Name: İnsan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini izlemek için canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Keşfedin canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip yöntemini insan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini incelemek için. Bu protokol epitel biyolojisi ve hastalık mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Barker N, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-7.</li>
	<li>Clevers H. Shifting paradigms in tissue stem cell biology: insights from the intestine. Cell. 2026;189(3):706-24.</li>
	<li>Betjes MA, Kok RNU, Tans SJ, van Zon JS. Cell tracking with accurate error prediction. Nat Methods. 2025;22(11):2400-10.</li>
	<li>Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459(7244):262-5.</li>
	<li>Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#39;s epithelium. Gastroenterology. 2011;141(5):1762-72.</li>
	<li>He GW, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of Paneth cell formation. Cell Stem Cell. 2022;29(9):1333-45.e6.</li>
	<li>Artegiani B, et al. Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR-Cas9 precision genome editing. Nat Cell Biol. 2020;22(3):321-31.</li>
	<li>Celotti M, et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation CRISPR tools. STAR Protoc. 2024;5(3):103189.</li>
	<li>Krueger D, et al. Epithelial tension controls intestinal cell extrusion. Science. 2025;389(6764).</li>
	<li>Buissant des Amorie JR, et al. Intestinal tuft cell subtypes represent successive stages of maturation driven by crypt-villus signaling gradients. Nat Commun. 2025;16(1):6765.</li>
	<li>Huang L, et al. Tuft cells act as regenerative stem cells in the human intestine. Nature. 2024;634(8035):929-35.</li>
	<li>Wang D, et al. Interferon-responsive intestinal BEST4/CA7+ cells are targets of bacterial diarrheal toxins. Cell Stem Cell. 2025;32(4):598-612.e5.</li>
	<li>Jain A, et al. Morphodynamics of human early brain organoid development. Nature. 2025;644(8078):1010-9.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, van Rheenen J, Suijkerbuijk SJE. Generation of mixed murine organoids to model cellular interactions. STAR Protoc. 2021;2(4):100997.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, et al. Active elimination of intestinal cells drives oncogenic growth in organoids. Cell Rep. 2021;36(1):109307.</li>
	<li>Serra D, et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 2019;569(7754):66-72.</li>
	<li>de Medeiros G, et al. Multiscale light-sheet organoid imaging framework. Nat Commun. 2022;13(1):4864.</li>
	<li>Huelsz-Prince G, et al. Mother cells control daughter cell proliferation in intestinal organoids to minimize proliferation fluctuations. eLife. 2022;11.</li>
	<li>Zheng X, et al. Organoid cell fate dynamics in space and time. Sci Adv. 2023;9(33).</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Live cell imaging of mouse intestinal organoids reveals heterogeneity in their oxygenation. Biomaterials. 2017;146:86-96.</li>
	<li>Gros A, et al. A quantitative pipeline for whole-mount deep imaging and analysis of multi-layered organoids across scales. eLife. 2026;14.</li>
	<li>Nagarajan S, Naganathan SR. Pushing the limits of automated cell tracking. Nat Methods. 2025;22(11):2236-8.</li>
	<li>Kok RNU, et al. OrganoidTracker: efficient cell tracking using machine learning and manual error correction. PLoS One. 2020;15(10).</li>
	<li>Martinez-Silgado A, et al. Differentiation and CRISPR-Cas9-mediated genetic engineering of human intestinal organoids. STAR Protoc. 2022;3(3):101639.</li>
	<li>van der Linden FH, Okkelman IA, Ioannou M, Dmitriev RI. A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium. Nat Commun. 2021;12(1):7159.</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Extracellular Ca2+-sensing fluorescent protein biosensor based on a collagen-binding domain. ACS Appl Bio Mater. 2020;3(8):5310-21.</li>
	<li>Nguyen NTB, et al. Lactate controls cancer stemness and plasticity through epigenetic regulation. Cell Metab. 2025;37(4):903-19.e10.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>sıcaklık ve CO2 için iklim kontrolü ile</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>açık kaynak</td><td></td><td>açık kaynak https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>uzak kırmızı canlı hücre çekirdek boyası</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>açık kaynak</td><td></td><td>açık kaynak https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>plazmid oluşturma protokolü DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>plazmid oluşturma protokolü DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>plazmid oluşturma protokolü DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>uzak kırmızı canlı hücre DNA boyası</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitörü)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>Wnt3A koşullandırılmış ortam üretimi burada bulunabilir:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini izlemek için canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

