Name: Mantarlardaki Türler Arası Etkileşimler Sırasında Morfometrik Çalışmalar İçin Temassız Ko-Kültür Deneyleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, temassız ko-kültür deneyleriyle mantarların türler arası etkileşimlere morfolojik yanıtlarını nasıl ölçebilirsiniz. Membran insert ve hücreden süpernatant yöntemleriyle mikrobiyal iletişimi kolayca inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, RNP'ye verilen DBT-Wellcome Trust India Alliance Intermediate Fellowship (IA/I/19/1/504294) tarafından desteklenmiştir. KBSS, Ahmedabad University Special Research Grant (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) ve SERB-Core Research Grant (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27) tarafından desteklenmiştir. Şekil 1'de kullanılan simgeler, CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) altında lisanslanmış Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) ve BioArt Source, NIAID, NIH'den uyarlanmıştır.

<ol>
	<li>Peleg AY, Hogan DA, Mylonakis E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat Rev Microbiol. 2010;8(5):340-349.</li>
	<li>Waters CM, Bassler BL. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005;21:319-346.</li>
	<li>Foster KR, Bell T. Competition, not cooperation, dominates interactions among culturable microbial species. Curr Biol. 2012;22(19):1845-1850.</li>
	<li>Carolus H, Van Dyck K, Van Dijck P. Candida albicans and Staphylococcus species: a threatening twosome. Front Microbiol. 2019;10:2162.</li>
	<li>Pasman R, et al. Candida albicans and Staphylococcus aureus reciprocally promote their virulence factor secretion and pro-inflammatory effects. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1629373.</li>
	<li>Grandcl&#233;ment C, Tanni&#232;res M, Mor&#233;ra S, Dessaux Y, Faure D. Quorum quenching: role in nature and applied developments. FEMS Microbiol Rev. 2016;40(1):86-116.</li>
	<li>Goers L, Freemont P, Polizzi KM. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J R Soc Interface. 2014;11(96):20140065.</li>
	<li>Burmeister A, Gr&#252;nberger A. Microfluidic cultivation and analysis tools for interaction studies of microbial co-cultures. Curr Opin Biotechnol. 2020;62:106-115.</li>
	<li>Kapoore RV, Padmaperuma G, Maneein S, Vaidyanathan S. Co-culturing microbial consortia: approaches for applications in biomanufacturing and bioprocessing. Crit Rev Biotechnol. 2022;42(1):46-72.</li>
	<li>Kalluri R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 2016;16(9):582-598.</li>
	<li>Deveau A, et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiol Rev. 2018;42(3):335-352.</li>
	<li>Temkin MI, Carlson CM, Stubbendieck AL, Currie CR, Stubbendieck RM. High throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions. J Vis Exp. 2019;(152). doi:10.3791/60275.</li>
	<li>Cecchelli R, et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 2014;9(6):e99733.</li>
	<li>Wodzanowski KA, Cassel SE, Grimes CL, Kloxin AM. Tools for probing host-bacteria interactions in the gut microenvironment: from molecular to cellular levels. Bioorg Med Chem Lett. 2020;30(10):127116.</li>
	<li>Luo Y, McAuley DF, Fulton CR, Pessoa JS, McMullan R, Lundy FT. Targeting Candida albicans in dual-species biofilms with antifungal treatment reduces Staphylococcus aureus and MRSA in vitro. PLoS One. 2021;16(4):e0249547.</li>
	<li>Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Transwell in vitro cell migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.</li>
	<li>McCarty NS, Ledesma-Amaro R. Synthetic biology tools to engineer microbial communities for biotechnology. Trends Biotechnol. 2019;37(2):181-197.</li>
	<li>Virgo M, Mostowy S, Ho BT. Emerging models to study competitive interactions within bacterial communities. Trends Microbiol. 2025;33(6):688-700.</li>
	<li>Moutinho TJ, Panagides JC, Biggs MB, Medlock GL, Kolling GL, Papin JA. Novel co-culture plate enables growth dynamic-based assessment of contact-independent microbial interactions. PLoS One. 2017;12(8):e0182163.</li>
	<li>Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 2008;103(11):1204-1219.</li>
	<li>Hogan DA, Vik &#197;, Kolter R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 2004;54(5):1212-1223.</li>
	<li>Poon Y, Hui M. Inhibitory effect of lactobacilli supernatants on biofilm and filamentation of Candida albicans, Candida tropicalis, and Candida parapsilosis. Front Microbiol. 2023;14. doi:10.3389/fmicb.2023.1105949.</li>
	<li>Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662-1668.</li>
	<li>Huh D, et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 2013;8(11):2135-2157.</li>
	<li>Bhatia SN, Ingber DE. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 2014;32(8):760-772.</li>
	<li>Itani A, Shida Y, Ogasawara W. A microfluidic device for simultaneous detection of enzyme secretion and elongation of a single hypha. Front Microbiol. 2023;14:1125760.</li>
	<li>Beneyton T, Thomas S, Griffiths AD, Nicaud JM, Drevelle A, Rossignol T. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microb Cell Fact. 2017;16:18.</li>
	<li>Xu XL, et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host Microbe. 2008;4(1):28-39.</li>
	<li>Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) medium (liquid or solid). Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(8):pdb.rec090563.</li>
	<li>Parnandi VA, Trivedi PM, Panchal H, Suryawanshi G, Patkar RN. A small Candida glabrata protein promotes hyphal growth in C. albicans during mixed-species invasive candidiasis. Curr Biol. 2026;36(1):1-15.e9.</li>
	<li>Davis-Hanna A, Piispanen AE, Stateva LI, Hogan DA. Farnesol and dodecanol effects on the Candida albicans Ras1-cAMP signalling pathway and the regulation of morphogenesis. Mol Microbiol. 2008;67(1):47-62.</li>
	<li>Polke M, et al. A functional link between hyphal maintenance and quorum sensing in Candida albicans. Mol Microbiol. 2017;103(4):595-617.</li>
	<li>Su C, Yu J, Sun Q, Liu Q, Lu Y. Hyphal induction under the condition without inoculation in Candida albicans is triggered by Brg1-mediated removal of NRG1 inhibition. Mol Microbiol. 2018;108(4):410-423.</li>
	<li>Senesi N, Wilkinson KJ. Biophysical Chemistry of Fractal Structures and Processes in Environmental Systems. Chichester: John Wiley &#38; Sons; 2008: ISBN: 978-0-470-01474-5.</li>
	<li>Bayry J, Aimanianda V, Guijarro JI, Sunde M, Latg&#233; JP. Hydrophobins&#8212;unique fungal proteins. PLoS Pathog. 2012;8(5):e1002700.</li>
	<li>Ojkic N, Serbanescu D, Banerjee S. Surface-to-volume scaling and aspect ratio preservation in rod-shaped bacteria. eLife. 2019;8:e47033.</li>
	<li>Li X, de Souza RA, Heinemann M. The rate of glucose metabolism sets the cell morphology across yeast strains and species. Curr Biol. 2025;35(4):788-798.e4.</li>
	<li>Mochizuki S, Minami E, Nishizawa Y. Live-cell imaging of rice cytological changes reveals the importance of host vacuole maintenance for biotrophic invasion by blast fungus, Magnaporthe oryzae. MicrobiologyOpen. 2015;4(6):952-966.</li>
	<li>Fernandez J, Orth K. Rise of a cereal killer: the biology of Magnaporthe oryzae biotrophic growth. Trends Microbiol. 2018;26(7):582-597.</li>
	<li>Wengler MR, Talbot NJ. Mechanisms of regulated cell death during plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Cell Death Differ. 2025;32(5):793-801.</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir rakip veya çatışan çıkar beyan etmemektedir.

