ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mükemmel destekleri için Dr. Shital Suryavanshi'ye ve Tata Temel Araştırmalar Enstitüsü hayvanevi personeline teşekkür ederiz. Prosedürün videosunu kaydetmek için laboratuvarındaki Olympus MVX10 stereo makro zoom mikroskobunun kullanımına cömertçe izin verdiği için Dr. Sundar Naganathan'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı'ndan (DAE) alınan RTI4003 ve RTI4015 (ST) Proje Tanımlama No'lu hibe; ICMR-DHR SUG hibesi GAP00303 ve ANRF PMECRG hibesi GAP00313 (AP) tarafından finanse edilmiştir.

Tüm prosedürler, Tata Temel Araştırmalar Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve bu kurulun kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. Malzeme hazırlığı
<ol>
	<li>Prosedürden önce mikrodissection için gerekli tüm aletlerin (Materyal Tablosuna bakınız) hazırlandığından emin olun. Tüm aletleri %70 etanol kullanarak sterilize edin. Uzamsal transkriptomik/in situ hibridizasyon gibi alt uygulamalar için preparat toplarken, aletleri RNase dekontaminasyon solüsyonu ile silin.</li>
	<li>Dissection mikroskobu tablasını RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin ve dissection tezgahının yanına bir şişe buz gibi soğuk 1× PBS bulundurun.</li>
	<li>Bu prosedürden önce aşağıdaki aletleri ve plastik malzemeleri hazır tutun:
	<ol>
		<li>Hayvan preparasyonu için şunları hazır tutun: 2 çift küt uçlu pens, 1 çift cerrahi makas, 2 petri kabı (10 cm), ihtiyaca göre birkaç petri kabı (6 cm; her bir baş için bir tane).</li>
		<li>Beyni izole etmek için şunları hazır tutun: 1 çift #5 pens, 1 çift #55 pens, 1 çift mikrodissection makası ve alt uygulamaya uygun toplama tüpleri/kapları.</li>
		<li>NOT: Eğer alt uygulama in situ hibridizasyon veya uzamsal transkriptomik içeriyorsa, dissection aletlerini kullanmadan önce RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hayvan hazırlığı
<ol>
	<li>E14.5–P0 arası hayvanlar için (2.1.1– 2.1.6) adımları izleyin
	<ol>
		<li>Gebe anneyi Kurumsal Hayvan Etik Kurulu kılavuzlarına uygun olarak ötanize edin. Gösterilen örnekte, anne servikal dislokasyon yoluyla ötanize edilmiştir.</li>
		<li>Uterusu açığa çıkarmak için gebe annenin abdominal boşluğuna orta hat üzerinden bir insizyon yapın. Künt forseps kullanarak uterin hornları nazikçe dışarı çıkarın ve buz gibi 1×&#160;PBS içeren steril bir 10 cm'lik kaba yerleştirin.</li>
		<li>Bireysel fetusleri, çevreleyen amniyotik keseden ve plasentadan ayırarak dikkatlice izole edin.&#160;</li>
		<li>Fetusleri, buz gibi 1× PBS içeren taze bir 10 cm'lik petri kabına aktarın ve her biri beyin izolasyonu için alınana kadar buz üzerinde tutun. Tek bir fetusu buz gibi PBS içeren 6 cm'lik bir petri kabına aktarın.&#160;</li>
		<li>P7'ye kadar olan postnatal aşamalar için, yavruyu Kurumsal Hayvan Etik Kurulu kılavuzlarına uygun olarak ötanize edin. Ardından 2.1.6 adımından itibaren devam edin.</li>
		<li>Bir cerrahi makas kullanarak, ön beyni istenmeyen hasarlardan korumak amacıyla arka beyni de kapsayacak şekilde başı gövdeden ayırın.</li>
