Name: Farelerde Madde Uygulaması ve Kan Örneği Alımı için Refah Odaklı Manuel Sabitleme Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Öğrenin farelerde uygulama tüneli kullanarak refah odaklı sabitleme tekniğini. Bu yöntem, enjeksiyon ve kan örneği alımı sırasında akut stresi azaltarak hem hayvan refahını hem de deneysel veri kalitesini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Desteği için Charité hayvan tesisi personelimize ve hayvan refahı sorumlularına, özellikle de Dr. André Dülsner'e; uygulama tünelinin yaygınlaştırılması için sağladıkları finansal destek için Charité 3R'ye ve faydalı tartışmaları için Charité 3R İyileştirme Görev Gücü'nün tüm üyelerine teşekkür ederiz.

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler yetkili yerel makam (Berlin Sağlık ve Sosyal İşler Eyalet Ofisi (LAGeSo); onay numarası 2022-077-G)) tarafından incelenmiş ve onaylanmış olup, ARRIVE 2.0 kılavuzlarına uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. İntravenöz uygulama
NOT: Bu yöntem, farelerde intravenöz uygulama için refah odaklı bir manuel zapturapt yaklaşımını tanımlamaktadır. İntravenöz enjeksiyonlar, kurumsal kılavuzlara ve belirlenmiş güvenlik ile hijyen prosedürlerine uygun olarak, yalnızca eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir.
<ol>
	<li>Hayvanların hazırlanması 
	DİKKAT: Hayvanlarla çalışırken kurumun biyogüvenlik ve hijyen gerekliliklerine uygun olarak her zaman gerekli kişisel koruyucu ekipmanları (PPE) (örneğin; önlük, eldiven, bone, maske) kullanın.
	<ol>
		<li>Vazodilatasyonu teşvik etmek ve kuyruk venlerinin görünürlüğünü artırmak için ana kafesi 10–15 dk boyunca kırmızı bir lambanın altına yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Çalışma alanının hazırlanması
	<ol>
		<li>Uygulama tünelini %70 etanol ile temizleyin. Etanolün yaklaşık 5 dk boyunca tamamen buharlaşmasını bekleyin.</li>
		<li>Yıkanmış ve otoklavlanmış, rulo yapılmış bir astarlama parçasını (Vetbed Isobed'i istenen boyutta kesin) tünelin içine yerleştirin (Şekil 1B).</li>
		<li>Parmaklarınızı kullanarak, kalan açıklık yaklaşık iki bitişik parmak genişliğine gelene kadar tünel girişindeki astarlamayı nazikçe sıkıştırın. Astarlamayı daha fazla sıkıştırmayın.</li>
		<li>Uygulama tünelini çalışma yüzeyine konumlandırın ve tünel girişinin önüne düz bir astarlama parçası daha yerleştirin.</li>
		<li>İstenen enjeksiyon çözeltisini içeren 27G iğne takılmış enjeksiyon şırıngasını hazırlayın ve tünelin yanına yerleştirin. Pamuklu çubukların ve dezenfektan spreyin hazır olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tünelde refah odaklı zapt etme
	<ol>
		<li>Fareyi bir taşıma tüpü kullanarak ana kafesten aktarın.</li>
		<li>Taşıma tünelini doğrudan tünel açıklığının önüne yerleştirerek farenin uygulama tüneline gönüllü olarak girmesini sağlayın (Şekil 1C). 
		NOT: Bazı fareler tünele gönüllü olarak girmeden önce uygulama tünelinin önüne yerleştirilen astarlamanın üzerine çıkmayı tercih ederler. Farelerin tünelin içinde çok derine gitmesi, kuyruk tabanından nazikçe tutularak engellenebilir.</li>
		<li>İçeri girdiğinde fare genellikle rulo yapılmış astarlamanın içinde, arkasını dönmeden konumlanır. 
		NOT: Eğer fareler tünele girmiyorsa, açıklık çok küçük olabilir; tünel girişindeki astarlamayı hafifçe sıkıştırın. Eğer fareler çok küçükse ve dönme eğilimindelerse, rulo astarlamayı sıkılaştırın veya ek bir katman ekleyin (Şekil 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>İntravenöz enjeksiyon 
	NOT: İntravenöz enjeksiyon, yaygın olarak kullanılan geleneksel kuyruk veni enjeksiyon prosedürleri kullanılarak gerçekleştirilir.
	<ol>
		<li>Kuyruğu ucundan tutarak nazikçe düzeltin ve planlanan enjeksiyon bölgesini dezenfekte edin. Kuyruğu, lateral kuyruk venlerini dorsal konuma getirmek için yaklaşık 90° döndürün.</li>
		<li>Gerektiğinde daha proksimal bölgelerde ek denemeler yapabilmek için enjeksiyona kuyruğun distal ucundan başlayın. 
		KRİTİK ADIM: İğneyi kuyruğa göre yaklaşık 15–20°'lik bir açıyla, kuyruğa neredeyse paralel tutarak yerleştirin. Kuyruk venleri yüzeysel olduğu için iğneyi sadece eğim kısmının biraz ötesine ilerletin. Doğru iğne yerleşimi, enjeksiyon sırasında minimum dirençle ve enjekte edilen çözeltinin ven boyunca görünür akışıyla kendini belli eder. İstenen hacmi yavaş ve sabit bir hızla enjekte edin (13 s boyunca ≤5 mL/kg). İğneyi çektikten sonra, kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesine steril bir pamuklu çubukla nazikçe baskı uygulayın. 
		DİKKAT: Kullanılmış iğneleri/şırıngaları derhal delinmez, sızdırmaz kesici-delici alet konteynerlerine atın. İğne batması yaralanmalarını önlemek için şırıngaların kapağını tekrar kapatmaya çalışmayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Serbest bırakma ve pozitif pekiştirme
	<ol>
		<li>Fareyi içeren tüneli ana kafese geri koyun ve hayvanın tünelin karşı ucundan gönüllü olarak çıkmasına izin verin (Şekil 1C).</li>
		<li>Pozitif pekiştirmeyi ve prosedüre alışmayı desteklemek için ana kafeste ödüller sağlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Temizlik ve bakım
	<ol>
		<li>İç astarlamayı uygulama tünelinden çıkarın. Uygulama tünelini %70 etanol ile temizleyin.</li>
		<li>Astarlama temiz kalmışsa, sonraki deneyler için yeniden kullanılabilir. Kontamine olmuşsa veya gözle görülür şekilde kirlenmişse, yeniden kullanmadan önce yıkayın ve otoklavlayın. 
		NOT: Her deney grubu için bir astarlama kullanın. Farklı deneyler arasında, erkek ve dişi hayvanlar arasında ve kurum hijyen kılavuzlarının gerektirdiği her durumda astarlamayı değiştirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. İntraperitonal uygulama
NOT: Bu yöntem, farelerde intraperitoneal uygulama için refah odaklı bir manuel tutma yaklaşımını açıklamaktadır. İntraperitoneal enjeksiyonlar, yalnızca eğitimli personel tarafından, kurumsal yönergelerle uyumlu ve yerleşik güvenlik ve hijyen prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Enjeksiyon alanına daha iyi erişim sağlamak için, farelerin arka kısmını yukarı kaldıran eğimli bir platform (kama) ile birlikte uygulama tüneli kullanılır.
<ol>
	<li>Çalışma alanının hazırlanması
	<ol>
		<li>Uygulama tünelini ve kamayı %70 etanol ile temizleyin. Etanolün yaklaşık 5 dk boyunca tamamen buharlaşmasını bekleyin.</li>
		<li>Yıkanmış ve otoklavlanmış, rulo haline getirilmiş bir döşeme parçasını (Vetbed Isobed'i gerekli boyutta kesin) tünelin içine yerleştirin (Şekil 1B).</li>
		<li>Parmaklarınızı kullanarak, kalan açıklık yaklaşık olarak iki bitişik parmak genişliğinde olana kadar tünel girişindeki döşemeyi nazikçe sıkıştırın. Döşemeyi daha fazla sıkıştırmayın</li>
		<li>Uygulama tünelini çalışma yüzeyindeki kamanın üzerine yerleştirin (Şekil 1D) ve tünel girişinin önüne ek bir düz döşeme koyun.</li>
		<li>İstenen enjeksiyon çözeltisini içeren, 27G iğne takılmış enjeksiyon şırıngasını hazırlayın ve tünelin yanına yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tünel içinde refah odaklı sabitleme 
	UYARI: Hayvanlarla çalışırken her zaman kurumun biyogüvenlik ve hijyen gerekliliklerine uygun gerekli kişisel koruyucu ekipmanları (örneğin önlük, eldiven, bone, maske) kullanın.
	<ol>
		<li>Fareyi, bir tutma tüpü kullanarak ana kafesinden taşıyın. Tutma tünelini doğrudan tünel açıklığının önüne yerleştirerek farenin uygulama tüneline gönüllü olarak girmesini sağlayın (Şekil 1C). 
		NOT: Bazı fareler, tünele gönüllü olarak girmeden önce uygulama tünelinin önüne yerleştirilen döşemenin üzerine çıkmayı tercih eder. Bu durumda, tüneli kamaya yerleştirmeden önce farenin tünele girmesini bekleyin.</li>
		<li>Fare içeri girdiğinde, tünelde çok ileri gitmesini önlemek için kuyruğun tabanını işaret parmağı ve başparmak arasında nazikçe tutun. Fare genellikle geri dönmeden rulo döşeme içinde konumlanmış halde kalır. 
		NOT: Fareler tünele girmiyorsa açıklık çok küçük olabilir; tünel girişindeki döşemeyi hafifçe sıkıştırın. Fareler çok küçükse ve geri dönme eğilimindeyse, rulo döşemeyi sıkılaştırın veya ek bir katman ekleyin (Şekil 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>İntraperitoneal enjeksiyon
	<ol>
		<li>Kuyruğun tabanını bir elin başparmağı ve işaret parmağı arasında tutun (Şekil 1C). Aynı elin orta parmağını kullanarak sakral bölgeye hafif baskı uygulayın ve kuyruğu hafifçe yukarı doğru çevirin. Bu işlem hayvanı stabilize eder ve kaudal abdominal bölgeye net erişim sağlar.</li>
		<li>KRİTİK ADIM: Şırıngayı çalışma yüzeyine paralel tutarak ve açıkça görünen kaudal abdominal bölgeye yerleştirerek enjeksiyonu gerçekleştirin.</li>
		<li>Enjeksiyondan sonra baskıyı nazikçe azaltın ve kuyruğu bırakın. 
		UYARI: Kullanılan iğneleri/şırıngaları derhal delinmeye dayanıklı, sızdırmaz tıbbi atık konteynerlerine atın. İğne batması yaralanmalarını önlemek için şırıngaların kapağını tekrar kapatmaya çalışmayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Serbest bırakma ve pozitif pekiştirme
	<ol>
		<li>Fareyi içeren tüneli ana kafese geri getirin ve hayvanın tünelin karşı ucundan gönüllü olarak çıkmasına izin verin (Şekil 1C).</li>
		<li>Pozitif pekiştirmeyi ve prosedüre alışmayı desteklemek için ana kafese ödüller koyun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Temizlik ve bakım
	<ol>
		<li>İç döşemeyi uygulama tünelinden çıkarın. Uygulama tünelini ve kamayı %70 etanol ile temizleyin.</li>
		<li>Döşeme temiz kalmışsa sonraki deneylerde tekrar kullanılabilir. Kontamine olmuşsa veya gözle görülür şekilde kirlenmişse, yeniden kullanmadan önce yıkayın ve otoklavlayın. 
