürünleri; ~1.9 ppm), içecekler (örneğin, çay; 0.5–6 ppm19) ve diş macunu gibi diş ürünleri20 (1,000–1,500 ppm) aracılığıyla da gerçekleşir.
Bu nedenle, florür maruziyetini, metabolizmasını ve dokulardaki birikimini anlamak, hem terapötik faydalarının hem de potansiyel toksikolojik sonuçlarının değerlendirilmesi için esastır. İdrar, serum, kemik ve dişler dahil olmak üzere biyolojik örneklerde florürün doğru şekilde miktar tayini, bu çalışmanın kritik bir bileşenidir. Ancak, florürün kimyasal davranışı ve kalsiyum açısından zengin matrislere olan güçlü ilgisi nedeniyle ölçüm analitik olarak zorludur. Vücuttaki florürün yaklaşık %99'u kemik ve dişler gibi mineralize dokularda bulunur21. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, iyon seçici elektrot (ISE) potansiyometrisi, iyon kromatografisi, kolorimetrik analizler, titrimetrik prosedürler ve nükleer veya aktivasyon tabanlı yöntemler dahil olmak üzere çeşitli analitik teknikler geliştirilmiştir22. Bunlar arasında, heksametildisiloksan (HMDS) kolaylaştırmalı difüzyon tekniğinin florür seçici elektrot ölçümü ile birleştirilmesi; hassasiyeti, tekrarlanabilirliği ve çeşitli örnek türleriyle uyumluluğu nedeniyle biyolojik matrisler için en güvenilir ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardan biri olarak ortaya çıkmıştır23,24,25,26,27,28,29.
Çok sayıda analitik yöntemin mevcut olmasına rağmen, her yaklaşımın deneysel veya klinik araştırmalardaki kullanımını kısıtlayabilecek sınırlamaları vardır. İyon kromatografisi yüksek hassasiyet ve seçicilik sağlar, ancak özel cihazlar ve kapsamlı numune hazırlama gerektirir30,31. SPADNS (sodyum 2‑(parasülfofenilazo)‑1,8-dihidroksinaftalin-3,6‑disülfonat) yöntemi gibi kolorimetrik analizler basit ve ucuzdur, ancak bulanıklıktan ve endojen kromoforların girişimlerinden etkilenebilirler, bu da karmaşık biyolojik örneklerdeki güvenilirliklerini kısıtlar22,32,33. Titrimetrik yöntemler maliyet açısından etkili ve kolaydır, ancak çoğu biyolojik örnekte eser düzeyde florür tespiti için gereken hassasiyetten yoksundurlar34. Nükleer veya aktivasyon temelli teknikler olağanüstü hassasiyet sunar ancak reaktörlere veya hızlandırıcı tabanlı nötron kaynaklarına erişim gerektirir, bu da onları rutin laboratuvar kullanımı için pratik olmaktan çıkarır35. Buna karşılık, HMDS destekli difüzyonun ardından yapılan ISE ölçümü, hem yumuşak hem de mineralize dokulardan florürün tamamen serbest bırakılmasını sağlarken hassasiyet, maliyet ve erişilebilirlik açısından pratik bir denge sunar. Bu durum, doku miktarının sınırlı olduğu ve fare kesici dişleri gibi mineralize yapıların diş başına yalnızca 3–5 mg kül verdiği küçük hayvanlarla yapılan çalışmalar için özellikle avantajlıdır.
Difüzyon-ISE yönteminin salınan tüm florürü küçük ve tanımlanmış bir hacimde yoğunlaştırabilme yeteneği, son derece küçük örneklerde bile doğru nicel tayine olanak tanır. Bu durum, yöntemi toksikokinetik çalışmalar, doz-yanıt deneyleri ve gelişimsel aşamalar boyunca florür metabolizması araştırmaları için oldukça uygun hale getirir. Küçük kemirgenler, özellikle C57BL/6J fareler, florürün etkilerini incelemek için hayvan modelleri olarak yaygın şekilde kullanılmıştır7,9,12,29,36.
Bu protokolde yazarlar, yüksek florür dozuna (125 ppm) maruz bırakılan farelerden toplanan serum, kemik ve dişlerdeki florür miktarını, tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırarak belirlemek amacıyla HMDS destekli difüzyon tekniğini ve ardından florür seçici elektrot ölçümünü uygulamaktadırlar. Yazarlar ayrıca, florür metabolizması ve doku birikimindeki yaşa bağlı farklılıkları değerlendirmek için ergen (tedavi başlangıcında 6 haftalık) ve yetişkin (tedavi başlangıcında 18 haftalık) farelerdeki florür birikimini karşılaştırmaktadırlar. Kemirgen kesici dişleri sürekli olarak sürdüğü ve yaklaşık 7 haftalık yaşa kadar sürme ile oklüzal aşınma arasında kararlı bir dengeye ulaştığı için temsilci diş dokusu olarak alt çene kesici dişleri seçilmiştir. Bu sürekli büyüme paterni, mine gelişimi için tutarlı ve erişilebilir bir gradyan sağlayarak fare kesici dişlerini, mine oluşumu ve dental florozis araştırmaları için yaygın olarak kullanılan ve doğrulanmış bir model haline getirmektedir.