		<li>Kanı temizlemek için başı soğuk PBS ile yıkayın. Buz gibi 1× PBS içeren taze bir 6 cm'lik petri kabına aktarın. Sonraki diseksiyon adımları sırasında kanın ve kalıntıların yıkanıp gitmesini sağlamak için başı PBS içinde batmış halde tutun.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pineal bezin sağlam kaldığı beyin izolasyonu için diseksiyon prosedürü
NOT: Aşağıdaki tüm adımlar bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon boyunca beyni ve çevre yapıları net bir şekilde görebilmek için büyütmeyi en az 2× (veya gerektiği kadar) seviyesine ayarlayın. RNA ve protein degradasyonunu minimize etmek için tüm diseksiyon işlemi buz soğukluğunda PBS içerisinde yürütülmelidir. 3.1–3.10 arasındaki adımlar için, adım 3.1'deki talimatlara uygun olarak, başı sıkıca tutmak ve prosedür boyunca sabitlemek için baskın olmayan elinizi kullanın. 3.2–3.9 arasındaki adımlar, baskın olmayan elin başı sabitlediği, baskın elin ise ince motor becerileri gerçekleştirdiği şekilde yürütülmelidir; buna başlangıçta #5 pensle, ardından her adım için belirtilen şekilde #55 pens veya mikrodiseksiyon makaslarına geçilerek başlanmalıdır.&#160;
<ol>
	<li>Baskın olmayan el ile #5 pens kullanın. İki ucu, kararlı bir aşağı yönlü hareketle göz çukurlarına yerleştirin. 3.9. adım tamamlanana kadar beyni petri kabının altına sabitlemek için aşağı yönlü basıncı sürdürün.&#160; 
	NOT: Beyin, göz çukurlarının üzerinde yer alır ve pensin göz çukurlarına yerleştirilmesinden etkilenmez. Sabit bir aşağı yönlü basınç uygulamak, diseksiyon boyunca beyni stabilize eder.&#160;</li>
	<li>Baskın el ile, başı örten deriyi #5 pens kullanarak koparıp çıkarın.&#160; 
	NOT: Bu aşamada, beyni örten düzgün kondrokranyum görülür.</li>
	<li>Kondrokranyumun orta beyin-arka beyin üzerine gelen kısmını şu şekilde çıkarın:
	<ol>
		<li>#5 pens kullanarak, orta beynin telensefalon ile birleştiği noktada, orta beynin her iki yanındaki kondrokraniuma iki penetran insizyon yapın.</li>
		<li>#5 pensin bir ucunu, telensefalonu orta beyinden ayıran hayali teğetsel hat boyunca kondrokranyumun altına teğetsel olarak kaydırın. Sıkıca kavrayın ve kondrokranyumu yırtarak açın.</li>
		<li>Orta beyin ve arka beyin açığa çıkana kadar kondrokranyumu çıkarmaya devam edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>#55 pense geçiş yapın. Bir ucu, telensefalon üzerindeki kondrokranyumun kaudal kenarının hemen altına yerleştirin. Vasküler ve meningeal dokularla olan tüm bağlantıları ayırarak kondrokranyumu nazikçe separe edin.</li>
	<li>Bir mikrodiseksiyon makası kullanarak, dorsal telensefalik orta hat boyunca olfaktör bulba doğru kesin. Kapalı bir #55 pens kullanarak, kondrokranyumun beyne olan tüm bağlantılarını nazikçe temizleyin. Telensefalik hemisferleri örten kondrokranyumun iki yarısını #5 pens kullanarak ayırın. 
		NOT: Bu aşamada, SSS beynin içindeki kondrokranyumun üst kenarı boyunca koyu kırmızı bir ven olarak görülür ve TS, SSS'ye dik olarak görülür.</li>
	<li>Pineal bez, SSS'nin hemen altındadır. Bir mikrodiseksiyon makası kullanarak SSS'nin rostral ucundan bir kesi yapın.&#160;</li>
