Name: AAVS1de Doksisiklin İndüklenebilir ASCL1/DLX2 İfadesi kullanılarak İnsan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden GABAerjik Nöronların Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Keşfedin, CRISPR/Cas9 ile AAVS1 lokusuna ASCL1/DLX2 genlerinin entegrasyonu ve doksisiklin ile indüklenebilir sistem kullanılarak insan iPS hücrelerinden GABAerjik nöronların üretimini. Bu yöntem, nörolojik hastalık modelleri için verimli ve tekrarlanabilir hücre farklılaşması sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
	<li>Barabino A, Flamier A, Hanna R, H&#233;on E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.</li>
	<li>Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer&#8217;s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.</li>
	<li>Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.</li>
	<li>Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).</li>
	<li>Wogram E, S&#252;mpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In&#160;Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.</li>
	<li>Mar&#237;n O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107&#8211;20. PubMed PMID: 22251963.</li>
	<li>Yang N, Ng YH, Pang ZP, S&#252;dhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.</li>
	<li>Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.</li>
	<li>Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.</li>
	<li>Gu J, Rollo B, Liu Z, O&#8217;Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>hiPSC'lerin elektroporasyonu/nükleofeksiyonu için.</td></tr><tr><td>6 kuyu kültür plakası</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>hiPSC bakımı ve farklılaşması için doku kültürü işlem görmüş plakalar.</td></tr><tr><td>BDNF (Beyin Türevli Nörotrofik Faktör)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>Nöronal olgunlaşma için rekombinant insan proteini; üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 ng/mL nihai konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>Hücre sayacı (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>Hücre sayımı için kullanılır.</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>Hücre peletleme için.</td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i veya eşdeğeri</td><td>Hümidifiye atmosfer ve %5 CO2 koruyan 37 &deg;C'de hücre kültürü inkübatörü.</td></tr><tr><td>Kriyotüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>hiPSC'leri dondurmak için steril kriyojenik vials; eşdeğer harici vidalı 1.8&ndash;2.0 mL kriyovialler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Ekstresi</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>Protokolde kullanılan standart BME kaplama matrisi. Bio-Techne analiz sertifikasından lot özgü stok konsantrasyonunu doğrulayın ve DMEM/F-12'de 80 &micro;g/mL çalışma konsantrasyonuna seyreltin.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>BME'yi seyreltmek için kullanılan bazal ortam.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil sülfoksit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Donma ortamı hazırlanmasında kullanılan kriyoprotektif.</td></tr><tr><td>Donör plazmid: uyarılabilir ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 hedefleme kaset</td><td>Özel plazmid</td><td>Addgene erişimi bekleniyor</td><td>Doksisiklin-uyarılabilir ASCL1-P2A-DLX2 kaseti ve seçim/reporter elemanlarını içeren özel AAVS1 donör plazmiti. Plazmit haritasını ve tam sırasını ek dosya olarak veya talep üzerine sağlayın.</td></tr><tr><td>Doksisiklin hiklat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>ASCL1-P2A-DLX2 ekspresyonunu indüklemek için kullanılır. Steril stok çözelti hazırlayın, alirkota ayırın, ışıktan koruyun, dondurulmuş olarak saklayın ve 1 &micro;g/mL nihai konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>Etanol (%70)</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Biyolojik güvenlik dolabının içinde sterilizasyon için; kurumsal onaylı %70 etanol veya eşdeğerini kullanın.</td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Reporter ekspresyonu ve nörnal morfoloji görüntülemede faz kontrast ve floresan görüntüleme için kullanılan mikroskop.</td></tr><tr><td>GDNF (Glial Türevli Nörotrofik Faktör)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>Nöronal olgunlaşma için rekombinant insan proteini; üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 ng/mL nihai konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>hiPSC hattı PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 insan iPSC hattı</td><td>Protokolde kullanılan ticari olarak mevcut açık onaylı insan iPSC hattı; düzenleme ve farklılaşma öncesi pasaj numarasını ve QC durumunu kaydedin.</td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>Açık kaynak; kullanılan sürüm rapor edilmelidir</td><td>Floresan kantifikasyon ve temsili görüntü işleme için.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serum Değiştirici (KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Donma ortamının hazırlanmasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>Sadece sorun giderme için isteğe bağlı reaktif. Standart kaplama protokolünün parçası değil; nörnal ayrılma devam ederse alternatif veya çift kaplama matrisi olarak kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus veya eşdeğeri</td><td>Kurumsal kriyojenik güvenlik prosedürlerine göre dondurulmuş hiPSC'lerin buharlaşma fazında veya sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolanması.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Donma Konteyneri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>-80 &deg;C'de hücrelerin kontrollü oranlı dondurulması için.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>hiPSC'ler için besleyicisiz bakım ortamı.</td></tr><tr><td>Nöro-indüksiyon ortamı</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>Erken nörnal indüksiyonda kullanılan ticari nör-indüksiyon ortamı.</td></tr><tr><td>Nöro-olgunlaşma baz ortamı (BrainPhys&trade; Nöronal Ortam)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>Nöronal olgunlaşma için baz ortam; protokolde açıklandığı gibi BDNF, GDNF, NT-3, doksisiklin ve PluriSln-1 ile takviye edin.</td></tr><tr><td>NT-3 (Nörotrofik Faktör 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>Nöronal olgunlaşma için rekombinant insan proteini; üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 ng/mL nihai konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>P3 Primer Hücre 4D-Nucleofector&trade; X Kiti</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>hiPSC nükleofeksiyonu için Çözelti P3 ve küvetler içeren kit.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Bakteryal kont

