Kültürlenmiş Hücrelerden Fare Testisine Doğrudan Etkileşime Giren Proteinlerin Doğrulanabilir Tanımlanması İçin UV Tabanlı ChIRP Yöntemi

Araştırmamız; hem kültürlenmiş hücrelerde hem de testisler gibi doğal dokularda RNA ve protein etkileşimlerini doğrudan haritalamak ve spermatogenezde TUG1'in moleküler mekanizmalarını aydınlatmak için bir UV çapraz bağlama yöntemi olan cPDiRT'yi geliştirmiştir. Bu protokol, kültürlenmiş hücrelerden sağlam doğal dokulara kadar daha geniş bir sistem yelpazesinde doğrudan RNA-protein etkileşim haritalamasına olanak tanır. Başlamak için, kalıntı kültür ortamını uzaklaştırmak amacıyla GC2 hücrelerini PBS ile üç kez yıkayın.

Ardından, çapraz bağlama işleminden önce kaba üç mililitre PBS ekleyin ve eşit şekilde dağıtın. Hücreleri 254 nanometrelik bir ultraviyole çapraz bağlayıcıda, santimetrekare başına 4.000 milijul dozunda ışınlayın. Hücreleri PBS içerisinde toplayın ve hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3000G'de santrifüjleyin.

Süpernatan atıldıktan sonra peleti tartın ve örnek başına minimum 500 miligram pelet kütlesini doğrulayın. Dört haftalık erkek C57BL6 farelerinden testisleri toplayın. Dekapsüle edilmiş testis dokusunu 5 ila 10 mililitre DMEM ile iki kez yıkayın.

Ardından, 100 mg dokuyu, 1 mg/mL kollajenaz IV içeren 10 mL DMEM ile 37 °C'de inkübe edin. Seminifer tübüller serbest kalana kadar sindirime 5 ila 15 dakika boyunca devam edin. Daha sonra, süspansiyonu 4 °C'de 1000G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Pelleti 5 ila 10 mililitre DMEM ile yıkayın. Süspansiyonu dört santigrat derecede, 1000G hızda bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Ardından pelleti, mililitre başına bir miligram deoxyribonuclease I içeren %0,25 trypsin içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 37 santigrat derecede 5 ila 15 dakika inkübe edin.

Ardından, enzimatik sindirimi durdurmak için %10FBS ile takviye edilmiş eşit hacimde DMEM ekleyin. Süspansiyonu 70 µm hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 2000G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı uzaklaştırın ve peleti 5 ila 10 mililitre PBS ile yıkayın. Süspansiyonu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2000G hızda tekrar santrifüjleyin. Tek hücre süspansiyonunu PBS içinde yeniden süspanse edin ve 15 santimetrelik bir kültür kabına eşit şekilde dağıtın.

Testis hücrelerini, daha önce GC2 hücreleri için gösterildiği şekilde çapraz bağlayın. Kontrol hücreleri için ışınlamayı atlayın. Çapraz bağlanan hücreleri toplayın.

Süspansiyonu 4 °C'de, 3000G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. En az 10 ila 12 fareden izole edilen testis hücrelerini birleştirerek minimum 500 miligram pelet kütlesi elde edin. Pelet tartıldıktan sonra, her bir mililitre tampon başına 100 miligram pelet oranında hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Vorteksleme işleminden sonra, lizat görsel olarak berraklaşana kadar odaklanmış bir ultrasonikatör veya benmari tipi sonikatör kullanarak örneğe sonikasyon uygulayın. Ardından, RNA ve protein analizi için lizattan yaklaşık 10 µL'lik alikotlar alarak mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Lizata 30 µL ön yıkama yapılmış manyetik boncuk ekleyin.

Örnekleri bir hibridizasyon fırınında 37 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe karıştırarak inkübe edin. Örnekleri, çözelti berraklaşana kadar veya yaklaşık bir dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Berraklaşan lizatı yeni bir tüpe aktarın.

Yeni tüpü manyetik standa yerleştirin. Ardından, kalıntı boncukları uzaklaştırmak için lizatı başka bir tüpe aktarın. Her örneğe 37 °C'ye ısıtılmış iki hacim hibridizasyon tamponu ekleyin.

Her 1 mL lizata, 100 µM stok probdan 1 µL olacak şekilde biotinillenmiş DNA probları ekleyin. Numuneleri, bir hibridizasyon fırınında, 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca uçtan uca rotasyonla inkübe edin. Kullanmadan hemen önce, 100 µL streptavidin manyetik boncuklarını hücre lizis tamponu ile üç kez yıkayın.

Ve son yıkamadan sonra kalan tamponu uzaklaştırın. Hibridizasyon reaksiyon tüplerini kısaca santrifüjleyin. Ardından, hibridize edilmiş örneği yıkanmış boncuklara ekleyin ve nazikçe karıştırın.

Boncuk süspansiyonunu orijinal tüpe geri aktarın ve karıştırarak 37 °C'de 30 ila 40 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası numuneleri kısa süreliğine santrifüjleyin. Tüpleri, çözelti berraklaşana kadar bir ila iki dakika boyunca manyetik standa yerleştirin.

Ardından, süpernatanı atın. Boncukları yıkamak için bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri hibridizasyon fırınında 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Beş yıkama işleminden sonra, RNA analizi için boncukların %1-10'unu temiz bir tüpe aktarın.

Son olarak, kalan boncuklara 40 µL 1X SDS örnek tamponu ekleyin. Proteinlerin elüsyonunu sağlamak ve çapraz bağları tersine çevirmek için örnekleri 95 °C'de 30 dakika boyunca kaynatın. Proteinleri sonraki kütle spektrometrisi analizi için geri kazanın.

ChIRP kütle spektrometrisi analizi, GC2 hücrelerinde negatif kontrole kıyasla zenginleşmiş 190'tan fazla protein tanımlamıştır. Santimetrekare başına 4.000 milijoule'lük bir UV dozunda, cPDiRT-MS daha seçici bir protein seti tanımlamıştır. Bu proteinlerin üçte ikisinden fazlası, geleneksel ChIRP-MS ile tanımlananlarla örtüşmektedir.

En az iki benzersiz peptid ile tanımlanan proteinlerin çoğu, hem GC2 hücrelerinde hem de fare testislerindeki biyolojik tekrarlarda tutarlı bir şekilde tespit edilmiştir. Tekrarlanabilir şekilde tanımlanan proteinlerin gen ontolojisi analizi, TUG1'in bilinen işlevleriyle genel olarak uyumlu biyolojik süreçler ortaya çıkarmıştır. GC2 hücresi ve fare testisi veri setlerinin karşılaştırılması, ortak olarak zenginleşmiş 15 protein belirlemiştir.

Geliştirilmiş çapraz bağlama immünopresipitasyon dizileme, PABPC1 ve CCT3 için TUG1 transkripti üzerinde net ve spesifik bağlanma piklerini ortaya çıkarmıştır. cPDiRT, araştırmacıların hem kültür hücrelerinde hem de doğal dokularda spesifik olarak bağlı RNA ile doğrudan etkileşime giren proteinleri tanımlamasına ve ölçmesine olanak tanır. En önemli zorluk, doğrudan RNA ve protein etkileşimleri için yüksek spesifite sağlarken etkili bir UV çapraz bağlama gerçekleştirmektir.

Protokolümüz, bu yaklaşımın diğer RNA'lara ve dokulara uygulanmasına yönelik gelecekteki çalışmaları destekleyerek, gelişim ve üremede doğrudan RNA protein etkileşimlerinin işlevselliğinin yeniden belirlenmesine katkı sağlayacaktır.