Name: Drosophila melanogasterda DR-white Analizi Kullanarak DNA Çift Zincir Kırığı Onarımının Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster'da DR-white analizi ile DNA çift zincir kırığı onarımını ölçme yöntemini. Bu protokol homolog rekombinasyon, NHEJ ve SSA yollarını ayırt ederek çok hücreli organizmalarda onarım mekanizmalarını incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu yöntem, J.R.L.'nin American Federation for Aging Research'dan AFAR Araştırma Hibesi aldığı dönemde geliştirilmiştir.&#160;Bu çalışma ayrıca, J.R.L.'ye sağlanan National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 ve 1R15GM129628) desteği ile gerçekleştirilmiştir. Şekiller, BioRender'ın (https://BioRender.com/b8sbcjp) yardımıyla 2026 yılında hazırlanmıştır.

1. DR-white analizi
<ol>
	<li>Genetik çaprazlamalar (Şekil 3A) 
	NOT: Standartlar için Drosophila kültürleme ve genetik protokolleri için bakınız &#34;Sinek itme: Drosophila genetiğinin teorisi ve pratiği&#34; Ralph J. Greenspan tarafından17Stok genotip bilgileri şurada sağlanmıştır: Materyaller Tablosu.
	<ol>
		<li>Sinekleri 25 °C'de, 12 saatlik ışık/karanlık döngüleri ile standart ortamda muhafaza edin Drosophila aktif maya serpilmiş gıda.</li>
		<li>8-10 DR- çaprazlayarak beş adet ısı şoku tüpü hazırlayın.beyaz bakire dişiler, [bir] ... taşıyan 3-5 erkeğe I-SceI transgen (Çaprazlama 1, Şekil 3A) flakon başına. 
		NOT: Farklı I-SceI transgenler uygulamaya bağlı olarak kullanılabilir. Bu protokolde, hsp70-I-SceI ısı şoku indüksiyonu için transgen kullanılmıştır11Sızıntıyı önlemek için I-SceI önceki nesillerdeki ekspresyonda, DR- sisteminin sağlandığından emin olmak önemlidirbeyaz ve I-SceI transgenler yalnızca bu nesilde aynı sinekte birleştirilir.</li>
		<li>Aynı gün, a için genişletme şişelerini hazırlayın y w stok. Bunlar test sinekleri olacaktır. Yaklaşık 60–80 test çaprazlaması için üç genişletme şişesi yeterlidir.</li>
		<li>Isı şoku flakonlarını kültüre edin ve y w genleşme şişelerinde 25 °C'de 3 gün boyunca.</li>
		<li>Üçüncü günde, ısı şoku tüplerini ters çevirin ve y w yedek set olarak hizmet edecek taze gıda içeren genişletme şişeleri.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isı şoku/DSB indüksiyonu 
	NOT: Isı şokuyla indüklebilir bir sistem kullanılmıyorsa I-SceI transgen için 1.2.5 adımına geçiniz; bu işlem genellikle 1.1.5 adımından 3 gün sonra gerçekleştirilir.
	<ol>
		<li>Tüm yavruların maternal-zigotik geçiş sürecini tamamladığından emin olmak için ısı şoku tüplerini 25 °C'de 3 saat bekletin.</li>
		<li>Orijinal vialleri 38 °C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca ısı şokuna tabi tutun. Larvaların su hattının üzerine çıkmaması için su seviyesinin en azından pamuk topunun altıyla aynı hizada olduğundan emin olun.</li>
		<li>Su banyosu sıcaklığını her 15 dakikada bir izleyin ve 38 ± 0,5 °C aralığında tutun; çünkü indüksiyon ve onarım sonuçları, ısı şokunun süresine ve sıcaklığına bağlıdır.</li>
		<li>Flakonları 25 °C'ye getirin.</li>
		<li>Ertesi gün, fazla nemi emmesi için gıdaya katlanmış bir laboratuvar mendilinin 1/3'ünü ekleyin. Gıda kuruysa, laboratuvar mendiline yaklaşık 100 µL su ekleyin. Şunları ekleyin: bir pamuk topu y w genleşme şişeleri</li>
		<li>Isıl şoka maruz bırakılmış şişeleri, sinekler çıkana kadar veya ek 6 gün boyunca 25 °C'de kültüre edin.</li>
		<li>Çevirme işleminden 3 gün sonra yedek tüpleri ve genişletme şişelerini temizleyin. Yedeğin içine bir pamuk topu ekleyin. y w berraklaştırma işleminden yaklaşık 4 gün sonra genişletme şişeleri. 