<table><tbody><tr><td>Asetik Asit, Glasiyal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>Alümina Porselen Potlar</td><td>Advalue Technology</td><td>12 mm dış çap &amp;times; 25 mm Y, AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2, d = 0,1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Boncuklu Homojenizatör</td><td>Kıyaslama</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Küt Uçlu Şırınga İğnesi</td><td>Amazon</td><td>Endüstriyel Küt Uçlu İğne, 14 G &amp;times; 0,5 inç</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>Karbondioksit</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Kimyasal Çeker Ocak</td><td>Mott Manufacturing</td><td>Model 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>D(+)-Sükroz</td><td>Thermo Scientific</td><td>Biyokimya için %99,7</td><td>177142500</td></tr><tr><td>Elektrot Dolgu Çözeltisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Dolgu Çözeltisi</td><td>900061</td></tr><tr><td>Etil Alkol Çözeltisi</td><td>Koptec</td><td>140 Proof</td><td>2401</td></tr><tr><td>Dondurucu, &amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco RDE Serisi</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Isıya Dayanıklı Eldivenler</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Clavies Biyotehlike Otoklav Eldivenleri</td><td>H13201</td></tr><tr><td>Heksametildisiloksan (HMDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091, &gt;98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker, %30</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>İyon Seçici Elektrot</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Florür ISE, Çift Kanallı</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>360 Karıştırıcı</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Mikro Spatula</td><td>Amazon</td><td>Mum Oyma Spatulası #7A, Paslanmaz Çelik</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>Kül Fırını</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermolyne Küçük Tezgah Üstü Kül Fırını, 1,3 L, FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>PBS İçinde Paraformaldehit Çözeltisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>PBS içinde %4 Paraformaldehit</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm, İşlem Görmemiş</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>Petrolatum</td><td>Thermo Scientific</td><td>Petrolatum, Beyaz, Saf</td><td>417090010</td></tr><tr><td>pH İndikatör Kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4.5&amp;ndash;10.0</td><td>92120.3</td></tr><tr><td>Porselen Kap</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand Pota, 5 mL, 20 mm Yükseklik, Yüksek Form</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>Potansiyometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Dual Star pH/ISE Metre</td><td>2115102</td></tr><tr><td>Klempli Ring Stand</td><td>VWR</td><td>Halka Kelepçe, 15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>Kemirgen Diyeti</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515, AIN-76A, &amp;frac12; Peletler</td><td>F1515</td></tr><tr><td>Makaslı Kriko</td><td>Amazon</td><td>Laboratuvar Makaslı Kriko</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Ayırma Hunisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco, Borosilikat Cam, 2 L</td><td>S89285</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>Sertifikalı ACS, Kristalize</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>Sodyum Florür</td><td>Fisher Scientific</td><td>Sertifikalı ACS, Toz</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>Beyaz Peletler</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Boncuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries, 5 mm, 100 adet</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>Sülfürik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS Derecesi</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Uygulama Solüsyonu</td><td>940909</td></tr><tr><td>Vakum Desikatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Space Saver Vakumlu Desikatör, 10 inç</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>Vakum Filtresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>Akış Şişe Üstü Filtre, PES, 90 mm, 0.2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>Değişken Hızlı Sallayıcı</td><td>MidSci</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

heksametildisiloksan kolaylaştırmalı difüzyon ve İyon seçici elektrot Ölçümleri kullanarak bir murin modelinde serum, kemik ve dişlerdeki florürün kantifikasyonu