Membran eklemeli kuyucuk plakası ve CFS tabanlı analiz kullanılan önceki bir rapor, C. albicans'ın C. glabrata hücrelerine veya bunların CFS'sine yanıt olarak hifler geliştirdiğini göstermiştir. Ancak bu yanıt, Saccharomyces cerevisiae ve Candida dubliniensis gibi diğer mayalar tarafından indüklenmemiştir30. Ayrıca, bu hifal yanıt yalnızca C. albicans SC5314 laboratuvar referans suşu ile sınırlı kalmamış, klinik izolat WUM5A dahil olmak üzere diğer genomik arka planlarda da gerçekleşmiştir30. Bu protokolde, üç morfolojik metriği (hifal uzunluk, hifal hacim ve hifal kalınlık) nicelleştirmek için bu bulgular üzerine standartlaştırılmış bir iş akışı oluşturulmuştur. Dahası, bu morfolojik faktörler, ploidi ve çiftleşme tipi lokus durumundaki varyasyonların, salgılanan bir indükleyici moleküle yanıt olarak C. albicans'ın morfolojik özelliklerini nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılmıştır.
Burada açıklanan temassız metodolojiler, türler arası çözünür sinyal moleküllerinin morfometrik sonuçlarını görselleştirmek ve analiz etmek için basit bir deneysel çerçeve sunmaktadır. Membran insert kuyucuk plakası, aktif kültürler arasında çift yönlü difüzyona izin verirken, CFS tabanlı analiz, gerekli indüksiyon bileşenleri hedef kültürden bağımsız olarak toplandığı için ölçeklenebilir bir format sağlar. Analiz tutarlılığı için membran insert kuyucuk plakası düzeneğinde yaklaşık 1:50 oranının (C. albicans ile C. glabrata arasında) korunması gerekir. Bu konsantrasyon gradyanı, C. albicans filamentasyon kinetiğini baskılayabilen farnesol gibi endojen quorum-sensing inhibitörlerinin birikme eşiklerinin altında kalarak, çözünür indüksiyon moleküllerinin membran bariyeri boyunca yeterli akışını sağlar31,32. Benzer şekilde, CFS tabanlı analizde kritik bir adım, C. glabrata kaynak kültürünün homojen bir şekilde geç stasyoner büyüme evresine ulaşması için gereken 18 saatlik inkübasyon süresidir. C. glabrata kültürü için inkübasyon süresi 12 saatten az veya 24 saatten fazla olduğunda, toplanan CFS'nin burada incelenen spesifik indükleyici molekülün optimum konsantrasyonuna sahip olma olasılığı azalır ve bu da suboptimal hifa indüksiyonuna yol açar. CFS'nin toplanacağı uygun büyüme evresi veya kültürlerin oranı, her yeni deneysel hedef ve/veya yeni mikrobiyal tür kombinasyonları için standart hale getirilmelidir.
Farklı laboratuvar ortamlarında analiz tekrarlanabilirliğini maximize etmek için aşağıdaki temel prosedür iyileştirmeleri önerilmektedir. Tüm diploid C. albicans hatlarının gece boyu kültürü için Glukoz Minimum Besiyeri (GMM) kullanımı önerilir. GMM kullanımı, besin açısından zengin YPD besiyerinde sıklıkla gözlenen arka plan oto-filamentasyonunu baskılar. Altındaki mekanizma henüz net olmamasına rağmen, benzer oto-filamentasyonlar diğer çalışmalarda da gözlemlenmiştir33. Yüksek büyütmeli parlak alan mikroskobisi sırasında girişime neden olabilecek ışık saçılmasını ve optik aberasyonları ortadan kaldırmak için, görüntüleme öncesinde polikarbonat membran insertin tamamen fiziksel olarak çıkarılması da önerilmektedir.
Bu temassız konfigürasyonlar, çözünür sinyal bileşenlerinin rollerinin ayrıştırılmasına yardımcı olsa da, beraberinde belirli deneysel zorluklar getirir. Örneğin, temassız analizler, hatalı tutma nedeniyle membran yırtılması ve dolayısıyla mikrobiyal geçiş gibi küçük risklere karşı hassastır. Bu nedenle, örnekleme sırasında pipet uçlarının insertlerin hazne duvarlarına değmesine dikkat edilmeli ve membrana temas etmemesi sağlanmalıdır. Ayrıca, yanlış (daha geniş) gözenek boyutları nedeniyle bölmeler arasında fiziksel çapraz kontaminasyon meydana gelebilir; bu durum, uygun membran gözenek boyutuna sahip insertler kullanılarak kolayca giderilebilir. Mantar aşırı büyümesi veya yoğun biyofilm birikimi gözenekli membranı kapatabilir. Bu sorun, başlangıç inokülasyonlarının OD600 = 0.1 ile sınırlandırılması ve 12 h'den fazla inkübe edilmemesiyle çözülür. Ek olarak, mikroplar cihaz kuyucukları içinde homojen bir şekilde dağılmayabilir; sıklıkla membranın yakınında kümelenme veya tutunma gösterebilirler, bu da optik yoğunluk ölçümlerinde beklenmedik sapmalara yol açabilir. Dahası, bu sistemler iki popülasyonu fiziksel olarak ayırdığı için, doğrudan fiziksel hücre-hücre temasına dayalı etkileşimleri kopyalayamaz veya değerlendiremezler. Örneğin; karma türlü biyofilm olgunlaşması, mekanik ko-agregasyon veya yüzeye bağlı hücre duvarı adezinleri tarafından yönlendirilen sinyalleme gibi süreçler buna örnektir. Bu plaka tabanlı analizler, erken filamanlaşma kinetiğinin (3 h'de) etkili bir bitiş noktası anlık görüntüsünü sunsa da, uzun vadeli büyüme dinamiklerini veya uzamsal davranışı yakalamazlar. Uzatılmış süreler boyunca sürekli gerçek zamanlı takip gerektiren araştırmacılar için, özel mikroakışkan perfüzyon kanalları veya otomatik canlı hücre görüntüleme odaları daha uygun bir alternatif olabilir.
Hücresel geometri, yüzey alanı-hacim (SA/V) oranının besin edinimi ve hücre içi taşıma için temel bir itici güç olmasıyla metabolik verimliliğe temelden bağlıdır. Dimorfik ve filamanöz funguslarda, uzamış bir hifli morfotipe geçiş, optimize edilmiş bir SA/V oranını korumak için yapısal bir adaptasyon görevi görür. Bu durum, hif uçlarına yönelmiş metabolik süreçleri sürdürürken, genişletilmiş filaman duvarı boyunca dağıtılmış besin emilimine olanak tanır34,35,36,37. Ancak çalışmamız, morfometrik ölçeklendirmenin farklı ploidi durumları ve çiftleşme tipi lokus konfigürasyonları genelinde tekdüze orantılı olmadığını göstermektedir.
Oluşturulan morfometrik veri setleri aracılığıyla bu takip protokolü, ploidite ile ilişkili net yapısal ölçeklenme eğilimlerini ortaya koymakta olup; haploid hatlar, tüm geometrik metriklerde diploid suşlara kıyasla tutarlı bir şekilde daha küçük mutlak değerler sergilemektedir (Şekil 5). Diploid arka plan içerisinde, homozigot MAT&#945;/&#945; yapılandırması, ...'ya kıyasla gelişmiş filamentasyon kinetiği (uzunluk ve hacim) sergilemiştir MATa/a veya MAT (Minimum Aktif Konsantrasyon)a/&#945; bu koşullar altındaki suşlar in vitro koşullar. Artmış filamentasyonun sıklıkla artan penetrasyon kapasitesi ile ilişkili olduğu göz önüne alındığında, şunların klinik izolatlarının neden C. albicans ağırlıklı olarak heterozigot diploidler şeklinde izole edilirler (MATa/&#945;). İmmünokompetan bir konakçıda, heterozigot durumun uzun süreli kommensal kolonizasyon için daha geniş bir uygunluk avantajı sağlaması mümkündür. Diğer bir deyişle, şunların yapısal özellikleri... MATa/&#945; morfotipler, konakçı bağışıklık gözetimine karşı hayatta kalma konusunda optimize edilmiştir. Bu nedenle, gelecekteki araştırmalar, farklı seçici baskılar altında farklı çiftleşme tipi homozigotların karşılaştırmalı uygunluğunu sistematik olarak değerlendirmek için bu standartlaştırılmış ko-kültür sistemlerinden yararlanmalıdır.
Önceki çalışmalar, koful morfolojisinin, bölünme-birleşme dinamiklerinin ve yapısal genişlemenin, uzayan fungal filamentlerin iç hacminin ve turgor basıncının yönetilmesinde önemli roller oynadığını belgelemiştir. Örneğin, pirinç blast patojeni Magnaporthe oryzae'de, ince vejetatif hifler ile yumrulu istilacı yapılar arasındaki belirgin geçişler, koful organizasyonundaki değişikliklerle sıkı bir şekilde koordine edilmektedir38,39,40. Ancak, mevcut protokol C. albicans filamentasyonu sırasında koful dinamiklerini doğrudan izlememiştir; bu iç organel değişikliklerinin toplam yapısal hacme göre takip edilmesi, gelecekteki araştırmalar için bilgilendirici bir yol sunmaktadır. Ek olarak, fungal kaynaklı belirli sekretom bileşenlerinin, serum gibi konakçı kaynaklı kimyasal indükleyicilerden farklı morfolojik ölçekleme kinetiklerine neden olduğunu belirlemek için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
Bu protokolde ayrıntıları verilen temassız ko-kültür yöntemleri, fırsatçı bakteriyel popülasyonlar ile dimorfik funguslar arasındaki sinyalizasyon dinamikleri gibi türler arası ve alemler arası etkileşimlerin araştırılmasına uyarlanabilir. Ayrıca, bu 96 kuyucuklu ve 24 kuyucuklu formatlar ölçeklendirilebilir olduğu için, bu kantitatif platform kimyasal taramalar için kullanılabilir. Bunun örnekleri arasında, temel hücre canlılığını doğrudan etkilemeden, sekretomla stimüle edilen filamentasyon yolaklarını seçici olarak bozacak küçük moleküllü inhibitörlerin veya yeni antifungal bileşiklerin tanımlanması yer almaktadır.