		NOT: Her deney grubu için bir döşeme kullanın. Farklı deneyler arasında, erkek ve dişi hayvanlar arasında ve kurumun hijyen kılavuzları tarafından gerekli görüldüğünde döşemeyi değiştirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kuyruk veninden kan örneği alma
NOT: Bu yöntem, farelerde kuyruk veninden kan örneği almak için refah odaklı bir manuel tutma yaklaşımını tanımlamaktadır. Tüm prosedürler, kurumsal yönergeler ile yerleşik güvenlik ve hijyen protokollerine uygun olarak eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir.
<ol>
	<li>Çalışma alanının hazırlanması
	<ol>
		<li>Uygulama tünelini %70 etanol ile temizleyin. Etanolün yaklaşık 5 dk boyunca tamamen buharlaşmasını bekleyin.</li>
		<li>Yıkanmış ve otoklavlanmış rulo haline getirilmiş bir döşeme parçasını (gerekli boyutta kesilmiş bir Vetbed Isobed) tünelin içine yerleştirin (Şekil 1B).</li>
		<li>Parmaklarınızı kullanarak, kalan açıklık yaklaşık iki yan yana parmak genişliğinde olana kadar tünel girişindeki döşemeyi nazikçe sıkıştırın. Döşemeyi daha fazla sıkıştırmayın.</li>
		<li>Uygulama tünelini çalışma yüzeyine yerleştirin ve tünel girişinin önüne ek bir düz döşeme koyun.</li>
		<li>Lancetlerin, kan toplama mikro tüplerinin, pamuklu çöplerin ve dezenfektan spreyin hazır olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tünel içerisinde refah odaklı tespit 
	UYARI: Hayvanlarla çalışırken her zaman kurumun biyogüvenlik ve hijyen gerekliliklerine uygun gerekli kişisel koruyucu ekipmanları (PPE) (örn. önlükler, eldivenler, boneler, maskeler) kullanın.
	<ol>
		<li>Fareyi, taşıma tüpü kullanarak ana kafesten transfer edin. Taşıma tüpünü doğrudan tünel açıklığının önüne yerleştirerek farenin uygulama tüneline gönüllü olarak girmesini sağlayın (Şekil 1C). 
		NOT: Bazı fareler, tünele gönüllü olarak girmeden önce uygulama tünelinin önüne yerleştirilen döşemenin üzerine çıkmayı tercih eder. Farelerin tünelin içine çok fazla ilerlemesi, kuyruğun tabanından nazikçe tutularak engellenebilir.</li>
		<li>Fare içeri girdiğinde, genellikle geri dönmeden rulo döşemenin içinde konumlanmış halde kalır. 
		NOT: Fareler tünele girmezse açıklık çok küçük olabilir; tünel girişindeki döşemeyi hafifçe sıkıştırın. Fareler çok küçükse ve geri dönme eğilimindeyse, rulo döşemeyi daraltın veya ek bir katman ekleyin (Şekil 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kan örneği alma
	<ol>
		<li>Kuyruğun ucundan tutarak nazikçe düzeltin ve hedeflenen örnekleme bölgesini dezenfekte edin. Lateral kuyruk venlerini dorsale konumlandırmak için kuyruğu yaklaşık 90° döndürün.</li>
		<li>KRİTİK ADIM: Lateral veni bir lancet kullanarak delin. Bir mikro tüp veya kapiler yardımıyla kan damlalarını toplayın. 
		UYARI: Kullanılan lancetleri derhal delinmeye dayanıklı, sızdırmaz kesici-delici alet konteynerlerine atın. İğne batması yaralanmalarını önlemek için lancetlerin kapağını kapatmaya çalışmayın.</li>
		<li>Örnekleme yaptıktan sonra, kanamayı kontrol etmek için delinme bölgesine steril bir pamuklu çöple nazikçe basınç uygulayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Serbest bırakma ve pozitif pekiştirme
	<ol>
		<li>Fareyi içeren tüneli ana kafese geri koyun ve hayvanın tünelin karşı ucundan gönüllü olarak çıkmasına izin verin (Şekil 1C).</li>
		<li>Pozitif pekiştirmeyi ve prosedüre alışmayı desteklemek için ana kafeste ödül mamaları sağlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Temizlik ve bakım
	<ol>
		<li>İç döşemeyi uygulama tünelinden çıkarın. Uygulama tünelini %70 etanol ile temizleyin.</li>
		<li>Döşeme temiz kalmışsa, sonraki deneyler için tekrar kullanılabilir. Kontamine olmuşsa veya görünür şekilde kirlenmişse, yeniden kullanmadan önce yıkayın ve otoklavlayın. 
		NOT: Deney grubu başına bir döşeme kullanın. Farklı deneyler arasında, erkek ve dişi hayvanlar arasında ve kurumun hijyen kılavuzları tarafından gerektirdiğinde döşemeyi değiştirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joint Research Center (JRC-ISPRA). Summary report on statistical information on the use of animals for scientific purposes in the Member States of the European Union and Norway in 2023. Luxembourg: Publications Office of the European Union; 2026.</li>
	<li>European Parliament and Council of the European Union. Directive 2010/63/EU of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Off J Eur Union. 2010;L276:33&#8211;79.</li>
	<li>Russell WMS, Burch RL. The principles of humane experimental technique. London: Methuen &#38; Co. Ltd.; 1959.</li>
	<li>Labitt RN, Oxford EM, Davis AK, Butler SD, Daugherity EK. A validated smartphone-based electrocardiogram reveals severe bradyarrhythmias during immobilizing restraint in mice of both sexes and four strains. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2021;60(2):201&#8211;12.</li>
	<li>Baek JM, Kwak SC, Kim JY, Ahn SJ, Jun HY, Yoon KH, et al. Evaluation of a novel technique for intraperitoneal injections in mice. Lab Anim (NY). 2015;44(11):440&#8211;4.</li>
	<li>Turner PV, Pekow C, Vasbinder MA, Brabb T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2011;50(5):614&#8211;27.</li>
	<li>Meijer MK, Spruijt BM, van Zutphen LF, Baumans V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 2006;40(4):382&#8211;91.</li>
	<li>Schlutt A, Riesner K, Kochan M, Mess AK, Jahn D, Lurje I, et al. A novel application tunnel in combination with medical training reduces stress induced by frequent intraperitoneal injections and blood draws in mice. PLoS One. 2026;21(5):e0341404.</li>
	<li>Onuma K, Watanabe M, Sasaki N. The grimace scale: a useful tool for assessing pain in laboratory animals. Exp Anim. 2024;73(3):234&#8211;45.</li>
	<li>Whittaker AL, Liu Y, Barker TH. Methods used and application of the mouse grimace scale in biomedical research 10 years on: a scoping review. Animals (Basel). 2021;11(3).</li>
	<li>Ruat J, Genewsky AJ, Heinz DE, Kaltwasser SF, Canteras NS, Czisch M, et al. Why do mice squeak.&#160;Toward a better understanding of defensive vocalization. iScience. 2022;25(7):104657.</li>
	<li>Ehret G. Schallsignale der Hausmaus (Mus musculus). Behaviour. 1974;52(1-2):38&#8211;56.</li>
	<li>Blanchard RJ, Hebert MA, Ferrari PF, Palanza P, Figueira R, Blanchard DC, et al. Defensive behaviors in wild and laboratory (Swiss) mice: the Mouse Defense Test Battery. Physiol Behav. 1998;65(2):201&#8211;9.</li>
	<li>Kawakami K, Xiao B, Ohno R, Ferdaus MZ, Tongu M, Yamada K, et al. Color preferences of laboratory mice for bedding materials: evaluation using radiotelemetry. Exp Anim. 2012;61(2):109&#8211;17.</li>
	<li>Davies JR, Purawijaya DA, Bartlett JM, Robinson ESJ. Impact of refinements to handling and restraint methods in mice. Animals (Basel). 2022;12(17).</li>
	<li>Leussis MP, Bolivar VJ. Habituation in rodents: a review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci Biobehav Rev. 2006;30(7):1045&#8211;64.</li>
	<li>Ahlstr&#246;m T. Handling and training mice and rats: low stress procedures. London: National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs); 2023.</li>
	<li>Henderson LJ, Dani B, Serrano EMN, Smulders TV, Roughan JV. Benefits of tunnel handling persist after repeated restraint, injection, and anesthesia. Sci Rep. 2020;10(1):14562.</li>
	<li>Gouveia K, Hurst JL. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Sci Rep. 2019;9(1):20305.</li>
	<li>Krzyzaniak O, Steiner S, Nilsson FAM, Dietrich M, Kampfen L, Johansen P, et al. Applicability of the micropipette-guided drug administration (MDA) method for assessing reward-related behaviors in mice. Physiol Behav. 2025;299:114967.</li>
	<li>Cinelli P, Rettich A, Seifert B, Burki K, Arras M. Comparative analysis and physiological impact of different tissue biopsy methodologies used for the genotyping of laboratory mice. Lab Anim. 2007;41(2):174&#8211;84.</li>
	<li>Pare WP, Glavin GB. Restraint stress in biomedical research: a review. Neurosci Biobehav Rev. 1986;10(3):339&#8211;70.</li>
	<li>Hurst JL, West RS. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 2010;7(10):825&#8211;6.</li>
	<li>Gouveia K, Hurst JL. Reducing mouse anxiety during handling: effect of experience with handling tunnels. PLoS One. 2013;8(6):e66401.</li>
	<li>Faure A, Pittaras E, Nosjean A, Chabout J, Cressant A, Granon S. Social behaviors and acoustic vocalizations in different strains of mice. Behav Brain Res. 2017;320:383&#8211;90.</li>
	<li>Yamauchi T, Yoshioka T, Yamada D, Hamano T, Ohashi M, Matsumoto M, et al. Cold-restraint stress-induced ultrasonic vocalization as a novel tool to measure anxiety in mice. Biol Pharm Bull. 2022;45(3):268&#8211;75.</li>
	<li>National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs). Handling and restraint: General principles. London: NC3Rs; https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/handling-and-restraint</li>
	<li>Lee EH, Park JY, Kwon HJ, Han PL. Repeated exposure to short-term behavioral stress resolves pre-existing stress-induced depressive-like behavior in mice. Nat Commun. 2021;12(1):6682.</li>
	<li>Mink D, Horvath D, Basler M. Protocol to study social transmission of stress in group-housed mice using restraint stress. STAR Protoc. 2025;6(4):104224.</li>
	<li>Ding JX, Rudak PT, Inoue W, Haeryfar SMM. Physical restraint of mouse models to assess immune responses under stress with or without habituation. STAR Protoc. 2021;2(4):100838.</li>
</ol>