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

Biyolojik dokulardaki florür seviyelerinin belirlenmesi, florür maruziyetini, metabolizmasını ve toksisitesini anlamak için temel önem taşır. Bu protokol, heksametildisiloksan (HMDS) destekli difüzyon ve ardından iyon seçici elektrot (ISE) analizi kullanarak serum, kemik ve dişlerdeki florür iyon kütlesini ölçmek için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Kontrollü florür tedavilerine maruz kalan farelerden serum, femoral kemik ve mandibular kesici dişler dahil olmak üzere biyolojik örnekler toplanır. Kemik ve diş örnekleri küllendirilir, öğütülür ve hidrate edilirken, serum doğrudan işlenir. Her örnek, ultra saf su içeren bir difüzyon kabına aktarılır ve florür tuzakları olarak hizmet eden sodyum hidroksit damlacıklarının bulunduğu, petrolatuminle kaplanmış bir kapakla mühürlenir. HMDS ile doyurulmuş sülfürik asit enjeksiyonu, florür salınımını ve difüzyonunu başlatarak serbest kalan florür iyonlarının tuzaklarda nicel olarak yakalanmasını sağlar. Gece boyunca süren difüzyonun ardından, florür tuzağı damlacıkları tek bir örnekte birleştirilir, gerekli pH aralığına asitlenir ve ISE ölçümü için belirlenen bir hacme ayarlanır. Bilinen florür kütleleri ile hazırlanan kalibrasyon difüzyon kapları, nicelleştirme için bir standart eğri oluşturur ve kalite kontrol örnekleri elektrot stabilitesini doğrular. 0 veya 125 ppm florüre maruz kalan ergen ve yetişkin farelerden elde edilen temsili sonuçlar, yöntemin serum, kemik ve dişlerdeki florür seviyelerindeki yaşa ve doza bağlı farkları tespit etme yeteneğini göstermektedir. Bu protokol, çeşitli biyolojik matrislerde florürü nicelleştirmek için sağlam, kalibrasyon tabanlı bir yaklaşım sunar ve fare modellerinde florür maruziyeti, doku birikimi ve toksikolojik sonuçları inceleyen çalışmalar için oldukça uygundur. Bu yöntemin temel avantajı, difüzyon işleminin salınan tüm florürü 100&#160;µL'den daha küçük ölçülebilir bir örnek hacmine konsantre etmesi sayesinde, tekil fare kesici dişlerinden elde edilen 3–5 mg kül dahil olmak üzere son derece küçük örneklerde florürü doğru bir şekilde nicelleştirebilmesidir.

