Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Merhaba, benim adım Frank Buchholz. Max PL Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetiği Enstitüsü'nde grup lideriyim. Çalışmalarımız sürdürülmektedir.

Çalışmalarımızın iki yönü bulunmaktadır. Birincisi RNA I taraması ile ilgilidir. Diğeri ise gelişmiş genom mühendisliği için bölgeye özgü rekombinaz geliştirilmesi ile ilgilidir.

Geçmişimle ilgili olarak; biyolog ve moleküler biyolog olduğumu, biyoloji eğitimimi tamamladığımı söyleyebilirim. Ardından Heidelberg'deki Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarları'nda doktora yaptım ve sonrasında San Francisco'daki UCSF'de Mike Bishop ile lösemi hayvan modelleri üzerine çalışarak doktora sonrası araştırmalarımı yürüttüm. Buradaki Max Planck Enstitüsü, temel olarak hücrelerin dokuları nasıl oluşturduğunu anlamaya çalışmak amacıyla, gelişim biyologları ve hücre biyologları gibi en az iki farklı alanı bir araya getirmeyi hedeflemektedir.

Bu, temel olarak Ston'daki enstitünün genel hedefidir. Temelde iki alan üzerinde çalışıyoruz. Alanlardan biri, biyolojik süreçlerde daha önce tanımlanmamış genlerin yeni işlevlerini belirlemeye çalışan RNAi taramaları yapmayı kapsamaktadır.

Diğeri ise, özellikle bölgeye özgü rekombinazlar kullanarak genomların gelişmiş mühendisliğini sağlayan teknolojiler geliştirmeye odaklanan genomik mühendislik ile ilgilidir. Bölgeye özgü rekombinazlar, örneğin üzerinde çalıştığımız cre rekombinaz sekizlerde keşfedilmişti, hatta seksenlerin başında keşfedilmişti. Bu aslında bir bakteriyel faji proteinidir. Yani aslen bir bakteriyel fajdan, temel olarak bakterileri enfekte eden bir virüsten gelir.

Bu nedenle, şu anda kullanılan yöntemlerden oldukça uzaktır, ancak bu enzimlerin diğer organizmalarda da kullanılabilecek çok ilginç işlevleri yerine getirebileceği hızla fark edilmiştir. Bölgeye özgü rekombinazlar, DNA'ya bağlanan proteinlerdir; DNA'nın belirli bir dizisine spesifik olarak bağlanırlar ve bu hedef dizilere bağlandıklarında DNA'yı kesip ardından bölgeleri yeniden düzenleyerek temel olarak ligasyon işlemini gerçekleştirirler. Dolayısıyla, bu bölgeye özgü rekombinasyon ile DNA dizilerini yeniden düzenleyebilirsiniz; bu durum, temel olarak DNA dizilerini daha önce bir araya gelmedikleri bir şekilde birleştirebilmenizi sağlayan bir makas ve yapıştırıcıya benzer.

Belirttiğim gibi, başlangıçta bakterilerde veya bakteri fajlarında keşfedilen bu bölgeye özgü rekombinazların, diğer organizmalarda da çalışıp çalışmadığı test edildi. İlginç bir şekilde, bu rekombinazlar diğer organizmalarda da işlevlerini yerine getirdiler.

Böylece, örneğin bir organizmaya mühendislik yoluyla yerleştirdiğiniz bölgeye özgü bir rekombinaz hedef bölgesi varsa, bu enzimler görevlerini yerine getirecektir. Bu bölgeye özgü rekombinazların, özellikle de flip rekombinaz veya bugün bahsettiğimiz çalışmanın başlangıç noktası olarak kullandığımız cre rekombinaz gibi herhangi bir kofaktöre ihtiyaç duymayanların kullanımı oldukça yaygındır. Bunlar kofaktör olmadan çalışırlar.

Ve eğer bunları örneğin bir hayvanda veya bir hayvan hücresinde ekspres ederseniz, bu organizmada tanıdıkları dizileri bulabilirler ve temel olarak tam orada kesip yapıştırarak belirli dizileri eksize edebilirler. Dolayısıyla bu enzimin kullanıldığı alanlardan biri, örneğin farelerin sözde koşullu mutajenezi işleminde çok başarılı bir şekilde kullanılmış olmasıdır. Diyelim ki ilginç olduğunu bildiğiniz bir geniniz var ve bu genin işlevinin ne olduğunu öğrenmek istiyorsunuz.

Oldukça yaygın bir deney, sözde knockout fare oluşturmaktır. Yakın zamanda gördüğünüz üzere, temel olarak bir farede gen delesyonu yapmayı sağlayan bu teknoloji, aslında bu yıl Nobel Ödülü'nü de kazandırmıştır. Ancak bazen, bir hayvanda bir geni nakavt ettiğinizde, bu genin esansiyel bir gen olduğunu ve farenin embriyogenez sırasında çok erken evrede öleceğini görürsünüz.

Bu durum, geninizin çok önemli olduğunu size söyler ancak işlevinin ne olduğunu tam olarak açıklamaz. Günümüzde bunu öğrenmenin çok yaygın bir yolu, sözde koşullu nakavt (conditional knockout) yapmaktır. Burada yapmanız gereken, ilgilendiğiniz geni bu bölgeye özgü rekombinazlar için hedef bölgelerle çevrelemektir.

Bu durum, söz konusu farelerde genin vahşi tip farelerde olduğu gibi eksprese edileceği anlamına gelir. Ancak, şimdi bu fareleri örneğin dokuya özgü bir promotör altında CRE rekombinazı eksprese eden bir fareyle çaprazlarsanız, rekombinazın nerede eksprese edildiğine bağlı olarak önceden belirleyebileceğiniz yalnızca belirli hücrelerde ilgilenilen geni silebilirsiniz. Bu deneylerden, bu rekombinasyonların tüm organizmalardan dizileri silmede çok etkili olabileceğini de biliyoruz.

Bu durum, önceden belirlediğimiz bölgede kesim yapan bir rekombinaz geliştirme fikrimiz için bir ön koşuldu; nitekim bu, bölgeye özgü rekombinazların geliştirilmesindeki temel kısıtlamalardan biriydi; zira tanıma hedef bölgesini, kullanmak istediğiniz organizmanın veya hücrenin genomuna entegre etmeniz gerekiyordu. Bu nedenle, bu engeli aşabilir miyiz diye düşündük.

Temelde moleküler evrim kullanılıyor. Bildiğim kadarıyla, şu an için bölgeye özgü rekombinazlar terapi amacıyla kullanılmamaktadır. Belirttiğim gibi, bunun temel nedeni, insan vücudunda doğada mevcut olan herhangi bir rekombinaz tarafından tanınacak bir hedef bölgenin bulunmamasıdır.

Bu nedenle, öncelikle değiştirilmeleri ve terapötik bir ortamda kullanılabilir hale gelmeleri gerekiyor. Şu an için bunun mümkün olup olmayacağının henüz çok başındayız. Bu enzimleri terapötik kullanım için gerçekten geliştirip geliştiremeyeceğimizi zaman gösterecek ve bunun mümkün olup olmadığını zamanla göreceğiz.