aavs1'de doksisiklin İndüklenebilir ascl1/dlx2 İfadesi kullanılarak İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden gabaerjik nöronların Üretimi

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

AAVS1'de Doksisiklin İndüklenebilir ASCL1/DLX2 İfadesi kullanılarak İnsan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden GABAerjik Nöronların Üretimi

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

Araştırmamız, insan nöronal çeşitliliğini ve hastalıklarını modellemek amacıyla hiPSC'lerden saf GABAerjik nöron popülasyonları üretmeye odaklanmaktadır. Mevcut protokoller, her farklılaştırma işlemi için tekrarlanan viral transdüksiyon gerektirmektedir. Bu protokol, AAVS1 hücre hattı kullanarak bu sınırlamayı gidermektedir.Başlamak için, 40 mililitre knock-out serum replacement veya KOSR ve 10 mililitre DMSO'yu 50 mililitrelik konik bir tüpte birleştirerek dondurma ortamını hazırlayın. Dondurma ortamını 10 kez pipetleyerek homojenize edin ve çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Ardından, bazal membran ekstraktını veya BME'yi, DMEM ve F12 ortamında 80 µg/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Seyreltilmiş BME'den 1 mililitreyi altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Çözeltinin kuyucukların tüm yüzeyine eşit şekilde dağılmasını sağlayarak kaplanmamış alan kalmadığından emin olmak için plakayı eğik tutun ve plakayı minimum 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.Bir aspirasyon pipeti kullanarak, insanla indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (hiPSC'ler) içeren kuyucuklardaki ortamı aspire edin. Kuyucuğa 1 mililitre ReLeSR ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe ed

generation-gabaergic-neurons-from-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Bu video, embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) nöroepitelyal agregatlara farklılaştırılması ve ardından bunların nöronal ve glial hücrelere bölünmesi sürecini göstermektedir. Bu yöntem, toksisite testi ve nörotoksisite ile ilgili farklı yolların değerlendirilmesi için test sistemleri olarak hizmet veren in vitro nöronal ve glial hücrelerin in vitro olarak verimli bir şekilde üretilmesine izin verir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Embriyoid Cisimlerden Nöronlar ve Glial Hücreler Üretilmesi

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinin, tetrasikline duyarlı elementin kontrolü altında nörojenik bir transkripsiyon faktörü geni taşıyan tasarlanmış lentivirüslerle transfekte edilerek nöronlara farklılaşmasını indükleme sürecini ve ardından bir tetrasiklin türevi ve olgunlaşma ortamı ile muameleyi göstermektedir.

Tasarlanmış Lentivirüsler Kullanılarak Nöronlarda İnsan Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Nöronal programlama ile üretilen insan pluripotent kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronların transplantasyonu, nörogelişimsel bozukluklar için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olabilir. Bu protokol, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronal öncüllerin yenidoğan farelerin beyinlerine üretilmesini ve transplantasyonunu tanımlar, aşılanmış nöronların uzun süreli araştırılmasına ve terapötik potansiyellerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Nörogelişimsel Bozuklukları Hafifletmek İçin Erken Postnatal Fare Hipokampüsüne Transplantasyonu

Keşfedin, CRISPR/Cas9 ile AAVS1 lokusuna ASCL1/DLX2 genlerinin entegrasyonu ve doksisiklin ile indüklenebilir sistem kullanılarak insan iPS hücrelerinden GABAerjik nöronların üretimini. Bu yöntem, nörolojik hastalık modelleri için verimli ve tekrarlanabilir hücre farklılaşması sağlar.

AAVS1de Doksisiklin İndüklenebilir ASCL1/DLX2 İfadesi kullanılarak İnsan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden GABAerjik Nöronların Üretimi (Video) | JoVE Journal

AAVS1'de Doksisiklin İndüklenebilir ASCL1/DLX2 İfadesi kullanılarak İnsan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden GABAerjik Nöronların Üretimi

Daha fazla video keşfet