Biyolojik materyallerdeki florür (F-) konsantrasyonlarının ölçümünde bu protokolün uygulamasını göstermek için, kontrollü florür tedavilerine maruz bırakılan farelerden toplanan serum, kemik ve alt çene kesici diş örneklerinden numuneler oluşturulmuştur. Erkek C57BL/6J fareleri, adolesan (6 hafta) ve yetişkin (18 hafta) olmak üzere iki yaş kategorisine ayrılmış ve 6 haftalık maruziyet süresince ya florür içermeyen deiyonize su (0 ppm F⁻) ya da sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F⁻) ile beslenmişlerdir. Her yaş ve tedavi koşulu beş hayvanı kapsamıştır. Maruziyet süresinin sonunda serum, femurlar ve alt çene kesici dişler toplanmış; numuneler protokole uygun olarak hazırlanmış ve analiz edilmiştir. Serum, kemik ve dişlerde ölçülen temsili florür konsantrasyonları aşağıda özetlenmiştir.
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
Şekil 4Serumda, femoral kemikte ve mandibular kesici dişlerde ölçülen florür konsantrasyonları. Erkek C57BL/6J fareler, ergen (6 haftalık, boş çubuk) ve yetişkin (18 haftalık, dolu çubuk) olmak üzere iki yaş kategorisine ayrılmış ve hayvanlara ya florürsüz deiyonize su (0 ppm F&#8315;) veya sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F&#8315;) 6 haftalık bir maruziyet süresi boyunca. Maruziyet süresinin sonunda, aynı tedavi gruplarının (A) serumundaki, (B) femur kemiğindeki ve (C) mandibular kesici dişlerindeki florür seviyeleri ölçüldü. Tespit limitinin altındaki serum değerleri (&#60;0,02 ppm) görselleştirme için grafiğe dökülmüş ancak istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. Veriler ortalamalar olarak ifade edilmiştir &#177; SD. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni-Dunn düzeltmeli Mann-Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grup). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Serumdeki florür konsantrasyonları 
0 ppm florür ile tedavi edilen hem ergen hem de yetişkin gruplarında, serum florür konsantrasyonları iyon seçici elektrodun saptama sınırının altında kalmıştır (&#60;0.02 ppm). 125 ppm tedavi gruplarında serum florürü, ergen grubunda 0.3 ± 0.2 ppm'e ve yetişkin grubunda 0.7 ± 0.2 ppm'e yükselmiştir (p = 0.06). 125 ppm tedavi gören ergen ve yetişkin grupları arasındaki karşılaştırma, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmesi içeren Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/grup). 0 ppm tedavi grupları istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. (Şekil 4A, Tablo 1).
Femoral kemikteki florür konsantrasyonları 
0‑ppm tedavi gruplarında, femoral florür konsantrasyonları ergenlerde (292 ± 39 ppm), yetişkin hayvanlara (896 ± 55 ppm) kıyasla anlamlı derecede düşükleydi (p &#60; 0.01). Buna karşın, 125‑ppm gruplarında, ergenlerdeki florür konsantrasyonları (4,108 ± 482 ppm), yetişkin hayvanlara (2,966 ± 612 ppm) göre anlamlı derecede daha yüksekti (p = 0.04). Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/grup). (Şekil 4B, Tablo 1). Şekil 5A, her yaş grubu için 0‑ppm ve 125‑ppm tedavileri arasındaki femoral florürdeki kat değişimini göstermektedir. Ergenler 125 ppm'de florür seviyelerinde 14 katlık bir artış sergilerken, yetişkin fareler 3 katlık bir artış göstermiştir.
Mandibular kesici dişlerdeki florür konsantrasyonları 
0 ppm gruplarında, mandibular kesici diş florür konsantrasyonları ergenlerde (35 ± 4 ppm), yetişkin hayvanlara (123 ± 23 ppm) kıyasla anlamlı derecede düşük çıkmıştır (p = 0.03). 125 ppm tedavi gruplarında, kesici diş florür konsantrasyonları ergenlerde 5641 ± 955 ppm'e, yetişkin hayvanlarda ise 4392 ± 1694 ppm'e yükselmiştir. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmesi uygulanmış Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/grup). (Şekil 4C, Tablo 1). 125 ppm'deki mutlak florür konsantrasyonları yaş grupları arasında anlamlı bir farklılık göstermese de, 0 ppm'den 125 ppm'e olan kat değişim ergen farelerde (161 kat artış), yetişkin farelere (36 kat artış) göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur (Şekil 5B).