	<li>Pineal bezi, SSS ve TS'yi daha iyi açığa çıkarmak için #55 pens kullanarak kondrokranyumun dorsal kısmını her iki taraftan tamamen çıkarın.</li>
	<li>Bir mikrodiseksiyon makası kullanarak, pineal bezin her iki yanındaki TS üzerine iki kesi yapın. #55 pens kullanarak TS'nin lateral bağlantılarını ayırın.&#160;</li>
	<li>Kapalı bir #5 pens kullanarak, beynin rostral kısmını ventral kranial kubbeden nazikçe yerinden oynatın. Kapalı pensi beynin ventral tarafının altına kaydırarak beyni tamamen yerinden çıkarın.&#160;</li>
	<li>Beyni, sonraki uygulamalar için uygun şekilde pineal bez bütün halde kalacak şekilde saklayın.</li>
</ol>
4. Protokoldeki kritik adımlar
NOT: Bu diseksiyon protokolünün başarısı, pineal bezi çevreleyen vasküler bağlantıların dikkatli bir şekilde yönetilmesine bağlıdır. Diseksiyon prosedürü boyunca pineal bezin bütünlüğünü korumak için aşağıdaki noktalar kritik öneme sahiptir:
<ol>
	<li>#5 penset uçlarını her iki göz çukuruna yerleştirerek başı sabitleyin ve 3.1–3.9 arasındaki adımlar boyunca sabit bir aşağı doğru baskı uygulayın. Bu işlem, beyne doğrudan baskı yapmaktan kaçınırken stabil bir destek sağlar.</li>
	<li>Kondrokraniumun çıkarılması sırasında (adım 3.3), pineal bezin dorsal diensefalondan ayrılmasına neden olabileceği için aşırı çekme veya soyma işlemlerinden kaçının.</li>
	<li>Meningeal ve vasküler bağlantıların temizlenmesi (adım 3.4) ve dorsal telensefalik kondrokraniumun açılması (adım 3.5) sırasında yalnızca #55 pensetin uçlarını kullanın. Pensetin derinlemesine girmesi, kaudal telensefalik çatının hemen altında yer alan pineal beze zarar verebilir.</li>
	<li>Beyni çıkarmadan önce superior sagital sinüsün transeksiyonunu (adım 3.6) ve transvers sinüsün bilateral transeksiyonunu (adım 3.8) tamamlayın. Bu kesiler, dorsal venöz ağdaki gerilimi azaltır ve beyin çıkarımı sırasında pineal bezin yırtılmasını önler.</li>
	<li>Adım 3.9'da, dorsal orta hattın bozulmasına izin vermeden, kapalı penset kullanarak beyni nazikçe yerinden oynatın. Tüm meningeal ve vasküler bağlantılar serbest bırakıldığında, beyin kranyal kubbeden kolayca ayrılmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.</li>
	<li>Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.</li>
	<li>Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.</li>
	<li>Rath MF, Rohde K, Klein DC, M&#248;ller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.</li>
	<li>Estivill-Torr&#250;s G, Vitalis T, Fern&#225;ndez-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.</li>
	<li>Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.</li>
	<li>Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice&#39;s pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.</li>
	<li>Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.</li>
	<li>Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.</li>
	<li>Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by &#946;-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.</li>
	<li>Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.</li>
	<li>Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.</li>
	<li>Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.</li>
</ol>