A.S., J.K.U. ve L.H., Almanya'da enjeksiyon tüneline ilişkin bir faydalı modelin sahibidir (Kayıt No. 20 2024 100 448). Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Bu sabitleme tekniği, hayvan refahına yönelik en iyi uygulama yaklaşımını desteklemek amacıyla madde uygulaması ve kan örneği alma işlemleri için geliştirilmiştir. Bazı bilimsel topluluklar, özellikle ek zaman ve çaba gerektirebileceği durumlarda, uzun süredir yerleşmiş olan standart prosedürlerden farklı olan rafine tutma ve sabitleme yöntemlerini benimsemek konusunda hâlâ isteksizdir. Ancak, laboratuvar hayvanlarındaki stresin azaltılması yalnızca hayvan refahı perspektifinden arzu edilen bir durum değil, aynı zamanda veri değişkenliğini azaltarak, strese bağlı fizyolojik değişiklikleri minimize ederek ve başarısız denemeleri ile hayvan kayıplarını düşürerek deneysel başarıya önemli ölçüde katkı sağlar. Bu protokol, güvenli uygulama ve örnekleme prosedürleri için güvenli sabitleme ve eller serbest erişim sağlarken aynı zamanda hayvan refahını önemli ölçüde iyileştiren, uygulanması kolay bir yöntemi sunmaktadır.
Protokoldeki kritik bir adım, uygulama tüneline başarılı girişi ve tünel içinde stabil konumlanmayı sağlamaktır. Gönüllü giriş için iki olası yaklaşım önerilir: ya transfer tüpünden tünele doğrudan giriş ya da farelerin önce transfer tüpünden önceden yerleştirilmiş yumuşak astara konulması ve buradan tünele girmeleri. Optimal yaklaşım hayvanların davranışına bağlıdır ve her iki yöntem de değerlendirilmelidir. Tercih edilen varyant, farelerin en hızlı ve en az isteksizlikle girdiği yöntemdir. Fareler tünele girmekte tereddüt ederse, birkaç faktör göz önünde bulundurulmalıdır: (1) giriş açıklığı çok dar olabilir, bu durumda açıklığı genişletmek için astar hafifçe sıkıştırılabilir; (2) iç astarın koku ipuçları kabulü etkileyebilir, bu nedenle astarlar tercihen tanıdık kafes kokusunu korumalı, ancak deneysel gruplar, kafesler ve cinsiyetler arasında ayrım sağlanmalı ve kafa karıştırıcı kokuları önlemek için kirlenmiş malzemeler değiştirilmelidir; (3) farelerin, kürk renklerine benzer renkteki yüzeylerde kendilerini daha güvende hissettikleri gösterilmiştir14, bu nedenle astar renginin hayvanların kürk rengiyle eşleştirilmesi faydalı olabilir; ve (4) tünel açıklığının kafes duvarına doğru konumlandırılması girişi teşvik edebilir çünkü fareler hala ev kafesini ve kafes arkadaşlarını görebilirler. Uygulama tünelinin potansiyel bir sınırlaması, hayvanın gönüllü girişine dayanmasıdır; bu durum, tedavi veya örnekleme öncesinde kısa bir gecikme olarak algılanabilir. Ancak, bu çalışmada fareler tünele hızla ve tutarlı bir şekilde, genellikle 2–10 s içinde girmişlerdir ve bu da prosedürlerin dar ve tekrarlanabilir bir zaman penceresinde gerçekleştirilmesine olanak sağlamıştır. Bu yaklaşım, geleneksel ense derisinden tutarak sabitlemeye göre biraz daha fazla zaman gerektirse de, tutma süresindeki bu mütevazı artış, tutma ile ilişkili stresin azaltılmasıyla elde edilen hayvan refahındaki önemli iyileştirme ile kıyaslanmalıdır. Dahası, geleneksel sabitleyicilere yerleştirme işlemi de tutma süresiyle ilişkilidir, çünkü fareler genellikle yerleştirilmeye direnç gösterir ve bu durum sonucunda ilgili bir fark oluşmaz. Vakaların %5'inden daha azında fareler tünele gönüllü olarak girmemiştir. Yukarıda açıklanan önlemler girişi teşvik etmek için genellikle yeterli olsa da, gerekirse hayvanlar nazikçe tünele yönlendirilebilir. Bu vakalarda bile yumuşak iç astar, geleneksel sabitleyicilere göre bir refah avantajı sağlar.
Fareler tünelin içine girdikten sonra iç astarı güvenli bir şekilde kavrayabilirler. Tutma işlemi sırasında bir yüzeyi kavramalarına izin verildiğinde, kısıtlanmış farelerin daha düşük stres seviyeleri sergilediği gösterildiğinden, bu durum hayvan refahı açısından oldukça avantajlıdır4. Aynı zamanda, uygulayıcı, farenin etrafında dönmeye çalışması olmadan kuyruk tabanını güvenle tutabilir. İç astarın hayvanı sıkıca çevrelemesi esastır. Eğer fareler çok küçükse ve tünel içinde dönme eğilimi gösteriyorlarsa, sarılı astar sıkılarak veya ek bir katman eklenerek hızlı ayarlamalar yapılabilir. Farklı boyutlardaki hayvanları içeren deneyler için (örneğin farklı yaş, cinsiyet, diyet nedeniyle), farklı çaplardaki tüneller de kullanılabilir (yazdırma şablonlarına bakınız8).
Enjeksiyonlar ve kan örneklemesi her zaman eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir. Buna rağmen uygulama tüneli, hem oldukça deneyimli personel hem de daha az deneyimli kullanıcılar için etkili olmuştur. Özellikle deneyimsiz personelin daha az başarısız girişim bildirdiği, böylece tekrarlanan işlemlerin ve uzayan prosedürlerin azaldığı görülmüştür. Kullanıcılar ayrıca, fareleri tünelde sabitlemenin, geleneksel el ile sabitleme tekniklerini öğrenmeye kıyasla kendilerini daha rahat ve güvende hissettirdiğini bildirmişlerdir. Yöntemin kolayca benimsenmesi ve hem hayvanlara hem de deney yapana fayda sağlaması, personel sirkülasyonunun yüksek olduğu laboratuvarlar için önemli bir avantaj teşkil etmektedir. Bu gözlemler, tünel ve kap tutuşu gibi geliştirilmiş tutuş teknikleriyle ilişkili olarak önceden rapor edilmiş tutuş konforundaki artışlar ve teknisyen güvenindeki iyileşmelerle uyumludur15.
Önemli olan, burada açıklanan yöntemin eğitilmemiş farelerde bile etkili olmasıdır ve sunulan tüm sonuçlar önceden alıştırma yapılmamış hayvanlar kullanılarak elde edilmiştir. Önceki çalışmalar, hayvanların alıştırılmasının ve tıbbi eğitiminin, onları planlanan prosedürlere aşina ederek farelerdeki stres yanıtlarını azaltabileceğini göstermiştir16,17. Bu nedenle, uygulama tünelini içeren bir eğitim protokolü, özellikle sık müdahalelerin gerekli olduğu ve aksi takdirde tünelle ilgili olumsuz çağrışımların oluşabileceği durumlarda, stres seviyelerini daha da azaltabilir. Böyle bir eğitim programı, önceki bir çalışmada başarıyla uygulanmış ve tünelin birçok hafta boyunca tekrarlanan intraperitoneal enjeksiyonlar için kullanılmasına olanak sağlamıştır8. Özellikle tekrarlanan enjeksiyonlar gerektiren çalışmalarda, tünel önemli bir iyileştirme sağlayabilir. Transfer tüplerinin kullanıldığı geliştirilmiş tutma tekniklerinin ve azaltılmış kısıtlamanın; tekrarlanan ense derisi tutma veya intraperitoneal enjeksiyonlardan sonra bile, deneycilerle etkileşim kurma isteğinin artması ve standart davranışsal testlerde anksiyete benzeri davranışların azalması dahil olmak üzere pozitif etkileri sürdürdüğü gösterilmiştir18,19. Benzer şekilde, tünel içinde gerçekleştirilen tekrarlanan enjeksiyonlar farelerde stresle ilişkili parametreleri artırmamıştır8.