<img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
Şekil 5: Ergen fareler, kemik ve kesici diş florür birikiminde yetişkin farelere göre daha yüksek bir kat artış sergiler. Ergen (boş çubuk) ve yetişkin (dolu çubuk) farelerde 0 ppm'den 125 ppm florür tedavisine kadar florür konsantrasyonlarındaki kat değişimi. (A) Aynı tedavi gruplarından femoral kemik ve (B) mandibular kesici diş. Veriler ortalamalar ± SD olarak ifade edilmiştir. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar eşleştirilmemiş t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. * p &#60; 0.05, (N = 5/grup). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Örnek</td>
			<td colspan="4">Serum</td>
			<td colspan="4">Femur</td>
			<td colspan="4">Alt Çene Kesici Dişi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yaş Grubu</td>
			<td colspan="2">Ergen</td>
			<td colspan="2">Olgun</td>
			<td colspan="2">Ergen</td>
			<td colspan="2">Olgun</td>
			<td colspan="2">Ergen</td>
			<td colspan="2">Olgun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedavi Grubu</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>324</td>
			<td>4576</td>
			<td>933</td>
			<td>3081</td>
			<td>37</td>
			<td>4824</td>
			<td>161</td>
			<td>3229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.1</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>229</td>
			<td>3778</td>
			<td>924</td>
			<td>3326</td>
			<td>39</td>
			<td>5451</td>
			<td>127</td>
			<td>2654</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300</td>
			<td>4683</td>
			<td>877</td>
			<td>3713</td>
			<td>31</td>
			<td>5544</td>
			<td>112</td>
			<td>6997</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.4</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>323</td>
			<td>3832</td>
			<td>807</td>
			<td>2519</td>
			<td>35</td>
			<td>5114</td>
			<td>103</td>
			<td>4169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>283</td>
			<td>3669</td>
			<td>937</td>
			<td>2192</td>
			<td>Metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni giriniz.</td>
			<td>7271</td>
			<td>111</td>
			<td>4909</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortalama</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>292</td>
			<td>4108</td>
			<td>896</td>
			<td>2966</td>
			<td>35</td>
			<td>5641</td>
			<td>123</td>
			<td>4392</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>YOK</td>
			<td>0.2</td>
			<td>39</td>
			<td>482</td>
			<td>55</td>
			<td>612</td>
			<td>3</td>
			<td>955</td>
			<td>23</td>
			<td>1694</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Serum, femoral kemik ve mandibuler kesici dişlerdeki bireysel florür ölçümleri. Tablo 1, 0 ppm veya 125 ppm florüre maruz bırakılan ergen ve yetişkin farelerin serum, femoral kemik ve mandibuler kesici diş örneklerinde ölçülen bireysel florür konsantrasyonlarını (ppm F⁻) listelemektedir. Her doku tipi için veriler, dört tedavi grubuna karşılık gelen sütunlarda sunulmuştur: ergen 0 ppm, ergen 125 ppm, yetişkin 0 ppm ve yetişkin 125 ppm. Her sütun, beş bireysel kaydedilen değeri (N = 5) ve ardından hesaplanan ortalamayı ve standart sapmayı (SD) içermektedir. Ergen 0 ppm serum grubunda, tüm kaydedilen değerler iyon seçici elektrodun saptama sınırının altındaydı (&#60;0.02 ppm). Tablo, Şekil 4'te gösterilen özet değerlerin ve istatistiksel karşılaştırmaların temelini oluşturan ham sayısal verileri sağlamaktadır.