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

İnsan fetal/bebek beyni için standartlaştırılmış pineal bez diseksiyon yöntemleri geliştirilmiş olup, bu yöntemler adli patologların ani bebek ölümü sendromunun nedenini anlamalarına yardımcı olmaktadır11. Önceki protokoller, pineal bezin yüzey damarları, meninges ve koroid pleksus ile birlikte çıkarıldığını göstermiştir12; ancak, fare veya diğer kemirgenlerin erken gelişim evrelerinde, diensefalik tavanla bağlantılı, sağlam bir pineal bezin güvenilir bir şekilde korunmasını sağlayan yöntemler tanımlanmamıştır.
Pinealektomi ve analizlerini tanımlayan klasik anatomik ve metodolojik literatürün büyük bir kısmı, bezin daha büyük ve tanımlanmasının daha kolay olduğu sıçan modelleri kullanılarak geliştirilmiştir13. Buna karşılık, fare pineal bezi önemli ölçüde daha küçük ve daha kırılgandır, bu da onu rutin beyin çıkarma prosedürleri sırasında kayba veya hasara karşı özellikle hassas hale getirir. Bazı çalışmalar, beyni tüm kafa ile birlikte sabitleyerek bu zorluğun üstesinden gelmeye çalışmıştır. Ancak bu durum, dokunun kesit alınması için hazırlanması sırasında ek teknik kısıtlamalar getirir. Örneğin, %4 paraformaldehit ile fiksasyonun ardından %30 sükrozda kriyoproteksiyon sırasında, kafa kemiği alttaki beyin dokusu üzerinde baskı uygulayabilir ve bu da dorsal ön beyin yapılarının sıkışmasına veya bozulmasına neden olabilir. Bu tür artefaktlar beyin morfolojisini bozabilir ve doğru anatomik organizasyona dayanan analizleri karmaşıklaştırabilir. Ayrıca, dokunun fikse edilmesi tüm uygulamalar için uygun olmayabilir. Bu nedenle, farenin pineal beziyle ilgili gelişimsel ve moleküler çalışmaları kolaylaştırmak için, genel beyin bütünlüğünü bozmadan pineal bezi koruyan ve diensefalon tavanına olan bağlantısını sürdüren yöntemlere ihtiyaç vardır.
Bütün halindeki beyin preparatlarında pineal bezin güvenilir bir şekilde korunması, birçok deneysel uygulama için önemlidir. İmmünohistokimya ve in situ hibridizasyon gibi histolojik ve moleküler yaklaşımlar, bez içindeki gen ekspresyonunu ve hücresel organizasyonu incelemek için doku mimarisinin korunmasını gerektirir. Daha yakın zamanda, uzamsal transkriptomik ve diğer uzamsal olarak çözünür moleküler profilleme yöntemleri gibi gelişmekte olan teknolojiler de gen ekspresyonunu belirli anatomik bağlamlarda haritalamak için bütün doku morfolojisine dayanmaktadır. Bugüne kadar, embriyonik fare pineal bezinin herhangi bir uzamsal transkriptomik haritası rapor edilmemiştir. Bu durum, kısmen, geleneksel beyin diseksiyonu sırasında bütün pineal bezin korunmasındaki teknik zorluğu yansıtıyor olabilir. Bu nedenle, pineal bez bütünlüğünü güvenilir bir şekilde koruyan yöntemlerin, pineal bez biyolojisinde gelişmekte olan uzamsal transkriptomik yaklaşımların uygulanmasını kolaylaştırması muhtemeldir. Ek olarak, pineal bez toplam beyin dokusunun çok küçük bir kısmını oluşturduğundan, beynin pineal bez bütünlüğü korunarak izole edilmesi, daha sonra pineal bezinle özel olarak toplanması adımına olanak tanır ve bu tür toplamaların birleştirilmesi, transkriptomik ve proteomik çalışmalardaki toplu analizlerde pineal-özgü temsiliyetin zenginleştirilmesini önemli ölçüde artıracaktır.
Non-dominant eldeki bir #5 pens yardımıyla başın iyice sabitlenmesi gereklidir. Bu durum diseksiyon süreci boyunca sürdürülmelidir; bu nedenle, dominant el gerektiğinde enstrüman değişimini yönetmelidir. Pineal bezin, uzaklaştırılması gereken üzerindeki vaskülo-meningeal dokuya olan bağlantılarını daha iyi görebilmek için aydınlatmayı ayarlayın.