Doğal ve klinik ekosistemlerde mikroorganizmalar tipik olarak, karmaşık tür içi ve&#160;türler arası&#160;iletişim ağları tarafından yönetilen yapılandırılmış polimikrobiyal topluluklar içinde bulunurlar1. Bu konsorsiyumlar, popülasyon düzeyindeki davranışları koordine etmek için quorum sensing molekülleri, uçucu organik maddeler, salgılanan peptid ve proteinler dahil olmak üzere çeşitli kimyasal sinyaller kullanırlar2. Kooperatif, rekabetçi veya yırtıcı niş etkileşimleri mikrobiyal metabolizmayı, uzaysal mimariyi ve strese adaptasyonu önemli ölçüde değiştirdiğinden, bu iletişim dinamiklerinin haritalandırılması kritiktir3. Klinik olarak, bu polimikrobiyal ağlar (çift türlü bakteriyel-fungal veya türler arası fungal-fungal konsorsiyumlar gibi), monokültürlere kıyasla sıklıkla sinerjik virülans, hızlandırılmış doku kolonizasyonu ve artmış antimikrobiyal direnç sergilerler4,5. Bu nedenle, mikrobiyal iletişimlerin moleküler belirleyicilerini çözmek, geleneksel modellerin ötesine geçmek ve topluluk stabilitesini bozacak yenilikçi anti-enfektif stratejiler geliştirmek için hayati önem taşımaktadır6.
Mikrobiyal etkileşimin farklı modlarını çözümlemek için araştırmacılar, öncelikle memeli hücresi biyolojisi, immünoloji ve onkolojide kullanılan çeşitli deneysel konfigürasyonlardan yararlanırlar7,8,9. Örneğin, doğrudan temaslı ko-kültür modelleri, &#160;juksakrin&#160;sinyalleşmenin ve fiziksel hücreden hücreye etkileşimlerin araştırılmasında standart olarak hizmet eder10. Benzer düzenekler, modifikasyonlarla birlikte mikroplar arasındaki fiziksel etkileşimleri incelemek, mikroplar arası inhibisyonu veya ilaç yanıtını anlamak için de kullanılır9,11,12. Ancak, hem temasa bağımlı hem de difüzyonla yayılan sinyaller gözlemlenen yanıta katkıda bulunduğu için temel mekanizmaları ayırt etmek zordur. Geleneksel temas tabanlı analizler mekansal içgörüler sağlayabilse de, zahmetlidir ve/veya model olmayan organizmalar için yorucu olabilen farklı suş etiketlemesi gerektirir. Buna karşılık, Transwell (membran insertli kuyucuk plakası) analizleri, çoğunlukla memeli çalışmalarında, temasa bağımlı ve difüzyonla yayılan sinyallerin katkılarını ayırt etmek için kullanılır13,14,15,16. Bu yöntem, hücresel iletişimin salgılanan moleküller aracılığıyla gerçekleştiği durumlarda özellikle yararlıdır ve hücre popülasyonları arasındaki sinyalleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı analizine olanak tanır17. Ayrıca, temassız analizler, geleneksel yöntemlerin kaçırdığı mikropları dinamik olarak takip etmek için deneyleri hesaplamalı modellerle entegre edebilen membran ayırma avantajını sunar18. Bu yaklaşım, zaman zaman farklı bakteri türlerinin gelişimsel kinetiğini eş zamanlı olarak incelemek için kullanılır19.
Membran insertli kuyucuk plakası analizine daha ucuz ve yüksek kapasiteli bir alternatif, Hücre Dışı Süpernatant (CFS) tabanlı veya kondisyonlu besiyeri tabanlı analizdir. Bunun, rejeneratif tıp ve vasküler biyolojide, kök hücre aracılı doku onarımını ve/veya tümör kaynaklı anjiyogenezi anlamak için gerekli olan sekretomları izole etmek amacıyla kullanıldığı bilinmektedir20. Benzer şekilde, mikrobiyolojik çalışmalarda CFS çerçeveleri, polimikrobiyal rekabetin çözümlenmesinde yararlı olmuştur. Örneğin, bakteriyel filtratlar (&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;asil-homoserin laktonları veya&#160;Lactobacillus&#160;metabolitleri gibi), fungal biyofilm olgunlaşmasını modüle etmek için kullanılmıştır21,22.&#160;Yakın zamanda, mikroakışkan platformlar, çip üzerinde organ teknolojileri aracılığıyla yüksek sadakatli fizyolojik biyomimikriye olanak sağlamıştır23,24. Mikroakışkan sistemler, mikrobiyal topluluğun kendi sekretomlarına verdiği yanıtın eş zamanlı tespiti için uygulanmış olsa da, uzmanlaşmış cihazlar ve bilgi birikimi gerektirmekte olup her ortamda kolayca uygulanamayabilir25,26,27. Bu nedenle, membran insertli kuyucuk plakası ve CFS tabanlı analizlerin çoğu durumda tercih edilen yöntemler olacağı öngörülmektedir. Bu iki analiz arasındaki seçim, salgılayan molekülün doğasına bağlı olacaktır. Eğer salgılayan molekül kararsızsa, yani yarı ömrü kısaysa ve gerçek zamanlı aktivitenin ölçülmesi gerekiyorsa, membran insertli kuyucuk plakası analizi daha uygundur. Öte yandan, salgılayan molekül kararlıysa ve deney büyük ölçekliyse, CFS tabanlı bir analiz daha ekonomik olacaktır.
Bu protokolün temel amacı, membran insert kuyucuk plakası ve CFS platformlarını kullanarak morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi için adım adım kalitatif ve kantitatif bir takip metodolojisi sunmaktır (Şekil 1). Burada, örnek olarak Candida albicans ve Candida glabrata arasındaki salgı faktörü güdümlü iletişim ile gösterilmiştir. Ayrıca bu araçlar, sekretuar sinyal moleküllerine maruz kalındığında, &#160;C. albicans&#160;filamentlerinin mutlak geometrik gelişimindeki (uzunluk, hacim ve çap) değişiklikler üzerinde içsel genetik değişkenlerin (ploidi ve çiftleşme lokusu durumu) etkilerini de nicelleştirebilir. Bu yerleşik protokol, türler arası sinyalizasyon dinamiklerini çalışmaya uygun, basit ve uygun maliyetli, temassız bir platform sağlar.