Bu protokol, heksametildisiloksan (HMDS) destekli difüzyon kaplarının hazırlanmasını ve ardından farelerin serum, kemik ve dişlerindeki florür iyon kütlesini belirlemek için iyon seçici elektrot ölçümlerini tanımlamaktadır. Bu yöntem, biyolojik örneklerdeki florür birikimini değerlendirmek için kalibrasyon tabanlı ve hassas bir yaklaşım sunar.

Heksametildisiloksan Kolaylaştırmalı Difüzyon ve İyon Seçici Elektrot Ölçümleri Kullanarak Bir Murin Modelinde Serum, Kemik ve Dişlerdeki Florürün Kantifikasyonu

Biyolojik dokulardaki florür seviyelerinin nicelleştirilmesi; florür maruziyetini, metabolizmasını ve toksisitesini anlamak için gereklidir. Bu protokol, bir ...

Araştırmamız, florür tedavisi uygulanmış farelerin serum, kemik ve dişlerindeki florür konsantrasyonunun miktar tayinine odaklanmaktadır. Mevcut yöntemler büyük örneklemler veya pahalı cihazlar gerektirmektedir. Bu protokol, mikrolitre veya miligram düzeyindeki örneklerde florür ölçümü yapmaktadır.Başlamak için, sodyum florür takviyeli veya florürsüz içme suyu verilen ergen ve yetişkin C57BL/6J farelerinden bacak kemiklerini çıkarın. Kurutmanın ardından, kemiği bir alümina potaya aktarın, ardından saatte 150 °C ısıtma hızı kullanarak, 600 °C'deki bir kül fırınında altı saat boyunca küllendirin.60x15 mm boyutunda işlem görmemiş bir Petri kabını temiz bir yüzeye yerleştirin. Isıtılmış 18 gauge bir şırınga iğnesi kullanarak, Petri kabının kapağında küçük bir delik açın. Ardından, ucu küt 14 gauge bir iğne takılmış 10 ml'lik bir şırınga ile Petri kabı kapağının iç kenarını kesintisiz bir petrolatum sızdırmazlık tabakasıyla kaplayın. Bir mikro spatula kullanarak, 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüpleri içindeki külleşmiş kemikleri ince bir toz haline gelene kadar öğütün ve toz haline getirilmiş kemik külünü hemen işleme alın. Kemik külü ile kontamine olmuş sarf malzemelerini kurumun kimyasal atık akışına uygun şekilde bertaraf edin. Statik yükü minimize etmek ve toz dağılımını önlemek için öğütülmüş kemik külünü küçük bir porselen kaba aktarın. Ardından, Petri kabının boş alt kısmını, okunabilirliği en az 0,1 mg olan bir analitik teraziye yerleştirin. Bir mikro spatula kullanarak yaklaşık 5 mg kemik külü ekleyin ve kesin ağırlığı kaydedin. Tartılan külü derhal 3 ml ultrapure su ile kapatın.Florür tuzağı oluşturmak için, Petri kabı kapağının kenarından uzak iç yüzeyine, üç damla halinde 50 µL 0,05 normal sodyum hidroksit ekleyin. Sodyum hidroksit damlacıklarını bozmadan Petri kabı kapağını ters çevirin. Kapağı, petrolatum ile Petri kabının tabanına sıkıca mühürleyin. Eş hacimlerde altı normal HMDS-doymuş sülfürik asit ve ultrapure su karıştırarak üç normal HMDS-doymuş sülfürik asit çözeltisi hazırlayın. Hazırlanan çözeltiden 3 mL'yi, 20-gauge iğne takılmış 10 mL'lik bir şırıngaya hemen çekin. Çözeltiyi kapağın üzerindeki delikten, difüzyon kabının tabanındaki suya enjekte edin. Kapağın iç yüzeyine asit sıçratmadan iğneyi dikkatlice geri çekin. Enjeksiyon deliğini bir miktar petrolatum ile hızla ve tamamen kapatın. Difüzyon kaplarını düşük hıza ayarlanmış bir değişken sallayıcıya (variable rocker) yerleştirin ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin.Ölçümlere başlamadan önce, doldurulmuş iyon seçici elektrodu tutucuya yerleştirin ve potansiyometreye bağlayın. İşlem görmemiş bir Petri kabını, elektrodun algılama yüzeyinin altına, bir makaslı krik üzerine yerleştirin ve algılama yüzeyinin kabın tabanına paralel olduğundan emin olun. Petri kabı elektroda neredeyse değene kadar makaslı krik tablasını kaldırın. İnkübasyon süresinin ardından, difüzyon kabını sallayıcıdan çıkarın. Petrolatum mühürünü kırarak kapağı dikkatlice kaldırın. Ardından, üç florür tutucu damlayı bozmadan kapağı düz bir yüzeye ters çevirerek yerleştirin. Sonra, bir P20 pipet kullanarak florür tutucu damlalardan birine 15 ila 20 µL 0.2 normal asetik asit ekleyin ve pipet ucunu değiştirmeden üç damlanın tamamını tek bir damlada birleştirin. Birleştirilmiş örneği ters çevrilmiş kapak üzerinde tutun. Bir P100 pipeti 75 µL'ye ayarlayın. Hava girişi olmadan florür tutucu hacminin tamamını aspire edin ve ultrapure su kullanarak örnek hacmini tam olarak 75 µL'ye ayarlayın. Ölçüme hemen geçin. Örneği, florür seçici elektrodun algılama yüzeyi ile Petri kabı arasına dağıtın. Algılama yüzeyinin tamamının, Petri kabına temas etmeden sıvıya gömüldüğünden emin olun. Okumanın stabilize olmasını bekleyin ve ardından potansiyometre ekranından elektrot potansiyelini mV cinsinden kaydedin.Florürsüz içme suyu verilen farelerde, efemer florür konsantrasyonu ergen farelerde yetişkin farelere göre anlamlı derecede daha düşüktü. Buna karşılık, 125 ppm florüre maruz kalma bu örüntüyü tersine çevirmiş ve ergen farelerde femural florür konsantrasyonları yetişkin farelere göre anlamlı derecede daha yüksek çıkmıştır. Florür maruziyeti sonrası ergen farelerde femural florür konsantrasyonunda 14 katlık bir artış görülürken, yetişkin farelerde daha düşük bir artış olan üç katlık bir artış gözlemlenmiştir.Bu protokol, çok küçük örnek hacimlerinde serum ve mineralize dokulardaki florür konsantrasyonlarını doğru bir şekilde ölçer. Hassas bir şekilde tartılan külün difüzyon kabına tamamen aktarılması kritik öneme sahiptir; çünkü meydana gelebilecek herhangi bir kayıp sonuçları tehlikeye atar. Gelecekteki çalışmaların, florür birikiminin doku sağlığını, hastalık riskini ve yaşlanmayı nasıl etkilediğini ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanacağını umuyoruz.