Epifiz bezi, omurgalı beyninin dorsal orta hattında yer alan küçük bir nöroendokrin yapı olup, melatonin hormonunun ritmik salınımı aracılığıyla sirkadiyen fizyolojinin düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar1,2. Memeli embriyogenezi sırasında epifiz bezi, gelişmekte olan ön beynin dorsal orta hattından köken alır. Farelerde epifiz gelişimi, dorsal diensefalik nöroepitelyumun özelleşmiş bir bölgesinin epifiz anlage/epifiz resessini oluşturmasıyla başlar; bu yapı daha sonra embriyonik gün (E) 14,5'te dışa doğru büyüyerek epifiz divertikülünü oluşturur3,4,5. Bu divertikül, diensefalonun tavanına yapışıktır ve çift telensefalik veziküller arasında görülür. Gelişim ilerledikçe, bu divertikül beynin dorsal orta hattındaki üst yapılarla, özellikle de ön beynin dorsal yüzeyi boyunca uzanan venöz kanallar olan superior sagittal sinüs (SSS) ve transvers sinüs (TS) ile yakın ilişki kurar6. Gelişmekte olan epifiz bezi, SSS ve TS'nin kesişim noktasının hemen altında yer alır ve dorsal diensefalona olan hassas bağlantısı, beyni kafa kemerinden çıkarmak için üzerindeki vasküler-meningeal yapıların kaldırıldığı sırada özellikle savunmasızdır7. Bu durum, kafa kemeri beyin çıkarma işlemi için açıldığında epifiz bezinin kopma ihtimali nedeniyle, bezin hasara karşı özellikle hassas olmasına yol açar. Sonuç olarak, epifiz bezi rutin diseksiyonlar sırasında sıklıkla kaybedilir; bu da sağlam preparasyonlarda bezin yapısının ve moleküler kompozisyonunun analiz edilmesini kısıtlar.
Burada, pineal bezin ve diensefalon tavanına olan bağlantısının korunduğu fare beyni diseksiyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, E16.5'ten erken postnatal aşamalara (P7) kadar olan embriyonik evrelere uygulanabilir ve in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve mekansal transkriptomik kullanılarak yapılan pineal bez gelişim çalışmaları için uygundur. Alt uygulamaların bir göstergesi olarak, pineal bezde zenginleşen marker CRX için in situ hibridizasyon ve immünohistokimya sunulmuştur.
Bu yöntemdeki temel yenilik, beyin kafatası boşluğundan çıkarıldığında epifiz bezinin kopmasına neden olacak fiziksel bağlantıların dikkatle uzaklaştırılmasıyla, orta hat yapıları üzerindeki stresin minimize edilmesidir. Bu, standart prosedüre göre bir iyileştirmedir.
Bu diseksiyon yöntemi P7 evresine kadar olan aşamalarla sınırlıdır; çünkü erken postnatal gelişim sırasında kafa kubbesinin ilerleyici kemikleşmesi, kafatasının sertliğini artırır ve meningeal ve vasküler yapılarla olan bağını güçlendirir. Yetişkin kemirgenlerde epifiz bezi diseksiyon prosedürlerini tanımlayan birçok çalışma olsa da8, bezin özellikle kırılgan olduğu ve beyin izolasyonu sırasında hasara karşı hassas olduğu embriyonik ve erken postnatal evrelerde epifiz bezinin korunmasına odaklanan çok az çalışma bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Aydınık alan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Renkli kameraya sahip herhangi bir aydınık alan mikroskobu uygundur.</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td>Gerekli çözünürlüğe bağlı olarak herhangi bir konfokal mikroskop veya epifloresan mikroskop uygundur</td></tr><tr><td>CRX antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-32182</td><td>Parichha et al.&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; tarafından tanımlanan immün boyama protokolü.</td></tr><tr><td>CRX probu</td><td>Custom made</td><td>Custom made</td><td>Parichha et al.&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt; in situ hibridizasyon protokolü.</td></tr><tr><td>Hassas pens&amp;nbsp;# 5</td><td>F.S.T</td><td>11251-23</td><td>Herhangi bir şirketin benzer araçlarıyla değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Hassas pens&amp;nbsp;# 55</td><td>F.S.T</td><td>11255-20</td><td>Herhangi bir şirketin benzer araçlarıyla değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Herhangi bir şirketin benzer ürünleriyle değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Corning</td><td>CLS351029</td><td>Herhangi bir şirketin benzer ürünleriyle değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9782</td><td>RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu, temas anında RNase'leri yok eden bir yüzey dekontaminasyon solüsyonudur&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yaylı makas (mikrodiseksiyon makası)</td><td>F.S.T</td><td>15020-15</td><td>Herhangi bir şirketin benzer araçlarıyla değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Stereo zoom mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Herhangi bir diseksiyon mikroskobu uygundur</td></tr></tbody></table>