Benzer şekilde, gıda ödüllerinin, hayvan eğitiminde iyi bilinen bir ilke olan pozitif pekiştirme yoluyla alışkanlık kazanmayı kolaylaştırdığı gösterilmiştir. Bu nedenle, her tutma seansının sonunda bir ödül olarak küçük bir ödül maması verilmesi önerilir. Tünel test edilirken, tek bir yulaf tanesi gibi çok küçük miktarlar yeterli olmuştur ve hayvanların normal diyetini bozması beklenmez. Örneğin metabolik çalışmalarda olduğu gibi gıda alımı bir endişe kaynağıysa, özel diyetlerle (örneğin ketojenik diyetler) uyumlu aromalı ödül mamaları da mevcuttur. Önemli olan, ödül mamalarının uygulama tünelinin başarılı kullanımı için bir ön koşuldan ziyade, alışkanlık kazanmayı artıran ek bir iyileştirme önlemi olarak değerlendirilmesidir. Fareler sisteme alıştıktan sonra, gıda ödülü almadan da uygulama tüneline gönüllü olarak tekrar tekrar girmişlerdir.
Burada açıklanan yöntemin, vücudun belirli bölgelerine erişim konusunda bazı sınırlamaları vardır. Kuyruğa intravenöz enjeksiyonlar ve kan örneği alımı için kolay ve güvenli bir şekilde erişilebildiği ve kaudal abdominal bölgenin intraperitoneal enjeksiyonlar için uygun olduğu görülürken, deri altı uygulamalar için lateral vücut bölgelerine erişim sınırlıdır. Oral uygulama da dikkatle değerlendirilmelidir. Gerekli boyun ekstansiyonu sağlanamadığı için geleneksel oral gavage bu sistemle uyumlu değildir. Bununla birlikte, farelerin maddeleri bir pipet ucundan gönüllü olarak tükettiği (örneğin, yoğunlaştırılmış sütle karıştırılmış) daha rafine oral uygulama yöntemleri20, tünelin açık tarafı aracılığıyla uygulanabilir olabilir. Bu tür durumlarda, maddenin tamamen yutulduğunu teyit etmek için başın net bir şekilde görünür olduğundan ve farenin astar veya tünel içinde çok derine konumlandırılmadığından emin olunmalıdır.
Mevcut kısıtlama tünelleri ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan uygulama tüneli hayvan refahı açısından belirgin avantajlar sunmaktadır. Kısıtlama, güvenli uygulama ve örnekleme prosedürleri için genellikle gerekli olsa da, kemirgenlerin deneysel prosedürler sırasında deneyimledikleri en büyük stresörlerden biri olduğu kabul edilmektedir7,21,22. Önceki çalışmalar, geleneksel kuyruktan tutma ve kısıtlamanın yerini tünel veya kap tutma gibi geliştirilmiş yöntemlerin almasının hayvan refahını önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Bu geliştirilmiş yaklaşımlarla tutulan fareler, kuyruktan yakalanan farelere göre daha düşük anksiyete ve bakıcılarla etkileşime girmeye daha fazla isteklilik sergilemektedir23,24. Farelerin gönüllü olarak girdiği uygulama tünelinin kullanılması, tünel tutma yönteminin tutarlı bir uzantısıdır. Uygulama tünelinden çıkan farelerin yüz ifadesi skalası (grimace scale), hayvanların kendilerini kısıtlanmış veya kapana kısılmış hissetmediklerini göstermektedir. Farelerin kafes ızgarasına tutunduğu intraperitoneal enjeksiyon yöntemi, açıklanan pelvik bölgeden kavrayarak kaldırma işlemine benzese de5, ilki hayvanların kaçma çabasına dayanmaktadır. Izgara üzerinde fareler patileriyle tutunur ve bakıcıların kavrayışından uzaklaşmak için ileriye doğru çekerler; bu durum kısıtlamaya ve dolayısıyla strese yol açar. Ayrıca, bu tür bir kısıtlama abdominal kas tonusunu artırarak iğne girişinden kaynaklanan ağrının şiddetlenmesine neden olur. Buna karşılık, uygulama tüneli geliştirilmiş bir kısıtlama yöntemini temsil eder ve sonuçlar, daha düşük yüz ifadesi skorları, daha az duyulabilir vokalizasyonlar ve bakıcılarla etkileşime girme isteğinin korunması dahil olmak üzere stresle ilişkili parametrelerin azaldığını göstermektedir811,12,13. Ultrasonik vokalizasyonların (USV'ler) etolojik olarak ilgili iletişim sinyalleri olduğu giderek daha fazla kabul edilse de, USV'lerin yüksek derecede bağlama bağımlı olması ve normal fizyolojik davranışlar sırasında da meydana gelmesi nedeniyle, yetişkin farelerde stres belirteçleri olarak kullanımları hala araştırılmaktadır25.
Buna rağmen, güncel kanıtlar USV kayıtlarının, kısıtlamaya verilen davranışsal yanıtları değerlendirmek için gelecek vadeden, non-invaziv ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olabileceğini göstermektedir26. Bu nedenle, gelecek çalışmalara USV kayıtlarının dahil edilmesi, stres ve duygusal yanıtların daha ayrıntılı karakterize edilmesi için ek bir objektif ölçüt sağlayabilir. Bütün olarak bu bulgular, uygulama tünelinin rutin uygulamalar ve örnekleme için geleneksel kısıtlayıcılara kıyasla daha güvenli ve daha az stresli bir kısıtlama prosedürüne olanak tanıdığını göstermektedir. Önemli bir nokta olarak, şeffaf akrilik kısıtlayıcıların aksine, yumuşak iç astar farelerin yüzeyi güvenli bir şekilde kavramasına izin verir ve bu durum NC3Rs önerilerine göre önemli bir refah iyileştirmesi olarak kabul edilir27. Tünel içinde geri dönme girişimlerinin belirgin şekilde daha az olduğu gözlemlenmiş, bu da hem refahı hem de uygulama güvenliğini artırmıştır. Geleneksel plastik kısıtlayıcılarda, geri dönme girişimleri genellikle idrar yapma ile ilişkilendirilir ve bunun sonucunda oluşan ıslak kürk konforu daha da bozar. Bu sorun, uygulama tüneli ile büyük ölçüde ortadan kaldırılmıştır.
Bu yöntemin potansiyel uygulama alanları oldukça geniştir. Özellikle, geliştirilmiş kısıtlama yöntemi yalnızca farelerle sınırlı olmayıp, daha büyük çaplı bir tünel kullanılarak sıçanlara da uygulanabilir (Ek Şekil 1). Kemirgenler, bilimsel disiplinler genelinde en yaygın kullanılan laboratuvar hayvanı türleridir ve madde uygulaması ile örnekleme için kısıtlama, birçok laboratuvarda rutin bir işlemdir. Ancak, kısıtlama stresinin sadece hayvan refahını bozmadığı, aynı zamanda davranışsal tepkiler28,29 ve bağışıklık fonksiyonu gibi fizyolojik mekanizmalar30 dahil olmak üzere bilimsel sonuçları da önemli ölçüde etkilediği gösterilmiştir. Bu nedenle, stresle ilişkili değişkenliğin minimize edilmesi, hayvan deneylerinde hem bilimsel geçerlilik hem de etik değerlendirmeler açısından temel bir gerekliliktir. Güvenli ve pratik bir tutuş sağlarken kısıtlama kaynaklı stresi azaltarak, uygulama tüneli hayvan refahını artırmanın yanı sıra deneysel kaliteyi ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde iyileştirebilir.