quantification-fluoride-serum-bone-teeth-murine-model-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır...

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Hücre zarlarındaki taşıyıcılar, iyonların hücre zarları veya hücre katmanları boyunca diferansiyel ayrışmasına izin verir ve doku fizyolojisi, onarımı ve patolojisi sırasında çok önemli roller oynar. Tek hücrelerde ve dokularda spesifik iyon akışlarının in vivo olarak ölçülmesine izin veren iyon seçici kendinden referanslı mikroelektrotu açıklıyoruz.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Nükleer zarf proteinleri birçok temel biyolojik süreçte merkezi bir rol oynar ve çeşitli insan hastalıklarında rol oynamıştır.  Bu protokol, LINC komplekslerinin bozulmasının uzay-zamansal kontrolüne izin veren yeni bir Cre/Lox tabanlı fare modelini açıklar.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

İmmünohistokimya, dokulardaki protein lokalizasyonunu ve ekspresyonunu değerlendirmek için güçlü bir laboratuvar tekniğidir. Kantitasyon için mevcut yarı otomatik yöntemler öznelliği ortaya çıkarır ve çoğu zaman tekrarlanamaz sonuçlar yaratır. Burada, multispektral görüntüleme kullanılarak çoğullanmış immünohistokimya ve protein ekspresyonunun objektif kantitasyonu ve ko-lokalizasyonu için yöntemler tanımlanmıştır.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Farklı seviyelerde ve sıvı kesme paternlerinin endotelyal gen ekspresyonu, fenotipi ve hastalığa yatkınlığı modüle ettiği bilinmektedir. 'Kesme halkalarının' montajını ve kullanımını tartışıyoruz: tek yönlü, periyodik kesme gerilimi modelleri üreten bir model. Kesme halkalarının montajı kolaydır, ekonomiktir ve yüksek hücre verimi sağlayabilir.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Öğrenin, farelerde serum, kemik ve dişlerdeki florürü hekzametildisiloksan kolaylaştırmalı difüzyon ve iyon seçici elektrot ile hassas ve tekrarlanabilir şekilde kantifiye etme yöntemini. Bu protokol, küçük biyolojik örneklerde florür ölçümü için güçlü bir analiz sağlar.

Heksametildisiloksan Kolaylaştırmalı Difüzyon ve İyon Seçici Elektrot Ölçümleri Kullanarak Bir Murin Modelinde Serum, Kemik ve Dişlerdeki Florürün Kantifikasyonu (Video) | JoVE Journal

Heksametildisiloksan Kolaylaştırmalı Difüzyon ve İyon Seçici Elektrot Ölçümleri Kullanarak Bir Murin Modelinde Serum, Kemik ve Dişlerdeki Florürün Kantifikasyonu

Daha fazla video keşfet