perinatal fare beyni preparasyonlarında pineal bezinin korunması

Preserving the Pineal Gland in Perinatal Mouse Brain Preparations

Melatonin salgılayan nöroendokrin bir yapı olan pineal bez, embriyonik ön beyindeki dorsal orta hatta bulunan bir anlage'den oluşur. Farede embriyonik gün (E) 14,5'te, çift telensefalik veziküller arasında, diensefalonun tavanından dışarı doğru çıkan bir pineal divertikül görülür. Bu divertikül; üzerindeki kıkırdak, meningeal ve vasküler doku ile yakın temas halindedir. Geç embriyonik veya erken postnatal evrelerde beyni çıkarmak için kraniyal kavis açıldığında, bu yapı kolayca kaybolur. Önemli nöroendokrin rolüne rağmen, pineal bezin erken gelişimi ve bu süreci düzenleyen sinyal mekanizmaları, kısmen fare beyninin embriyonik gelişimi sırasında bu yapının sağlam korunmasının zorluğu nedeniyle hala yetersiz anlaşılmaktadır.
Bu makale, embriyonik evrelerden postnatal (P) 7. güne kadar beyin izolasyonu sırasında, pineal bezin yapısal bütünlüğünü ve diensefalon tavanına olan bağlantısını koruyan yenilikçi bir diseksiyon prosedürünü sunmaktadır. Prosedür, E18.5 fare beyni kullanılarak gösterilmiştir ve bu nedenle in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve mekansal transkriptomik dahil olmak üzere doku mimarisinin korunmasını gerektiren sonraki uygulamalar için uygundur. Protokol, gelişmekte olan pineal bezin izole edilmesi için de kullanılabilir; böylece küçük boyutu nedeniyle normalde zorlayıcı olan, transkriptomik ve proteomik analizlerde pineal beze özgü temsilin artırılması sağlanır.

