Mikroglial Parametreleri Haritalama Yazılımı (MMPS): Nicel Mikroglia Morfoloji Analizi için Açık Kaynaklı, Kullanıcı Dostu Bir Araç

Mikroglial parametre yazılımını haritalamak, ferroptozun iskemik felç sonrası mikroglial alt popülasyonları nasıl değiştirdiğini incelememize olanak tanır. MMPS, mikrogliyal analiz alanındaki temel darboğazları gidererek, karmaşık yazılım gereksinimlerini ve gerekli kodlama bilgisini aşar. Başlamak için, bilgisayarda GitHub deposunu açın ve Mapping Microglial Parameters Software veya MMPS bağımsız paketini indirin.

İndirmeler klasöründe, sıkıştırılmış klasörü otomatik olarak açmak için arşiv aracını başlatmak için çift tıklayın. MMPS paketini doğrulamak ve açmak için çıkarılmış MMPS uygulama simgesine çift tıklayın. Resim klasörünü seç seçeneğine tıklayın ve proje dosyalarını bulmak için bilgisayarın dizininde gezinin.

Klasör erişim izinlerini verin ve resim depolama dizinini seçin. Sonra, çıktı klasörü seç seçeneğine tıklayın, ardından çıktı dizinini seçin. İşlenecek görüntüyü seçin ve ardından görsel etiketlemeyi seçin.

Hayvan tanımlayıcılarını ve tedavi gruplarını görüntüye atayın ve girdileri kaydedin. Görüntünün piksel boyutunu hesaplamak için, ölçek çubuğundan kalibrasyon seçeneğini seçin. Ölçek çubuğunun başlangıç ve bitiş noktalarını seçin, bilinen ölçek çubuğu mesafesini mikrometre cinsinden girin ve uygula tuşuna tıklayın.

Mikrogliyal sinyalin bulunduğu floresans kanalını seçin. Her görüntü adının yanındaki kutuyu işaretleyerek işleme için görüntüleri seçin ve arka plan floresansı farklıysa, onları ayrı ayrı işleyin. Orijinal, önizleme, işlenmiş ve maske sekmelerini inceleyerek görüntü işleme aşamalarını karşılaştırın.

Ek işlem ayarlarını ayarlamak için mevcut görüntüyü önizlemeyi seçin. Arka plan çıkarma için, yuvarlanan top değerini beş ile 150 piksel arasında ayarlayın. Aydınlatma artefaktlarını azaltmak için, üç denoizasyon değeri kullanın ve kenar tanımını artırmak için keskinleştirme değerlerini bir ile iki arasında ayarlayın.

Görüntü işleme ayarlarının optimize edilmesinden sonra, seçilmiş görüntüleri işle seçeneğine tıklayın. Sonra, tüm resimleri seç somas'ı seçin. RGB kompozit görünüm için renk C'yi göster seçeneğine tıklayın.

Kanalları seçin, sonra görüntü renginde bozulmuş görünürse kullanılmayan kanalları kaldırın. RGB görünümünde kanal parlaklığını ayarlamak için ekran ayarlarına tıklayın. DAPI ve iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü bir veya IBA1 kololokalizasyonunu gösteren mikroglia somalarını seçin.

Yanlış seçilmiş Soma'yı geri alan veya sil tuşuyla kaldırın. Bir sonraki görsele geçmek için enter veya return tuşuna basın. Soma seçimi tamamlandıktan sonra tüm taslak somaları seçin.

Seçilen her mikroglia hücresinin soma çevresini en az sekiz kontur noktası ile çizin, hücresel süreçler hariç tutuluyor. Yanlış yerleştirilmiş kontur noktalarını son noktayı geri al, sil veya geri alan ile kaldırın. Her soma taslağını kesinleştirmek için enter, return, çift tıklama veya sağ tık tuşlarına basın.

Soma taslağını tamamladıktan sonra tüm maskeleri oluştur tuşuna tıklayın. Maske oluşturma ayarlarında, arka plan piksellerini azaltmak ve arka plan bastırma ile dal korumasını dengelemek için minimum yoğunluğu ayarlayın. Maske kalite güvencesine başlamak için tüm maskeleri QA seçin ve en büyük alanlardan en küçük alanlara sunulan tüm maskeleri gözden geçirin.