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m PES şırınga filtresi</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Agar agar</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü insertli (0.4 &amp;mu;m) Nunc 24 kuyucuklu taşıyıcı plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite 96 kuyucuklu çoklu kap, hücre kültürü işlem görmüş, düz tabanlı</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Proteoz pepton</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>Maya ekstraktı</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Maya Azot Bazı, amonyum sülfatlı, amino asitsiz</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

mantarlardaki türler arası etkileşimler sırasında morfometrik Çalışmalar İçin temassız ko-kültür deneyleri

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

Mikrobiyal bir toplulukta hücresel davranış ve morfoloji genellikle çeşitli hücre içi ve hücre dışı faktörlerden etkilenir. Mikrobiyal iletişimi incelemek için mevcut olan farklı yaklaşımlar zahmetli olabilir ve/veya özel tesisler ile uzmanlık gerektirebilir.&#160;Burada, belirli bir türler arası etkileşimdeki çeşitli faktörlerin rolünü araştırmak için ölçülebilir bir yanıt olarak morfolojik geçişe dayanan, birbirini tamamlayıcı iki temassız ko-kültür yaklaşımı olan membran insertli kuyucuk plaka ko-kültür analizi ve Hücreden Arındırılmış Süpernatant (CFS) tabanlı analiz açıklanmaktadır. Membran insertli kuyucuk plaka sistemi, hücre dışı moleküllerin difüzyonuna izin verirken, fiziksel olarak ayrılmış türler arasında gerçek zamanlı etkileşim sağlar. Buna karşılık, CFS tabanlı analiz, kondisyonlu medyuma verilen yanıtların değerlendirilmesi için basitleştirilmiş ve ölçeklendirilebilir bir yaklaşım sunar. Burada sunulan protokol; kültür hazırlama, kondisyonlu süpernatantların üretimi, analiz kurulumu, mikroskopi, görüntü elde etme, Fiji kullanılarak yapılan kantitatif morfometrik analiz ve istatistiksel değerlendirme için standartlaştırılmış prosedürleri içermektedir. Bu durum, mantarların içsel ve dışsal faktörlere verdiği morfolojik yanıt örneğiyle gösterilmiştir. Burada sunulan yöntemler, bir topluluktaki yeni mikrobiyal etkileşimleri incelemek için erişilebilir ve uyarlanabilir alternatif araçlar sunmakta olup, bir toplulukta çok türlü bir arada yaşamanın altında yatan mekanizmaları araştırmak için kolayca genişletilebilir.