Hayvan deneyleri, hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına ve ilaçlar ile kimyasal maddelerin etkililiğinin ve güvenliğinin değerlendirilmesine önemli katkılar sağlayarak biyomedikal araştırmalarda merkezi bir rol oynamaya devam etmektedir. Kemirgenler, en yaygın kullanılan laboratuvar hayvanı türlerini temsil etmektedir; Avrupa Birliği'nde 2023 yılında bilimsel amaçlarla yaklaşık 3,5 milyon fare ve 0,5 milyon sıçan kullanılmıştır1. Deneysel prosedürlerin neden olduğu acılara yönelik artan toplumsal farkındalık, 3R prensibi doğrultusunda2,3 araştırma çalışmalarında hayvan refahını iyileştirmeye yönelik yasal gerekliliklerin ortaya çıkmasına yol açmıştır. Hayvan deneylerinin alternatif yöntemlerle tamamen değiştirilmesi henüz mümkün olmadığından, hayvan acılarını hafifletmek için mevcut deneysel prosedürlerin optimize edilmesi özellikle önemlidir. Enjeksiyonlar gibi prosedürler sırasında sabitleyici kısıtlamaları da içeren tutma ve kontrol işlemleri, laboratuvar hayvanlarının hem rutin bakımda hem de deneyler sırasında maruz kaldığı en yaygın müdahalelerden biridir.
İntraperitonal enjeksiyonlar için geleneksel immobilizasyon kısıtlaması; başparmak ve işaret parmağıyla boyundaki deri ve kürkün sıkıca kavranmasını, kuyruğun sabitlenmesini ve enjeksiyonlar için abdomenin açığa çıkarılması amacıyla hayvanların döndürülmesini içerir. Bu pozisyon doğaldır değildir ve hayvanlarda korkuyu tetikleyen solunum güçlüğüne yol açabilir4. Klasik boyun tutma tekniklerine kıyasla boyun bölgesine uygulanan basıncın azaltıldığı, sözde 3 parmak yöntemi de dahil olmak üzere çeşitli geliştirilmiş kısıtlama teknikleri halihazırda tanımlanmıştır4. Diğer bir yöntem ise büyük ölçüde tam immobilizasyondan kaçınır: Burada hayvanlar, enjeksiyonlar için alt abdomene erişime izin verecek şekilde kuyruk ve arka ekstremiteleri kısıtlanırken bir tel örgüye tutunabilirler5. Yine de her iki prosedürün de sınırlamaları vardır. 3 parmak yönteminde hayvanlar hala kaldırılmalı ve potansiyel olarak stres tepkilerini tetikleyebilecek doğal olmayan bir pozisyona getirilmelidir. Öte yandan, alternatif teknik, stresli veya savunmacı hayvanların ısırmalarına karşı yeterli koruma sağlamaz ve enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için mevcut süreyi sınırlayabilir. Potansiyel ısırma yaralanmalarının yanı sıra, hatalı kısıtlama veya kazara iğne batması yaralanmaları riski de artmaktadır. İntravenöz enjeksiyonlar veya kuyruk veninden kan örneği alma işlemleri için immobilizasyon, ellerin prosedürler için serbest kalması amacıyla hayvanları tutmadan immobilize eden kısıtlayıcıların kullanılmasını gerektirir. Kısıtlayıcılar genellikle, kuyruk erişimi için erişim yuvaları veya delikleri olan kapalı bir uca ve farelerin yerleştirilmesi için ayarlanabilir tıpalarla sabitlenebilen açık bir uca sahip, şeffaf akrilikten yapılmış tüplerdir. Bu işlem, hayvanların kuyruklarından tutulup, kuyruğun erişim yuvalarından geçirilebilmesi için önce arka uçtan kısıtlayıcıya çekilmesini gerektirir. Bu, farelerin prosedürler sırasında dönmelerini önlemek için gerekli olan kısıtlayıcıların oldukça dar çapı nedeniyle şiddetlenen ve yaralanmalarla sonuçlanabilecek stresli bir işlemdir6,7.
Bu protokol, farelerde enjeksiyonlar ve kan toplama işlemi için geliştirilen, daha az zorlayıcı ancak yine de güvenli bir sabitleme sağlayan yeni bir uygulama tünelinin kullanımını açıklamaktadır. Tünel, sert bir dış çerçeveden ve bir yuva benzeri yumuşak, karanlık bir alan oluşturan, çıkarılabilir peluş bir iç astardan oluşur. Geleneksel sabitleyicilerle karşılaştırıldığında tünel, boyuta göre kesilmiş bir Vetbed Isobed ekini yerleştirmek amacıyla bilinçli olarak daha büyük boyutlarda tasarlanmış olup, yeterli kısıtlamayı korurken hayvanların güvenlik hissini artıran yumuşak ve konforlu bir iç astar sağlar (Şekil 1A–B). Tünelin her iki ucu da açık olduğundan fareler, ön taraftan yürüyerek içeri girebilir ve arka taraftan çıkabilirler. Hayvanlar tünelin içine girdiğinde, kuyruk intravenöz enjeksiyonlar veya kan örneği alımı için erişilebilir kalırken, dönmeleri engellenir (Şekil 1C). İntraperitoneal enjeksiyonlar için, tünel açılı bir şekilde yerleştirilerek (Şekil 1D) ve sakral bölgeye hafif baskı uygulanırken hayvanın kuyruğu kökünden tutulup farenin arka ucu yukarı doğru bükülerek kaudal abdominal bölgeye erişilebilir (Şekil 1C). Herhangi bir el ile sabitleme gerektirmediği için bu yöntem hem fareler hem de deneyciler için daha az streslidir.
Önceki bir çalışma, intraperitoneal enjeksiyonlar için tünel kullanımının, sık intraperitoneal enjeksiyonların yapıldığı deneysel modellerde bile stres seviyelerini kalıcı olarak azalttığını ve farelerin refahını iyileştirdiğini göstermiştir8. Bu çalışmada, uygulama tüneli hem erkek hem de dişi farelerde intravenöz enjeksiyon ve kuyruk veninden kan örneği alımı için de başarıyla test edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Alerji lansetleri, steril</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburg, Almanya</td><td>1110106</td><td></td></tr><tr><td>Opsiyonel kama içeren uygulama tüneli</td><td>Kurum içi 3D yazıcı ile basılmış tünel</td><td></td><td>yazdırma şablonları https://osf.io/vsjnb adresinden temin edilebilir.</td></tr><tr><td>Kan toplama tüpleri: Microvette 100 EDTA K3E, 100 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT AG &amp;amp; Co. KG, N&amp;uuml;mbrecht, Almanya</td><td>20.1278.100</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf taşıma tüpü</td><td>Datesand Group, Stockport, Birleşik Krallık</td><td>GZCHTUBE-100</td><td>boyut: 50 x 3 x 100 mm</td></tr><tr><td>Etanol, &amp;ge;70%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>T913.1</td><td></td></tr><tr><td>Inject-F tek kullanımlık düşük doz şırıngası 1 mL&amp;nbsp;</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG, Melsungen, Almanya</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Yulaflar</td><td>Schapfen M&amp;uuml;hle GmbH Co.KG, Ulm, Almanya</td><td>W100197</td><td>otoklavlanmış</td></tr><tr><td>Sanitas SIL 06 kızılötesi lamba</td><td>Beurer Europe GmbH, Ulm, Almanya</td><td>61424</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak iç astar: Orijinal Vetbed Isobed SL</td><td>Vetbed Deutschland, Mudersbach, Almanya</td><td>1999981</td><td>gerekli boyutlarda kesin</td></tr><tr><td>Softasept ISO %70 dezenfektan sprey</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG, Melsungen, Almanya</td><td>19905</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 27 G x &amp;frac34; tek kullanımlık steril hipodermik iğneler</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG, Melsungen, Almanya</td><td>4657705B</td><td>boyut: 0,40 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Sürüntü çubukları: FIWA uygulama tıbbi aplikatörleri</td><td>Fink &amp;amp; Walter GmbH, Merchweiler, Almanya</td><td>329012</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde madde uygulaması ve kan Örneği alımı için refah odaklı manuel sabitleme tekniği