Her maskeyi, işlenmiş ve maske sekmelerini kullanarak ilgili mikroglia ile karşılaştırın. Maskeleri kabul etmek için A klavye kısayolunu kullanın. Maskeleri reddetmek için R klavye kısayolunu kullanın.

Kabul veya reddi geri almak için B tuşuna basın. Maske boyutları arasında gezinmek için klavye ok tuşlarını kullanın. Komşu hücreler, aşırı arka plan, görüntü sınırları veya ölçek çubukları içermeden mikroglial dallanmayı doğru şekilde yakalayan en büyük kabul edilebilir maske seçin. Çoğu doğru değilse, farklı eşik değeriyle maskeleri yeniden oluşturmak için tüm maskeleri temizleme seçeneğini kullanın.

Sonra, kabul edilen maskeler için çeşitli parametreleri hesaplamak için basit özellikleri hesapla seçeneğini seçin, sonra tamam tuşuna tıklayın. Ek analiz için fractalanalysisimagej indirin. Py, Sholl.

py ve skeletonanalysisimagej. Py eklentileri. Fraktal ve gövde analizleri için, fraktal analizini aç ve çalıştır.

py bir Fiji eklentisi olarak kullanıldı. Sonra çıkış dizinini girin. Piksel boyutunu girin ve hücre başına kabul edilen en büyük maske seçeneğini analiz etmek için en büyük maske seçeneğini seçin.

Sholl analizi için open sholl. py bir Fiji eklentisi olarak kullanıldı. Çıkış dizin konumunu, istenen piksel boyutunu, adım boyutunu girin.

Başlangıç yarıçapı olarak soma yarıçapını kullanın veya MMPS'den türetilen soma yarıçapları kullanılmıyorsa sabit bir soma yarıçapı girin. Açık iskelet analiziimagej. py, iskelet analizi için bir Fiji eklentisi olarak kullanıldı.

Maske dizini, çıkış dizini ve piksel boyutu için yolları gezdirip girin. Bitirdikten sonra, eklenti tarafından oluşturulan tüm sonuçları virgülle ayrılmış değerler dosyası olarak özel çıktı dizinlerine aktarın. MMPS'nin lipopolisakkarit veya LPS kaynaklı kemirgen nöroinflamasyon modeli kullanılarak yapılan doğrulama çalışması, LPS uygulamasının araçla tedavi edilen kontrollere kıyasla ortalama centroid mesafesini ve hücre çevresini anlamlı şekilde azalttığını göstermiştir.

Tedavi grupları arasında maske alanı, yuvarlaklık veya eksantriklik açısından anlamlı farklar gözlemlenmedi. LPS ile tedavi edilen hayvanlarda, aktivasyonla ilişkili glial hücrelerin morfolojik yeniden modellenmesine uygun araç kontrollerine kıyasla soma alanı anlamlı şekilde artmıştır. Daha sonra ise, gelişmiş morfolojik analizler, araçla tedavi edilen sıçanlarda mikroglia yuvarlaklığı ve çevresi arasında yalnızca zayıf bir korelasyon ve LPS ile tedavi edilen sıçanlarda güçlü bir korelasyon göstererek, artan mikroglial aktivasyonun azalmış yuvarlaklık ve çevre ile ilişkisini göstermektedir.

Ayrıca, maske alanı, hem araç hem de LPS ile tedavi edilen gruplarda ortalama centroid mesafeyle güçlü pozitif korelasyonlar gösterdi ve mikroglial aktivasyonla bağlantılı dallanma değişiklikleriyle uyumludur. Bu protokol, araştırmacıların karmaşık mikroglial dallanma, morfolojik homojenlik ve yapısal karmaşıklığı incelemelerine olanak tanır. MMPS'nin doğru kullanımı için yüksek çözünürlüklü immünofluoresan görüntüler elde etmek kritik öneme sahiptir.

Gelecekteki çalışmalar, MMPS'yi kullanarak ferroptotik inhibitörlerin inme gibi farklı sinir sistemi hastalıklarının ardından mikrogliyal morfolojiyi nasıl değiştirdiğini inceleyebilir.