Türler arası etkileşimleri araştırmak için temassız ko-kültür analizleri
Çözünür ve düşük bolluktaki hücre dışı sinyal molekülleri, karışık mikrobiyal bir arada yaşam sırasında genellikle temel iletişim olaylarına aracılık eder. Bu dinamikler, doğrudan fiziksel hücre-hücre temasını önlerken C. albicans ve C. glabrata arasındaki etkileşim modellerini analiz etmek için tasarlanmış, temassız iki hücre tabanlı düzenek kullanılarak değerlendirilmiştir. İlk konfigürasyonda, iki popülasyonun inert, 0.4 µm gözenekli bir polikarbonat membran ile fiziksel olarak ayrıldığı ve salgılanan moleküllerin bariyer boyunca engelsiz çift yönlü difüzyonuna izin veren entegre membran insert kuyucuk plak kültürü sistemi kullanılmıştır. İkinci düzenek ise, stasyoner fazdaki C. glabrata kültürlerinden (CgCFS) elde edilen hücre içermeyen süpernatant içeren mikrotitre plaklarında doğrudan kültive edilen C. albicans maya hücrelerinin büyümesini izlemiştir.
Önceki taramalarla30 uyumlu olarak, yabani tip heterozigot diploid C. albicans hücreleri (SC5314), membran insert bariyeri ile ayrılmış C. glabrata hücrelerine veya filtrelenmiş CgCFS'ye yanıt olarak kolayca gerçek hifler geliştirmiştir. Buna karşın, saf negatif kontrol ortamında (GMM veya YPD) tutulan hücreler ağırlıklı olarak tomurcuklanan maya ve psödohifal formda kalmıştır (Şekil 2A). Karşılaştırmalı analizler, iki assay düzeneği arasında tutarlılık olduğunu göstermiştir. Her iki assay; filament uzunluğu, hacmi ve kalınlığı dahil olmak üzere tüm yapısal metriklerde benzer değerler vermiştir (Şekil 2). Morfolojik parametrelerdeki fark, uygun istatistiksel testlerden ve ardından çoklu karşılaştırmalar için yapılan post-hoc testlerden elde edilen p-değerinin 0,05 kriterini karşılaması durumunda anlamlı kabul edilmiştir. Bu gözlemler, membran insert kuyucuk plakası düzeneği içindeki C. glabrata hücreleri tarafından indüklenen (39,66 µm ± 6,81 µm) veya filtrelenmiş CgCFS'ye maruz kaldığında indüklenen (37,13 µm ± 6,50 µm; Şekil 2B) gerçek hiflerin uzunluğu arasında C. albicans hücreleri için anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir. Benzer şekilde, membran insert kuyucuk plakası sistemindeki bu indüklenmiş filamentlerin hacimleri (112,10 µm3± 22,59 µm3), CgCFS kondisyonlu ortamdakilerden (109,78 µm3± 34,69 µm3; Şekil 2C) anlamlı düzeyde farklı değildi. Ayrıca, filament çapı ölçümleri, ortalama hif kalınlığının iki düzenek arasında tutarlı kaldığını doğrulamıştır; membran insert kuyucuk plakası konfigürasyonu için değerler 1,89 ± 0,10 µm, CgCFS uygulaması için ise 1,92 µm ± 0,23 µm olarak belirlenmiştir (Şekil 2D).
Ploidiler ve çiftleşme tipi konfigürasyonları in vitro morfolojik boyutları değiştirir
Dimorfik geçişlerin yönlendirilmesinde ploidi seviyelerinin ve çiftleşme lokusu mimarilerinin rolleri, farklı fungal model sistemlerde ortaya konmuştur. Burada, haploit (MATa veya MATα) ve diploit (MATa/a, MATα/α veya MATa/α) C. albicans suşlarından oluşan bir panelde filamanlaşma metriklerini, özellikle hif uzunluğunu, yapısal hacmi, kalınlığı ve ilgili ana maya hücresi hacmini nicelleştirmek için analitik izleme hattı uygulanmıştır.
Yapısal profilleme, indükleyici CgCFS sekretomu veya pozitif serum kontrolüne maruz kaldığında, homozigot diploid alfa suşunun (MATα/α), homozigot diploid MATa/a suşu ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha uzun eksenlere (45.56 µm ± 9.24 µm ve 46.62 µm ± 9.07 µm) ve daha büyük hacimlere (125.24 µm3 ± 39.94 µm3 ve 119.45 µm3 ± 37.32 µm3) sahip filamentler oluşturduğunu ortaya koymuştur (Şekil 3A,C). Standart klinik C. albicans izolatları ağırlıklı olarak heterozigot diploidler şeklinde bulunsa da, referans MATa/α suşu, indüksiyon sonrasında (özellikle serum ile) MATa/a suşuna kıyasla daha uzun filamentler ve daha büyük hacimler sergilemiştir. Bununla birlikte, bunlar homozigot MATα/α suşundan anlamlı derecede daha küçüktür (Şekil 3B,D).
Eş zamanlı olarak, haploid suşlar ters bir model göstermiş olup, her iki indüksiyon koşulu altında haploid MATa suşu, haploid MATα suşuna kıyasla hif uzunluğunda anlamlı bir artış sergilemiştir (CgCFS: 22.06 µm ± 5.41 µm'ye karşı 17.58 µm ± 4.12 µm; Serum: 23.71 µm ± 6.59 µm'ye karşı 21.00 µm ± 5.29 µm; Şekil 4A). İlginç bir şekilde, haploid arka plandaki bu uzunluk artışı, hif hacmindeki artışa (38.84 µm3 ± 19.58 µm3'e karşı 34.25 µm3 ± 19.62 µm3) yalnızca CgCFS yanıtında yansımıştır (Şekil 4B). Bu başlangıç in vitro ölçümleri, ploidi durumları ve çiftleşme tipi lokus konfigürasyonları arasında karmaşık bir etkileşim olduğunu ve MATa ile MATα lokuslarının muhtemelen filamentasyon dinamiklerine farklı şekilde katkıda bulunduğunu göstermektedir.
Birleştirilmiş veri setleri genelinde bu yapısal metrikler arasındaki istatistiksel ilişkileri incelemek için, test edilen tüm ploidi ve çiftleşme tipi varyantlarını kapsayan Spearman sıra korelasyonu (ρ) ve Pearson doğrusal regresyon (R2) analizleri gerçekleştirildi. Analiz edilen tüm çiftler arasında pozitif korelasyonlar gözlemlendi: hif uzunluğu ile hif hacmi, hif uzunluğu ile hif kalınlığı, hif uzunluğu ile ana hücre hacmi ve toplam hif hacmi ile ana maya hücresi hacmi (Şekil 5, Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2).
En güçlü ilişki, hif uzunluğu ile hesaplanan hif hacmi arasında gözlemlenmiştir (ρ = 0.91; Şekil 5A). Buna karşılık, en zayıf korelasyon, ana maya hücresinin başlangıç hacmi ile ortaya çıkan hif hacmi arasındaydı (ρ = 0.63; Şekil 5C). Ayrıca, hif kalınlığının hif uzunluğu ile olan korelasyonu, hif hacminin korlasyonu kadar güçlü değildi (Şekil 5A,D). Ana hücre hacmi, hif uzunluğu ve hif kalınlığının korelasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı farklar bulunmamıştır (Şekil 5B,D). Bu geometrik dağılımlar, daha büyük bir başlangıç ana maya hücresi hacminin, daha uzun hiflere veya daha yüksek hacme yol açmak zorunda olmadığını göstermektedir.
Özetle, bu sonuçlar, herhangi bir fiziksel temas olmaksızın C. albicans'taki morfogenetik varyasyonların görselleştirilmesi ve miktarlaştırılması için hem membran insert kuyucuk plakasının hem de CFS tabanlı analizlerin faydasını göstermektedir. Bu protokol tarafından üretilen veriler, farklı ploidi arka planları ve çiftleşme tipi konfigürasyonları genelinde farklı morfolojik özellikler ortaya çıkarmaktadır. Bu temassız analiz düzenekleri, çeşitli mikrobiyal kombinasyonlar genelinde türler arası sinyalizasyon dinamiklerini incelemek için uyarlanabilecek esnek ve ölçeklenebilir bir metodoloji sunmaktadır.