		NOT: Gerektiğinde, yedek tüpler 1.2.1 ile 1.2.6 arasındaki adımlarda olduğu gibi ısı şokuna tabi tutulabilir ve aşağıda açıklandığı şekilde işlenebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test melemleri
	<ol>
		<li>DR- taşıyan ısı şokuna uğratılmış sinekleri toplayınbeyaz ve I-SceI çıkış başladıktan sonraki 4–5 gün boyunca transgenler, gelişim evresi yanlılığını azaltmaya başlar. 
		NOT: DR- taşıyan ve ısı şokuna başarıyla maruz bırakılmış sineklerbeyaz ve I-SceI embriyonik ve larval onarım olayları nedeniyle mozaik gözlerle birlikte bulunan transgen, yetişkin dokularına gelişmiştir. Mozaikliğin düzeyi, germ hattı onarım olaylarıyla her zaman ilişkili değildir ve bu nedenle testleme çaprazlamaları için deneysel sinekler seçerken (adım 1.3.3) belirleyici bir faktör olmamalıdır.</li>
		<li>Topla y w 5 gün boyunca bakire dişiler. Beklenen numune sayısı başına 5 bakire dişi toplayın. Çıkış yapmaya başladıkları anda yedek çoğaltma şişelerinden toplayın.</li>
		<li>Bir ısı şokuna maruz bırakılmış erkeği 4-5 adet [dişi] ile çaprazlayarak test tüplerini hazırlayın y w bakire dişiler (Çaprazlama 2; Şekil 3A). Gelişim evresi yanlılığını azaltmak için 1.3.1 adımındaki ortak havuzdan rastgele erkekler seçin. Test çaprazlamalarını 25 °C'de kültüre edin. 
		NOT: DR- geçişini önlemek için-beyaz ve I-SceI, en yaygın olarak erkek germ hücreleri analiz edilir; ancak dişi döller de analiz edilebilir. Dişi döller analiz edilecekse, Cross 2 test tüpleri 2:5 dişi:y w erkek oranı ve üretkenliği sağlamak için 5–6 gün boyunca kültüre alınır (sonraki adım).</li>
		<li>Test tüplerinin ne zaman boşaltılması gerektiğini belirlemek için, kurulumdan 4 gün sonra üretkenliği kontrol edin. 
		NOT: En az 20 değerlendirilebilir döl elde etmek için yeterli yumurtanın bırakıldığını onaylayın; ancak kültürlerin aşırı büyümesine izin vermeyin, aksi takdirde sineklerin besine yapışma olasılığı yüksektir.</li>
		<li>Test tüpleri hazır olduğunda (test çaprazlamaları oluşturulduktan sonra 4-5 güne kadar), sinekler atılmalı ve fazla nemi absorbe etmek için gıdaya katlanmış bir laboratuvar mendilinin 1/3'ü eklenmelidir. 
		NOT: Daha ileri analizler (örneğin, moleküler genotipleme) gerekliyse, erkekler bu aşamada toplanabilir.</li>
		<li>Test tüplerini 25 °C'de ek olarak 5–6 gün daha kültüre edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Puanlama 
	NOT: Her bir genetik deney için her bir koşulda (örneğin, homozigot mutantlar ve heterozigot kontroller) yaklaşık 25 test tüpü hazırlanır. Her bir genetik deney 2–3 kez tekrarlanır ve bireysel tüp verileri birleştirilir.
	<ol>
		<li>Çaprazlama 2'nin döllerini puanlayın (Şekil 3Ailk sinekler çıkmaya başladıktan sonra yaklaşık 9 gün boyunca.</li>
		<li>Sinekleri CO2 kullanarak anestezi altına alın2 veya sineklerin yemsiz boş bir tüpe aktarılıp -20 °C'de en az 30 dk dondurulmasıyla. 
		NOT: Sinekler dondurulursa, değerlendirmeleri birkaç gün sonrasına kadar ertelenebilir.</li>
		<li>Sinekleri bir sinek pedi üzerine yerleştirin ve uygun fenotipler için skorlama yapın (Şekil 3A). Veri setine yalnızca en az 20 puanlanmış sinek içeren vialleri dahil edin.