Welfare-Oriented Manual Restraint Technique for Substance Administration and Blood Sampling in Mice

Hayvan deneyleri, hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına ve ilaçların ile kimyasal maddelerin etkinliğinin ve güvenliğinin değerlendirilmesine önemli katkılar sağlayarak biyomedikal araştırmalarda temel olmayı sürdürmektedir ve kemirgenler en sık kullanılan laboratuvar hayvanları arasında yer almaktadır. Laboratuvar uygulamalarındaki en yaygın müdahaleler arasında, sedasyon veya anestezi uygulanmadan bilinçli farelere rutin olarak yapılan enjeksiyon ve kan örneklemesi gibi prosedürler sırasında kullanılan tutma ve immobilizasyon kısıtlamaları yer alır. Hem hayvanın hem de uygulayıcının güvenliğini sağlamak için uygun kısıtlama gereklidir. Ancak, el ile sabitleme veya kısıtlama tüpleri gibi geleneksel kısıtlama yöntemlerinin farelerde akut stres yanıtlarını tetiklediği, böylece hayvan refahını olumsuz etkilediği ve potansiyel olarak deneysel sonuçları etkileyebildiği bilinmektedir. 3R prensibi çerçevesinde iyileştirmeyi (refinement) desteklemek ve hayvan refahını artırmak amacıyla bu protokol, farelerde enjeksiyonlar ve kan örneklemesi için yeni geliştirilmiş bir uygulama tünelinin kullanımını tanımlamaktadır. Tünel, geleneksel tekniklere kıyasla daha az sert ancak yine de güvenli bir kısıtlama yöntemi sunar. Refah odaklı olan bu kısıtlama yöntemi; intraperitoneal ve intravenöz enjeksiyonlar ile kan örneklemesi gibi standart prosedürler için kolayca uygulanabilirken, stresi minimize eder ve laboratuvar fareleri için tutma koşullarını iyileştirir.