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
Şekil 1: Candida türleri ile membran insert kuyucuk plakası ko-kültür ve CFS tabanlı hifal indüksiyon analizlerinin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
Şekil 2: Membran insertli kuyucuk plakası ile CFS tabanlı temassız analizler arasında gözlemlenen hif morfolojilerinin karşılaştırılması. (A) C. albicans'ın YPD'ye (kontrol), membran insertli kuyucuk plakası düzeneğindeki C. glabrata'ya veya C. glabrata hücresiz süpernatant (CFS) ile şartlandırılmış besiyerine verdiği morfolojik yanıtı gösteren temsili parlak alan mikrografları. Pembe, siyah ve beyaz ok uçları sırasıyla mayayı, psödohifleri ve gerçek hifleri belirtmektedir. Ölçek çubuğu, 10 µm. Membran insertli kuyucuk plakası düzeneğindeki C. glabrata hücrelerine veya C. glabrata CFS'ye yanıt olarak gözlemlenen heterozigot diploid bir C. albicans suşunun (SC5314) hif uzunlukları (B), hif hacimleri (C) ve hif kalınlığı (D). Veriler, n = 50 hücre ile üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen medyan ± %95 güven aralıklarını temsil etmektedir. ns, anlamlı değil: p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
Şekil 3Çift takımlı organizmalarda çiftleşme tipi ve zigozite, hif morfolojisi üzerinde önemli etkilere sahiptir C. albicans. Belirtilen indükleyici moleküle yanıt olarak, homozigot diploidler arasındaki karşılaştırmalı hif uzunluklarını gösteren grafikler (A) ve heterozigot ile homozigot diploidler arasında (B) nın/nin C. albicansBenzer şekilde, bahsedilen indükleyici moleküllere yanıt olarak ortaya çıkan karşılaştırmalı hif hacimleri, homozigot diploidler arasında (C) ve hetero- ile homozigot diploitler arasında (D). Kontrol: Hif oluşumunu tetiklemeyen ortam kontrolü olan YPD. Veriler medyanı temsil etmektedir &#177; n = 50 hücre ile gerçekleştirilen üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen %95 güven aralıkları. Grafiğin üst kısmında belirtilen sayılar pWilcoxon sıra toplamı testi karşılaştırmaları ile belirlenen p-değerleri. **: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0,0001, istatistiksel olarak anlamlı; ns, anlamlı değil: p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
Şekil 4: Farklı moleküler indüktörlere yanıt olarak haploid C. albicans'taki hif karakteristikleri. Grafikler, belirtilen indüktöre yanıt olarak haploid C. albicans suşlarındaki hif uzunluklarını (A) ve hif hacimlerini (B) göstermektedir. Kontrol: YPD, hif oluşumunu indüklemeyen besiyeri kontrolü. Veriler, n = 50 hücre ile gerçekleştirilen üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen medyan ± %95 güven aralıklarını temsil etmektedir. Belirtilen sayılar, Wilcoxon sıra toplamı testi ile belirlenen p-değerlerini ifade eder. **: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001, istatistiksel olarak anlamlı; ns, anlamlı değil: p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
Şekil 5: C. albicans ploidisi ile ilişkili morfolojik parametreler arasındaki korelasyon. Grafikler, bu çalışmada kullanılan morfolojik parametreler arasındaki Spearman korelasyonunu ve doğrusal regresyonu göstermektedir; sırasıyla hif hacmi ve hif uzunluğu (A), hücre hacmi ve hif uzunluğu (B), hücre hacmi ve hif hacmi (C) ve hif kalınlığı ile hif uzunluğu (D). ρ: Spearman korelasyon katsayısı; R2: doğrusal regresyon analizinden elde edilen belirleme katsayısı; p: p-değeri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Suş</td>
			<td>Türler</td>
			<td>Ploidite</td>
			<td>Genotip</td>
			<td>Lütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm akademik ve teknik standartlara uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini hemen gerçekleştireceğim.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>Haploid (1n)</td>
			<td>MAT&#945;</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploid (2n)</td>
			<td>Heterozigot (MATa/&#945;)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploid (2n)</td>
			<td>Homozigot (MATa/a); arg4&#916;/arg4&#916;, leu2&#916;/leu2&#916;, his1&#916;/his1&#916;, URA3/ura3&#916;</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Candida albicans'taki Bariyer Aktivitesi Feromon Degradasyonunu Aracılar ve Çiftleşmeyi Teşvik Eder. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploid (2n)</td>
			<td>Homozigot (MAT&#945;/&#945;); arg4&#916;/arg4&#916;, leu2&#916;/leu2&#916;, his1&#916;/his1&#916;, URA3/ura3&#916;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploid (1n)</td>
			<td>Homozigot (MATa); ura3&#8710;::imm434 his4 gal1&#8710;::ura3&#8710;::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. ‘Zorunlu diploid’ Candida albicans, çiftleşme yeteneğine sahip haploidler oluşturur. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploid (1n)</td>
			<td>Homozigot (MAT&#945;); his4 ura3&#916;::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Candida albicans ve Candida glabrata suşları. Tablo; temassız membran insert kuyucuk plakası ko-kültürü ve Hücresiz Süpernatant (CFS) tabanlı analizlerde değerlendirilen fungal suşların tanımlamalarını, açık genotiplerini, ploidi durumlarını ve çiftleşme tipi zigositelerini özetlemektedir.
Ek Tablo 1: Çeşitli C. albicans morfolojik parametreleri üzerinde gerçekleştirilen istatistiksel analizlerin verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 2: Bu çalışmada değerlendirilen çeşitli C. albicans morfolojik parametrelerinin tüm biyolojik tekrarlarının ham değerleri.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan besiyerlerinin listesi ve bileşimleri.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Türler arası etkileşimler sırasında fungal morfolojik yanıtların kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için iki temassız ko-kültür yaklaşımı açıklanmıştır. Protokol, bir Candida türler arası deneyi örneği üzerinden, içsel faktörlerin hif büyümesini nasıl etkilediğini göstermektedir. Bu yöntemler, çeşitli organizmalarda mikrobiyal türler arası iletişimi incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Mantarlardaki Türler Arası Etkileşimler Sırasında Morfometrik Çalışmalar İçin Temassız Ko-Kültür Deneyleri