		<ol>
			<li>Puanlama yapmak için, önce DR- taşıyan sinekleri ayıklayın.beyaz kaset (marker olarak kırmızı floresan protein pozitif [RFP+] floresansı kullanılarak), ardından göz ve vücut rengi skorlanmalıdır.</li>
			<li>The y+ DR- ile bağlantılı transgenbeyaz kaset, tamamen vahşi tip olmayan, ara bir kahverengi gövde rengine yol açar. No DSB/NHEJ'i (kahverengi gövde;&#160;y+&#160;vve SSA (sarı gövde;&#160;y-&#160;w-), sineklerle karşılaştırın y w DR- taşımayan döllerbeyaz kromozom (RFP-). SSA olayları, bu sineklerle aynı sarı renge sahip olacaktır. Bunlardan daha koyu (daha kahverengi) olan sinekleri DSB/NHEJ Yok olarak skorlayın. 
			NOT: Şunlarda tanımlanan fenotiplerden sapmalar: Şekil 3A&#160;kontaminasyona işaret edebilir ve flakon skorlanmamalıdır. Ölü sineklerin tamamı skorlanabilse de, fenotipler belirlenemiyorsa hasarlı sinekler atılmalıdır.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TIDE analizi (Şekil 4)
<ol>
	<li>Genomik DNA (gDNA) ekstraksiyonu18
	<ol>
		<li>Çaprazlama 1 progeny'lerinde olduğu gibi, hem DR-white hem de I-SceI transgenini taşıyan ısı şokuna uğratılmış sinekleri (veya larvaları) toplayın (Şekil 3A).</li>
		<li>Tekil sinekleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve şok dondurma işlemi yapın (örneğin, kuru buz/etanol banyosu veya sıvı azot). 
		UYARI: Kuru buz, sıvı azot, etanol, izopropanol ve diğer kimyasalları uygun kişisel koruyucu donanım ve kurumsal güvenlik prosedürlerini kullanarak kullanın. 
		DURAKLAMA NOKTASI:&#160; Numuneler -80 °C'de saklanabilir ve gerektiğinde daha sonra işlenebilir. Sinekler veya larvalar analiz ediliyorsa, numune başına tek bir (bir) sinek veya larva kullanın. Daha küçük dokular (örneğin, beyinler, imaginal diskler) analiz ediliyorsa, DNA verimini artırmak için numuneleri havuzlayın.</li>
		<li>Her numuneyi, bir elektrikli homojenizatör kullanarak 50 µL Tampon A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA]; 100 mM sodyum klorür; %0,5 sodyum dodesil sülfat [SDS]) içinde homojenize edin.</li>
		<li>Numuneleri bir su banyosunda 65 °C'de 30 dk inkübe edin.</li>
		<li>Her numuneye 100 µL Tampon B (1,4 M potasyum asetat, 4,3 M lityum klorür) ekleyin ve tüpleri ters çevirerek kısa süreli karıştırın. 
		NOT: Tam sinek kullanılıyorsa, numuneleri tam olarak homojenize etmek için daha yüksek hacimler gerekebilir. Bu durumda, 1:2 Tampon A:Tampon B hacimsel oranını koruyun.</li>
		<li>Numuneleri buz üzerinde en az 30 dk inkübe edin.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de yaklaşık 16.000 x g hızında 15 dk santrifüjleyin.</li>
		<li>Berrak süpernatantın 125 µL'sini yeni 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Herhangi bir çökelekten kaçının.</li>
		<li>Her 125 µL süpernatant için 100 µL %100 oda sıcaklığında izopropanol ekleyin ve tüpleri ters çevirerek kısa süreli karıştırın.</li>
		<li>Numuneleri oda sıcaklığında yaklaşık 16.000 x g hızında 10 dk santrifüjleyin.</li>
		<li>DNA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı aspire edin. 
		NOT: DNA peleti bu aşamada görünür olmayabilir. Mikrosantrifüje yerleştirirken tüplerin yönünü not edin ve peletin olması beklenen yerin karşı yüzeyinden aspirasyon yapın.</li>
		<li>Peletleri 250 µL buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkayın, ardından tüpleri nazikçe ters çevirerek kısa süreli karıştırın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de yaklaşık 16.000 x g hızında 5 dk santrifüjleyin.</li>
		<li>Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı aspire edin. 