Yeni zapt etme tekniğinin fare refahı üzerindeki etkisini değerlendirmek için, tanımlanan protokole uygun olarak kuyruk veninden kan örneği alma ve intravenöz enjeksiyonlar gerçekleştirilmiştir. Erkek ve dişi wildtype C57BL/6 fareler, prosedürlere ya uygulama tünelinde ya da geleneksel bir zapt edicide tabi tutulmuş ve ağrı ile stres belirtileri açısından değerlendirilmiştir. Kuyruk veninden kan örneği alma işlemi sonrası farelerin stres seviyesini belirlemek için fare yüz ifadesi skalası (MGS) kullanılmıştır. MGS, ağrıya veya stresli prosedürlere tepki olarak yüz kaslarının ifadesini analiz eden, yaygın olarak kullanılan bir puanlama sistemidir9,10. Puanları belirlemek için, fareler zapt ediciden veya tünelden serbest bırakıldıktan hemen sonra fotoğraflar çekilmiştir (temsili görüntüler Şekil 2'de gösterilmiştir). Fare davranışlarını değerlendirme konusunda deneyimli iki gözlemci, üç yüz ifadesi parametresini değerlendirmiştir (Şekil 2C'deki şematik çizimlerde görülmektedir): orbital sıkılaşma (göz kapağının kapanması ve orbital alanın daralması; göz çevresinde bir kırışıklık görülebilir), burun şişkinliği (burun köprüsünde şişkinlik ve burnun yan tarafında dikey kırışıklıklar ortaya çıkabilir) ve kulak pozisyonu (kulaklar dışa ve/veya geriye doğru, yüzden uzaklaşacak şekilde döner ve 'sivri' bir şekil oluşturacak şekilde katlanabilir; kulaklar arasındaki mesafe artar). Farelerin koyu kürk rengi güvenilir değerlendirmeyi zorlaştırdığı için bıyık pozisyonu ve yanak şişkinliği değerlendirilmemiştir. Her parametre, 0 ile 2 arasında değişen üç puanlı bir skala kullanılarak puanlanmış (0 = mevcut değil, 1 = orta derecede mevcut, 2 = belirgin şekilde mevcut) ve hayvan başına tek bir ortalama MGS puanı elde etmek için üç yüz parametresinin ortalaması alınmıştır. Güvenilirliği sağlamak için her hayvan, her iki gözlemci tarafından bağımsız ve körleme yöntemiyle puanlanmış ve ardından her hayvan için final bir MGS puanı oluşturmak üzere iki MGS puanının ortalaması alınmıştır. Hem dişi hem de erkek farelerde, kan örneği alma işlemi geleneksel zapt ediciye kıyasla uygulama tünelinde gerçekleştirildiğinde MGS puanında anlamlı bir azalma görülmüştür (Şekil 2A–B).
Ayrı bir fare grubuna 100 µL %0,9 sodyum klorür (NaCl) şeklinde intravenöz enjeksiyon uygulanmış ve duyulabilir vokalizasyonların yanı sıra sabitleme cihazı içinde etrafında dönme girişimleri kaydedilmiştir. Fareler, özellikle ağrı veya korku yaşadıklarında ve savunma davranışı sergiledikleri sırada, şiddetli stresin bir belirtisi olarak duyulabilir çığlıklar şeklinde vokalizasyon yaparlar11,12,13. Ayrıca fareler, fiziksel kısıtlamaya doğal olarak panik ile tepki verirler ve bu durum, kapalı alandan kaçmak için bir kaçma tepkisiyle sonuçlanır. Bu nedenle, sabitleme cihazı içerisinde 180 derece dönme girişimleri korku belirtisi olarak kabul edilmiştir. Hem dişi hem de erkek farelerde, uygulama tüneline kıyasla, intravenöz enjeksiyonların bir sabitleyici içinde yapıldığı durumlarda duyulabilir vokalizasyonların ve etrafında dönme girişimlerinin daha sık gerçekleştiği gözlemlenmiştir (Şekil 3).
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig1v1.jpg" /> 
Şekil 1: Yeni uygulama tüneli. (A) Geleneksel bir sabitleyici ile yeni uygulama tüneli arasındaki boyut farkını gösteren temsili görüntüler. (B) Tünelin iç astarı, yumuşak, destekleyici ve karanlık bir ortam sağlayan, uygun boyutta kesilmiş rulo Vetbed parçasından oluşur. Fareler çok küçükse ve dönme eğilimindeyse, mevcut alanı azaltmak için rulo astar sıkılaştırılabilir. (C) Giriş ve çıkış, güvenli ve konforlu sabitleme ile abdomen ve kuyruğa erişim dahil olmak üzere uygulama tüneli içindeki farklı tutuş aşamaları. (D) Tünel içinde intraperitoneal enjeksiyonlar yapmak için kullanılan ek bir kama. Kama, tünelin işlemciye göre açısını artırarak abdominal bölgeye erişimi kolaylaştırır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig1largev1.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig2v1.jpg" /> 
Şekil 2: Kuyruk veninden kan örneği alma sonrası fare yüz ifadesi ölçeği (grimace scale). Erkek veya dişi farelerden, uygulama tüneli veya geleneksel bir sabitleyici içerisindeyken kan örneği alınmıştır. Fare yüz ifadesi ölçeğini değerlendirmek için kullanılan fotoğraflar, hayvanlar sabitleyiciden veya tünelden çıkar çıkmaz çekilmiş ve daha sonra farelerin grup dağılımına dair bilgisi olmayan iki deneyimli araştırmacı tarafından bağımsız olarak; orbital sıkılaşma, burun şişkinliği ve kulak pozisyonuna göre puanlanmıştır. Her hayvan için iki puan üzerinden ortalama bir skor hesaplanmıştır. (A) Dişi fareler (tünel n = 5; sabitleyici n = 8). (B) Erkek fareler (tünel n = 11; sabitleyici n = 11). Bu grafik, Schlutt ve ark., 2026, PLOS ONE çalışmasından uyarlanmıştır. CC BY 4.0 lisansı altında sütun grafiği olarak yayınlanan orijinal veriler, burada modifiye edilmiş ve kutu-bıyık grafiği olarak yeniden çizilmiştir. (C) ChatGPT Image 2 (OpenAI; <a href="https://chatgpt.com/" target="_blank">https://chatgpt.com/</a> adresinden erişilebilir) kullanılarak yazar tarafından geliştirilen bir metin istemiyle oluşturulan yüz hareket birimlerinin şematik gösterimi; nihai görüntü, bilimsel doğruluk açısından yazarlar tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Veriler kutu-bıyık grafikleri (minimumdan maksimuma) olarak sunulmuştur; çizgi ortalamayı belirtir. Mann-Whitney testi, p-değerleri &#60; 0.05 anlamlı kabul edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig2largev1.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig3v1.jpg" /> 
Şekil 3: İntravenöz enjeksiyon sonrası duyulabilir vokalleşmeler ve geri dönme girişimleri. Erkek veya dişi farelere, uygulama tüneli içinde veya geleneksel bir sabitleyicide 100 µL 0.9% NaCl intravenöz enjeksiyonu uygulanmıştır. İşlem sırasında duyulabilir vokalleşme olayları ve sabitleme cihazı içinde geri dönme girişimleri kaydedilmiştir (evet/hayır). Tüm gruplar n = 10. Veriler istiflenmiş çubuk kontenjans grafikleri olarak sunulmuştur. Fisher'ın kesin testi kullanılmış, p-değerleri &#60; 0.05 olanlar anlamlı kabul edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig3largev1.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Uygulama tünelinin daha büyük bir versiyonu kullanılarak sıçanlara intraperitonal enjeksiyon. Sıçanlara intraperitonal enjeksiyon için 15 cm çapında bir uygulama tüneli kullanılmıştır. İşlem, fareler için açıklanan protokol ile aynı şekilde gerçekleştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/Supplementary Figure 1.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, enjeksiyonlar veya kan örneklemesi sırasında fareleri sabitlemek için kullanılan, stres düzeyini azaltan ve prosedürler sırasında refahı artıran yeni bir manuel kısıtlama yöntemini açıklamaktadır.

Farelerde Madde Uygulaması ve Kan Örneği Alımı için Refah Odaklı Manuel Sabitleme Tekniği

Hayvan deneyleri, hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına ve etkinliğin değerlendirilmesine önemli katkılar sağlayarak biyomedikal araştırmalarda temel önemini korumaktadır...