Hücresel davranış ve morfoloji, bir mikrobiyal toplulukta genellikle çeşitli hücre içi ve hücre dışı faktörlerden etkilenir. Farklı yaklaşımlar...

Konak-patojen ve fungal türler arası etkileşimlerdeki moleküler iletişimi inceleyerek, salgılanan sinyallerin mikrobiyal morfolojiyi ve davranışı nasıl şekillendirdiğini araştırıyoruz. Mevcut yöntemler zahmetli, maliyetli veya kafa karıştırıcı olabilir. Bu protokol, yeni mikrobiyal türler arası etkileşimleri incelemek için basit, uyarlanabilir ve temassız bir analiz sunmaktadır. Bu protokol, çeşitli biyolojik ve klinik sistemlerde türler arası ve krallıklar arası etkileşimler üzerine temel ve translasyonel araştırmaları desteklemektedir.İşleme, Candida glabrata CBS 138 kolonileri içeren bir glukoz minimal ortam agar plağını, steril bir öçeyi ve steril maya özütü pepton dekstroz (YPD) besiyeri içeren bir tüpü biyogüvenlik kabinine yerleştirerek başlayın. Plaktan tek bir izole koloni seçin ve bunu 10 milliliters YPD besiyerine inoküle edin. 37 degrees Celsius sıcaklıkta, 200 rpm sürekli ajitasyon ile 18 saat boyunca inkübe edin. Gecelik kültürü alın. Maya morfolojisini ve kontaminasyon olmadığını ışık mikroskobu ile doğrulayın. Kültürü 15-milliliter konik tüpe aktarın. 25 degrees Celsius sıcaklıkta, 5,000 x g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice dökün ve hücre peletini membran insert analizi için saklayın. Hedef Candida albicans suşu için, tek bir koloniyi diploid suş ise 5 milliliters GMM besiyerine, haploid suş ise YPD besiyerine inoküle edin. İnoküle edilen kültürü 37 degrees Celsius sıcaklıkta, 200 rpm ajitasyon ile 12 saat boyunca inkübe edin. Gecelik kültürün 600 nanometers'deki optik yoğunluğunu kontrol edin. Ardından, kültürü önceden ısıtılmış GMM ile 1 milliliter nihai hacme ve 600 nanometers'de 0.1 nihai OD değerine seyreltin.Steril bir 24 kuyucuklu doku kültürü plağı alın. Seçilen her bir alt veya çift bölmeli bir hücre kültürü plağının abdominal boşluğuna, 600 nanometrede OD değeri 0,1 olan 1 mililitre Candida albicans süspansiyonu ekleyin. Ardından, Candida glabrata peletini geri alın ve 1 mililitre GMM besiyerinde yeniden süspanse edin. 5.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Nihai peleti taze GMM besiyerinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunun 600 nanometredeki OD değerini beşe ayarlayın. Daha sonra, steril pensler kullanarak, 0,4 mikrometre gözenekli polikarbonat membrana sahip steril bir membran inserti her bir çalışma kuyucuğuna yerleştirin. İnsetleri kuyucuklara sıkıca sabitleyin ve hazırlanan Candida glabrata süspansiyonundan 750 mikrolitreyle her bir üst veya lüminal bölmeye dağıtın. Hazırlanan plağı kapatın ve statik koşullarda 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, steril pensler kullanarak her bir üst inserti çıkarın ve güvenli bir şekilde atın. Morfolojik değerlendirme için 24 kuyucuklu plağı; DIC optikleri ile 10x, 20x ve ekstra uzun çalışma mesafeli 40x objektiflerle donatılmış bir evirtilmiş mikroskopa yerleştirin.Gerekli inkübasyon süresinin ardından, hücre dağılımının homojenliğini doğrulamak ve takip hatalarını veya anormal kümelenmeleri belirlemek için kuyucuk tabanlarını 10x objektif ile tarayın. Temel filament sayısı ve popülasyon dağılımı veri seti için kalibre edilmiş 20x objektif ile en az 10 ayrı görüş alanı görüntüleyin. Hassas fenotipik analiz ve hücre sınırı ölçümleri için 40x ekstra uzun çalışma mesafeli objektif ile mikrograflar çekin. Ardından tüm ham görüntü dosyalarını kaydedin. Fiji yazılımının en güncel sürümünü başlatın. Dosya (File) menüsünden Aç (Open) seçeneğini belirleyerek hedef mikrografı açın. Hif uzunluğunu ölçmek için Çizgi seçim simgesine tıklayın ve Segmentli çizgi (Segmented line) aracını seçin. İmleci, filamentin ana maya hücre duvarından çıktığı birleşim noktasına yerleştirin. Kavisleri ve bükülmeleri takip etmek için çapa noktaları ekleyerek hifanın merkezi boylamasına eksenini takip edin ve apikal uçta işlemi sonlandırın. Toplam uzunluğu (L) mikrometre cinsinden Sonuçlar (Results) penceresine kaydetmek için Windows'ta Control + M veya Mac OS'ta command + M kullanarak ölçüm (measure) komutunu çalıştırın. Ölçülen hücreyi işaretlemek ve mükerrer analizi önlemek için Fırça (Brush) aracını kullanın. Hücreye bağlı ana maya hücresini bulun. Segmentli çizgi aracıyla, hücrenin maksimum uzun ekseni boyunca düz bir çizgi çizip ölçerek ana ekseni (A) kaydedin. Ardından, en geniş enine açıklık boyunca ana eksene dik bir çizgi çizip ölçerek yan ekseni (B) kaydedin. Yazılımda yer alan prolat sferoit modelini kullanarak ana maya hücresi hacmini (CV) kübik mikrometre cinsinden hesaplayın. Hifa kalınlığını ölçmek için, hifa uzunluk eksenine dik, dış duvardan dış duvara bir çizgi çizmek üzere Segmentli çizgi aracını kullanın. Filament boyunca eşit aralıklarla belirlenmiş üç noktadaki çapı kaydedin. Ortalama kalınlığı (d) elde etmek için üç çapın aritmetik ortalamasını hesaplayın ve yarıçapı (r) bulmak için bu değeri 2'ye bölün. Dallanmamış filamenti bir silindir olarak kabul ederek toplam hifa hacmini (HV) kübik mikrometre cinsinden hesaplayın.Her bir biyolojik replikat için ortalama veya medyan hücre ölçümünü hesaplayın ve sonraki istatistiksel karşılaştırmalar için bu replikat düzeyindeki değerleri kullanın. Parametrik yöntemleri uygulamadan önce, Shapiro-Wilk veya D'Agostino-Pearson testi kullanarak biyolojik replikat veri setinin normalliğini değerlendirin. İki grup karşılaştırması için, veri seti normal dağılım gösterdiğinde eşleştirilmemiş iki kuyruklu student t-testi kullanın. İstatistiksel analizleri gerçekleştirip grafiksel gösterimleri hazırladıktan sonra, tüm şekiller genelinde tutarlı istatistiksel notasyonlar uygulayın.Candida albicans hücreleri, ya membranla ayrılmış Candida glabrata hücrelerine ya da filtrelenmiş Candida glabrata hücreden arındırılmış süpernatanına maruz kaldıklarında, iki temassız analiz sisteminde gerçek hifler geliştirmişlerdir. Kontrol hücreleri ise buna karşılık, ağırlıklı olarak maya ve psödohifal morfolojilerini korumuştur. Membranla ayrılmış ko-kültür ve filtrelenmiş CFS analizleri arasında anlamlı bir fark gözlenmemiş olup, her iki sistem de benzer hif uzunlukları, hif hacimleri ve kalınlıkları üretmiştir.Bu protokol, araştırmacıların mikrobiyal topluluklar içindeki türler arası sinyalleşmeye verilen morfolojik yanıtları ölçerek çok türlü bir arada yaşama durumunu incelemelerine olanak tanır. Buradaki temel zorluk, membranlar arası moleküler değişimin sağlanmasıdır; bu durum plaka ajitasyonu ve yeterli hidrostatik basıncın korunmasıyla çözülebilir. Organel dinamiklerinin canlı hücre görüntülemesi, moleküler iletişimin türler arası etkileşimleri mekanik olarak nasıl şekillendirdiğini ortaya çıkarabilir.