Araştırmamız, bireysel hücrelerin kendi kendini yenileyen intestinal epitelyum içerisinde kader kararlarını nasıl verdiğine ve davranışlarını nasıl koordine ettiğine odaklanmaktadır. Işık mikroskobu, örneğin bir hücrenin membran kompartmanı veya hücre iskeleti gibi yaygın bir belirteci ayırt edemez ve bunu gerçekten tek bir hücreye veya komşularına atfedemez. Ancak mozaik organoidler bu kısıtlamanın aşılmasına yardımcı olabilir.Başlamak için gerekli reaktifleri ve valide edilmiş fare ve insan floresan raporlayıcı intestinal organoid hatlarını temin edin. Kök hücre genişlemesini teşvik etmek ve disosiasyon sırasında hücre canlılığını maksimize etmek için, mozaik organoid oluşturma işleminden üç gün önce her iki organoid hattını da Wnt-kondisyonlu ortama pasajlayın. DMEM içinde %5 BME hazırlayın. Hücrelerin tutunması için ince bir yapışkan tabaka sağlamak amacıyla, 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna hazırlanan BME'den 20 microliter kaplayın, ardından 37 degrees Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, buz gibi soğuk bazal ortam ekleyerek BME'yi çözün. Her bir hattaki organoidleri, 4 degrees Celsius'ta beş dakika boyunca 300 g'de santrifüj ederek ayrı ayrı toplayın. Organoidleri, 37 degrees Celsius'daki bir su banyosunda 5 ila 7 dakika boyunca enzimatik hücre ayırma çözeltisinde inkübe ederek tekil hücrelere disosiye edin. Mekanik disosiasyona yardımcı olmak için P1000 pipet kullanarak süspansiyonu tekrar tekrar pipetleyin. Disosiasyonu parlak alan mikroskobu altında izleyin. Ağırlıklı olarak tekil hücreler veya 2 ila 10 hücreli küçük organoid fragmanları görüldüğünde, fazla miktarda buz gibi soğuk bazal ortam ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından hücreleri 4 degrees Celsius'ta beş dakika boyunca 300 g'de santrifüj ederek çöktürün. Trypan blue eksklüzyon yöntemini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin ve canlı hücreleri sayın. Fare mozaik organoidleri için 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride ile takviye edilmiş 500 microliter Wnt-kondisyonlu ortamda veya insan mozaik organoid kültürleri için insan genişletme ortamında toplam 300.000 hücre elde etmek üzere iki hücre popülasyonunu istenen oranda birleştirin. Nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, 48 kuyucuklu plakalardan kaplama ortamını uzaklaştırın ve hücre süspansiyonunu kaplanmış kuyucuklara ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 g'de santrifüj edin ve 37 degrees Celsius'ta inkübe edin. Bir P200 pipet ucunu eğerek hazırlayın. 24 saat sonra, hücre tabakasını eğilmiş pipet ucuyla sıyırarak mekanik olarak ayırın, ardından buz gibi soğuk bazal ortamla iyice yıkayın. Ayrılan agregatları, ek mekanik kesme işlemi uygulamadan 4 degrees Celsius'ta üç dakika boyunca 300 g'de santrifüj ederek toplayın. Agregatları BME içinde yeniden süspanse edin ve görüntüleme uyumlu örnek taşıyıcılara ekleyin. Ekilen agregatları, fare mozaik organoidleri için ENR ortamında ve insan mozaik organoidleri için insan genişletme ortamında kültüre edin.Yüksek sayısal açıklıklı konfokal objektiflerle optik uyumluluğu sağlamak için cam tabanlı görüntüleme odaları kullanın. Organoid-BME süspansiyonunu cam tabanın merkezine yakın bir bölgeye ince bir kubbe şeklinde yerleştirin. Organoidlerin yerçekimi ile cam tabana çökmesini sağlamak için plakayı 4 °C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin. Plakayı 37 °C'ye aktarın ve BME'nin katılaşması için 20 ila 