Bu diseksiyon protokolü, epifiz bezinin doğal anatomik konumunda korunduğu E16.5–P7 arası embriyonik ve erken postnatal fare beyinlerinin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlar (Şekil 1).
Kondrokraniyumun aşamalı olarak çıkarılması, meningeal ve vasküler bağlantıların dikkatle temizlenmesiyle birleştiğinde, pineal bez üzerinde istem dışı makaslama stresinin oluşmasını önler. Ayrıca, superior sagittal sinüsün (SSS) rostral ucundan kontrollü bir şekilde kesilmesi ve transvers sinüste (TS) yapılan bilateral kesiler, dorsal vasküler ağdaki gerginliği etkili bir şekilde serbest bırakır. Bu işlem, sonraki beyin çıkarma işlemi sırasında pineal bezin kopmasını engeller. Sonuç olarak, beynin kraniyal kubbeden izole edilmesinin ardından pineal bez bozulmadan kalır ve diensefalik orta hatta tutunmuş durumdadır (Şekil 2A).
Korunan pineal bezin bütünlüğünü ve sonraki uygulamalar için uygunluğunu test etmek amacıyla, pineal bez markörü Crx için in situ hibridizasyon ve CRX proteini için immünohistokimya gerçekleştirilmiştir9,10(Şekil 2B–D). Bu işlem, pineal bezin kimliğini ve yapısal bütünlüğünü doğrulamıştır.
Diseksiyon protokolü birden fazla gelişim aşamasında doğrulanmış ve denemelerin büyük çoğunluğunda pineal bez bozulmadan korunmuştur: E16.5 (N = 10), E18.5 (N = 15), P0 (N = 10) ve P7 (N = 6). Bu durum, yöntemin embriyonik ve erken postnatal beyin izolasyonu sırasında pineal bezi korumak için sağlam ve yüksek derecede tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir (Şekil 2E).
<img alt="Mikrodiseksiyon tekniği diyagramı: pens ve makas kullanılarak kondrokraniumun çıkarılma süreci." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Pineal bezin bütünlüğü korunarak E18.5 fare beyninin izole edilmesine yönelik adım prosedürü gösteren videodan kareler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig1largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="E18.5 fare beyin anatomisi; pineal bez bağlantısı, koronal kesit diyagramı, Crx ekspresyonu, DAPI/CRX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2Temsili sonuçlar. (A) Standart diseksiyon prosedürü sırasında pineal bezin koptuğu iki E18.5 fare beyninin temsili örnekleri (sol), tanımlanan yöntem kullanılarak pineal bezin sağlam kaldığı bir beyinle karşılaştırılmıştır (sağ). (B) Pineal bezin pembe renkte gösterildiği E18.5 koronal kesitinin şematik illüstrasyonu. (C) In situ için hibridizasyon Crx E16.5 ve E18.5 aşamalarında, epifiz bezine özgü ekspresyon göstererek. (D) E18.5'te CRX için immün boyama. (E) Protokolün embriyonik (E16.5 ve E18.5) ve postnatal (P0 ve P7) gelişim evrelerindeki başarı (pineal bez sağlam şekilde beyin izolasyonu) ve başarısızlık (pineal bezin hasar görmesi veya kaybı) oranlarını gösteren sütun grafiği. Ölçek çubukları: 100 µmA, C ve D için N = 6 biyolojik tekrar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, beyin kafatası boşluğundan çıkarıldığında genellikle kaybolan epifiz bezini koruyan bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol; immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve uzamsal transkriptomik dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için embriyonik ve erken postnatal fare beyni preparasyonlarında epifiz bezinin korunmasını sağlar.

Perinatal Fare Beyni Preparasyonlarında Pineal Bezinin Korunması

Melatonin salgılayan nöroendokrin bir yapı olan pineal bez, embriyonik ön beyindeki dorsal orta hatta bulunan bir anlajdan gelişir. Embriyonik ...

preserving-the-pineal-gland-in-perinatal-mouse-brain-preparations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Fare aksesuar koku ampul (AOB) duyusal kodlama bağlamında çalışma zor olmuştur. Burada, biz AOB nöronlar fare feromonlar ve Kayromonlar bir bilgi işleme araştırmalarını kolaylaştırmak, onların çevresel girişlerine işlevsel bağlı kaldığı bir ex vivo hazırlık üreten bir diseksiyon göstermektedir.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Supraspinal projeksiyonlar ağrı algısı ve diğer davranışlar için önemlidir ve serotonerjik lifler bu lif sistemlerinden biridir. Bu çalışma, bu serotonerjik liflerin sonlandırılmasını araştırmak için kombine CLARITY/CUBIC protokolünün fare omuriliğine uygulanmasına odaklanmıştır.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Locus coeruleus nöronlar fizyolojik süreçleri çeşitli ilgili küçük bir kümesidir. Burada, biz fare beyin bölümleri çalışmalar proteinler ve bu çekirdek metal analizleri hazırlamak için bir protokol tanımlamak.

Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu

Tata Institute of Fundamental Research.  Here we present a dissection protocol that preserves the pineal gland, which is often lost when the brain is removed from the cranial vault. This protocol ensures retention of the pineal gland in embryonic and early postnatal mouse brain preparations for downstream applications, including immunohistochemistry, in situ hybridization, and spatial transcriptomics.

Perinatal Fare Beyni Preparasyonlarında Pineal Bezinin Korunması

Daha fazla video keşfet