Araştırmamız, biyomedikal prosedürler sırasında stresi en aza indirirken hayvan ve uygulama operatörü güvenliğini artırmak için etkili kemirgen sabitleme yöntemlerine odaklanmaktadır. Geleneksel fare sabitleme yöntemleri stres oluşturabilir ve deneysel sonuçları etkileyebilir. Bu protokol, prosedürel etkinliği korurken daha güvenli ve daha az stresli bir sabitleme yöntemi sunmaktadır.Başlamak için, uygulama tünelini %70 etanol ile temizleyin ve yaklaşık beş dakika boyunca tamamen buharlaşmasını bekleyin. Yıkanmış ve otoklavlanmış bir parça astarı rulo yaparak uygulama tünelinin içine yerleştirin. Parmaklarınızı kullanarak, tünel girişindeki astarı, kalan açıklık yaklaşık iki bitişik parmak genişliğine gelene kadar hafifçe sıkıştırın. Ardından, uygulama tünelini çalışma yüzeyine konumlandırın ve tünel girişinin önüne düz bir astar parçası daha yerleştirin. İstenen enjeksiyon solüsyonunu içeren 27 gauge iğne takılı enjeksiyon şırıngasını hazırlayın ve uygulama tünelinin yanına koyun. Pamuklu çubukların ve dezenfektan spreyin kolayca erişilebilir olduğundan emin olun.Fareyi ana kafesten transfer etmek için, farelerin tünele gönüllü olarak girmesine izin verecek şekilde tutma tüpünü uygulama tünelinin önüne yerleştirin. Fare içeri girdikten sonra, dönmesine izin vermeden rulo halindeki astarın içinde kalmasını sağlayın.Farenin kuyruğunu ucundan tutarak nazikçe düzeltin ve planlanan enjeksiyon bölgesini dezenfekte edin. Lateral kuyruk venlerini dorsal konuma getirmek için kuyruğu yaklaşık 90 derece döndürün. Gerektiğinde proksimal bölgeleri ek denemelere saklamak amacıyla, iğneyi kuyruğa neredeyse paralel olacak şekilde 15 ila 20 derecelik bir açıyla yerleştirerek enjeksiyona kuyruğun distal ucundan başlayın. İğneyi sadece hafifçe eğim kısmının ötesine ilerletin. İstenen hacmi, 13 saniye boyunca kilogram başına en fazla 5 mililitre olacak şekilde yavaş ve sabit bir hızla enjekte edin. Ardından iğneyi geri çekin ve kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesine steril bir pamukla nazikçe bastırın.Fareyi içeren uygulama tünelini ana kafese geri yerleştirin ve farenin uygulama tünelinin karşı ucundan isteğe bağlı olarak çıkmasına izin verin. Pozitif pekiştirmeyi ve prosedüre alışmayı desteklemek için ana kafese ödüller koyun.Uygulama tünelinin iç astarını çıkarın ve tüneli %70 etanol ile temizleyin. Astar temizse yeniden kullanın, aksi takdirde yeniden kullanmadan önce yıkayın ve otoklavlayın.Uygulama tüneli hazırlandıktan sonra, tüneli çalışma yüzeyindeki kamanın üzerine yerleştirin ve tünel girişinin önüne ek bir düz astar koyun. Fareyi, daha önce gösterildiği şekilde uygulama tüneline girmeye bırakın. Farenin kuyruk tabanını bir elinizin başparmağı ve işaret parmağıyla tutun. Aynı elin orta parmağını kullanarak sakral bölgeye hafifçe bastırın ve kuyruğu hafifçe yukarı doğru çevirin. Kaudal abdominal bölgeye net erişim sağlamak için fareyi sabitleyin. Şırıngayı çalışma yüzeyine paralel tutarak ve iğneyi net bir şekilde görünen kaudal abdominal bölgeye yerleştirerek enjeksiyonu gerçekleştirin. Enjeksiyondan sonra, baskıyı ve kuyruğu nazikçe bırakın, ardından farenin tünelden çıkmasına izin verin ve uygulama tünelini daha önce gösterildiği şekilde temizleyin.Tünel hazırlığının ardından farenin uygulama tüneline gönüllü olarak girmesiyle, kuyruğun ucundan tutarak hafifçe düzeltin ve hedeflenen örnekleme bölgesini dezenfekte edin. Lateral kuyruk venlerini dorsal pozisyona getirmek için kuyruğu yaklaşık 90 derece döndürün. Bir lanset kullanarak lateral kuyruk venini delin ve kan damlalarını bir mikrotüp veya kapiler ile toplayın. Ardından, kanamayı kontrol etmek için delme noktasına steril bir pamuklu çubukla hafifçe bastırın; daha sonra daha önce gösterildiği gibi pozitif pekiştirme uygulayın ve tüneli temizleyin.Uygulama tünelinde kan örneği alındığında, hem dişi hem de erkek farelerde, geleneksel sabitleyiciye kıyasla fare yüz buruşturma ölçeği skorunda anlamlı bir azalma görülmüştür. Hem dişi hem de erkek farelerde, intravenöz enjeksiyonlar uygulama tüneli içerisinde gerçekleştirildiğinde, geleneksel bir sabitleyiciye kıyasla duyulabilir vokalizasyonların ve geri dönme girişimlerinin daha az gerçekleştiği gözlemlenmiştir.Yeni uygulama tünelimiz, rutin enjeksiyonlar ve kan örneklemesi sırasında farelerin düşük stresli ve güvenli bir şekilde sabitlenmesini sağlarken, tutma işlemlerini ve hayvan refahını iyileştirmektedir. Önemli bir husus, bu yöntemin yalnızca uyanık hayvanlarla sınırlı olması ve sadece kuyruk ile alt karın bölgesine erişim sağlamasıdır. Gelecekteki çalışmalar bu yöntemi sıçanlara uyarlayabilir ve çeşitli biyomedikal prosedürler, hayvan modelleri ve araştırma uygulamaları genelindeki etkinliğini inceleyebilir.

welfare-oriented-manual-restraint-technique-for-substance

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kemirgen solunum fizyolojisi ve solunum yolu inflamatuar hücrelerin örnekleme tekrarlanan ölçümler arzu edilir, ancak genellikle mümkün değildir. Burada sözlü havayolu inflamatuar hücrelerin havayolu hiperreaktivite ve örnekleme tekrarlanan ölçümler izin verir fareler Entübasyon için tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Araştırma kemirgenler ile güvenli ve insanca çalışma taşıma ve bağlama yöntemleri bir temel yetkinlik gerektirir. Bu makalede, güvenli işlemek ve etkili fare ve sıçanlara bileşikler yönetmek için gerekli temel ilkeleri sunacak.

Manuel Tutucu ve Fare ve Sıçanlarda Ortak Bileşik İdaresi Rotalar

Biz Amerikan pika gösterildiği gibi, verimli bir şekilde zor küçük memeliler saç örnekleri toplamak için bir non-invaziv örnekleme yaklaşımı sunuyoruz. Biz örneklenmiş saç DNA açılan ve yaban hayatı ekolojisi ve korunması çalışmalarında yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler çeşitli yükseltme bu yöntemin yararını göstermektedir.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Bilinen bir modeli olsa da, kobay şu anda deneysel hayvan bilimleri bir niş temsil eder ve sınırlı veri çoğu prosedürlerin yürütülmesi mevcuttur. Burada bilinçli ya da anestezi kobay ya vivo kan örnekleme teknikleri terminal olmayan dört farklı yaklaşımlar sunuyoruz.

Kobaylardaki Sigara Terminal Kan Örnekleme Teknikleri

Kan örnekleri, in vivo fizyolojik durumların veya hastalıkların biyobelirteçlerini değerlendirmek için yararlıdır. Burada, sıçandaki lateral kuyruk damarından kan örneği almak için metodolojiyi açıklıyoruz. Bu yöntem, minimum ağrı ve invazivlik ile hızlı numuneler sağlar.

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojen tespit alanında geniş ilgi gören bir izotermal nükleik asit amplifikasyon testidir (iNAAT). Burada, Salmonella'yı hayvansal gıdalarda taramak ve tahmin edilen Salmonella'yı kültür izolasyonundan doğrulamak için hızlı, güvenilir ve sağlam bir yöntem olarak çok laboratuvar onaylı bir Salmonella LAMP protokolü sunuyoruz.

Hayvansal Gıdalarda Salmonella Taramak ve Salmonella'yı Kültür İzolasyonundan Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar.

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Bu protokol, kendi kendine yapılan bir retraktör kullanılarak minimal invaziv transvers aort daralması (TAC) prosedürü ile modifiye edilmiş ve basitleştirilmiş bir tekniği tanımlamaktadır. Bu prosedür ventilatör veya mikroskop olmadan yapılabilir ve sonunda kardiyak hipertrofi veya kalp yetmezliğine yol açan aşırı basınç yüküne neden olur.

Farelerde Transvers Aort Daralması için Modifiye Bir Teknik

Öğrenin farelerde uygulama tüneli kullanarak refah odaklı sabitleme tekniğini. Bu yöntem, enjeksiyon ve kan örneği alımı sırasında akut stresi azaltarak hem hayvan refahını hem de deneysel veri kalitesini artırır.

Farelerde Madde Uygulaması ve Kan Örneği Alımı için Refah Odaklı Manuel Sabitleme Tekniği

Daha fazla video keşfet