30 dakika bekleyin. Her bir kuyucuğa 500 µL önceden ısıtılmış büyüme medyumu ekleyin. Canlı görüntülemeye başlamadan önce, organoidlerin toparlanması ve morfolojilerinin oluşması için en az 24 saat bekleyin. Uzun süreli zaman ayarlı görüntüler elde edin ve ileri analizler için tek hücre takibi ile soy ağacı rekonstrüksiyonu gerçekleştirin.Başarılı mozaik oluşumu, kullanılan disosiyasyon derecesine bağlı olarak, ya "tuz-biber" (salt-and-pepper) dağılımı ya da iki popülasyon arasında belirgin sınırlar ile karakterize edildi. Kapsamlı tek hücreli disosiyasyon tuz-biber mozaikleri oluştururken, hafif fragmantasyon küçük klonal kümeleri korudu. İlgilenilen bir raporeri ko-eksprese eden tek bir hücre, etrafı işaretlenmemiş komşu hücrelerle çevrili olduğunda; göç, bölünme veya ekstrüzyon sırasındaki sitoskeletal dinamikleri kesin olarak o hücreye atfedilebilir. Nükleer H2B raporerleri, mozaik içindeki bilgilendirici hücre konstellasyonlarının tanımlanmasını kolaylaştırdı ve takip verilerinden yaşam boyu bölünme hızı ile raporer yoğunluk dinamikleri gibi hücre başına ölçümler elde edildi. Goblet hücreleri, görüntüleme süresi boyunca yüksek MUC2-mNeonGreen ekspresyonunu aktive etti ve sürdürdü; Paneth hücreleri ise başlangıçta MUC2-mNeonGreen aktivasyonu, ardından kademeli bir sinyal azalması ve sonrasında DEFA5-dsRed aktivasyonu sergiledi. Tek hücreli kantifikasyon, bu ardışık geçişi bireysel hücre düzeyinde doğruladı. Takip edilen birden fazla hücre üzerinden hesaplanan ortalama yoğunluk eğrileri, bu paternin popülasyon düzeyinde tutarlı olduğunu ve Paneth hücresi öncüllerinin MUC2-mNeonGreen ve DEFA5-dsRed sinyalleri arasında karakteristik bir ters ilişki sergilediğini kanıtladı.Bu protokol, araştırmacıların bireysel hücrelerin hücre iskeletini nasıl yeniden yapılandırdığını; örneğin bölünme, migrasyon veya bütün bir doku içindeki ekstrüzyon sırasında nasıl değiştiğini incelemesine olanak tanır. Burada dikkat edilmesi gereken önemli husus, etiketleme oranının seçimidir; çünkü seyrek raporlayıcı hücreler tek hücre sinyallerini izole ederken, seyrek etiketlenmemiş hücreler komşuluk yanıtlarını ortaya çıkarır. Gelecekteki çalışmalar, kader belirleme süreçlerini tek hücre iskeleti dinamikleriyle ilişkilendirmek için tek bir organoidde kader raporlayıcılarını mozaik etiketleme ile birleştirebilir.

live-cell-imaging-single-cell-tracking-to-monitor-clonal-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Mikropatterned diziler kullanılarak tek hücrelerden floresan muhabir zaman kurslarının alınması için bir yöntem sunuyoruz. Protokolde, tek hücreli dizilerin hazırlanması, canlı hücre tarama zaman atlamalı mikroskopinin kurulumu ve çalışması ve otomatik önseçim, görsel kontrol ve yapıştırma alanı başına hücre entegre floresan zaman kurslarının izlenmesi için açık kaynaklı bir görüntü analiz aracı açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Keşfedin canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip yöntemini insan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini incelemek için. Bu protokol epitel biyolojisi ve hastalık mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

İnsan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini izlemek için canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip (Video) | JoVE Journal

İnsan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini izlemek için canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip

Daha fazla video keşfet