contactless-co-culture-assays-for-morphometric-studies-during-inter

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, eşzamanlı ve lokalize epitel hücreleri ve bakteri kültürü için bir mikroakışkan ortak kültür modeli açıklamaktadır. Bu model, varsayılan probiyotik bakteri suşlarının etkinliğini patogenezinde farklı çözünür moleküler sinyallerin rolünü araştıran gibi ekran için kullanılabilir.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Bu makale niyetinde kademeli biçimde tanımlamak için yaygın olarak...

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Bu video, aerobik mantar lignocellulosic bitki dokularında bozulma çalışma kontrollü bir ortamda bir yaklaşım göstermektedir. Besin kaynakları ve nem kontrolü için agar-blok microcosms yeteneği önemli bir avantaj, ancak bu yaklaşım genellikle karışık başarı verimleri. Biz, tekrarlanabilir, düşük değişkenlik verim kritik tuzaklar adresi.

Aerobik Mantarlar Kontrollü Bitki Doku Ayrışma Agar-Blok Microcosms

Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem...

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Bu el yazması xarakteristikaları ve kemirgenler çene kemiğinde düzgün içinde hücresel değişikliklerin analizi için yöntemler sunar.

Bir xarakteristikaları ve fare çene kemiğinde düzgün için hücresel analiz yöntemi

Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.

Entomopatojenik mantarları toprak örneklerinden izole etme yöntemlerinin karşılaştırılması

Burada sunulan protokol, konakçı-patojen etkileşimlerini inceleyen RNA dizileme transkriptom verilerinden sirkRNA'ları tahmin etmek ve işlevsel olarak karakterize etmek için gereken in silico boru hattının tamamını açıklamaktadır.

Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNA'ların Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Öğrenin, temassız ko-kültür deneyleriyle mantarların türler arası etkileşimlere morfolojik yanıtlarını nasıl ölçebilirsiniz. Membran insert ve hücreden süpernatant yöntemleriyle mikrobiyal iletişimi kolayca inceleyin.

Mantarlardaki Türler Arası Etkileşimler Sırasında Morfometrik Çalışmalar İçin Temassız Ko-Kültür Deneyleri

Daha fazla video keşfet