		NOT: Pelet, etanol yıkamasından sonra daha görünür olabilir. Değilse, Adım 2.1.11'deki Not kısmına bakın.</li>
		<li>Kalan etanolün buharlaşması için tüpleri oda sıcaklığında kapağı açık bırakın. Peletin aşırı kurumasına izin vermeyin, aksi takdirde tamamen yeniden çözünmeyebilir.</li>
		<li>20 µL nükleazdan arındırılmış su ekleyin ve peletlerin 4 °C'de gece boyunca yeniden çözünmesine izin verin. 
		DURAKLAMA NOKTASI: DNA peleti tamamen çözünmemişse, ek su eklenebilir.</li>
		<li>Ertesi gün tüpleri nazikçe ters çevirin ve DNA konsantrasyonunu ölçün. Hemen işlemeyecekseniz numuneleri -20 °C'de saklayın. 
		NOT: Tek sinek ekstraksiyonu için verimler genellikle yaklaşık 100 ng/µL'dir. Yüksek kaliteli numuneler önemlidir. A260/A280 absorbansı 1,7 ile 2,0 arasında olmalıdır. Bu aralığın dışındaki değerler proteinler gibi kontaminantlara işaret eder. A260/A230 değeri 2,0 ile 2,2 arasında olmalıdır. Bu aralığın dışındaki değerler etanol ve tampon tuzları gibi kontaminantları gösterir. Düşük verimli ve kalitesiz numuneler, zayıf PCR amplifikasyonuna neden olabilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
	<ol>
		<li>Üretici talimatlarını izleyerek 100 ng gDNA ve DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) ve DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) primerlerini kullanarak PCR yoluyla Sce.white üzerinden amplifikasyon yapın. Bir DR-white kontrol sinek numunesi ekleyin (yani, I-SceI transgeni bulunmayan DR-white ebeveyn stok). Şu döngü koşullarını kullanın: 94 °C'de 3 dk; {94 °C'de 30 sn; 66 °C'de touchdown (-0,5 °C / döngü) 30 sn; 72 °C'de 30 sn} x 16 döngü; {94 °C'de 30 sn; 58 °C'de 30 sn; 72 °C'de 30 sn} x 20 döngü; 72 °C'de 5 dk; 12 °C'de bekletme. 
		NOT: Farklı bir reaktif kullanılıyorsa döngü koşullarının ayarlanması gerekebilir.</li>
		<li>Sce.white amplifikasyonunu doğrulamak için yaklaşık 2 µL PCR ürününü %1 tris-asetat-EDTA (TAE)-agaroz diagnostik jelde yürütün. Beklenen amplikon boyutu yaklaşık 1,7 kb'dir.</li>
		<li>Sce.white amplikonlarını PCR yöntemiyle saflaştırın ve DNA konsantrasyonunu ölçün.</li>
		<li>Saflaştırılmış PCR ürününü DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC) primeri kullanarak sekanslayın. 
		NOT: Genellikle 40 ng saflaştırılmış PCR ürününü sekanslarız, ancak bu durum sekanslama servisinin talimatlarına göre farklılık gösterebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TIDE analizi 
	NOT: TIDE R script'inin kullanımından kaynaklanan çoğu hata, yanlış kod formatlamasına dayandırılabilir.
	<ol>
		<li>Gerekli R paketlerini (yani, sangerseqR ve Biostrings) Bioconductor.org'dan indirin. Her paketin en son versiyonunu bulmak için arama çubuğunu kullanın.</li>
		<li>Sekans kromatogramlarının iyi kalitede olduğundan emin olmak için onları analiz edin. Sadece kırılma bölgesinden önce çok az arka plan gürültüsü olan veya hiç olmayan kromatogramları analiz edin.</li>
		<li>Sekans izleme dosyalarını (.ab1 dosya uzantısını kullanarak) indirin ve tüm sekans izleme dosyalarını tek bir bilgisayar klasörüne yerleştirin. Sonraki adımlarda script düzenlemelerini kolaylaştırmak için sekans dosya adlarını mümkün olduğunca basitleştirin (örneğin, F1, Het2, Hom3).</li>
		<li>TIDE R script'ini (Ek Dosya 1), RStudio entegre geliştirme ortamında (IDE; Malzeme Tablosuna bakın) açın. Kaynak (Source) panelinde, Control &#60;- ile başlayan satırı bulun (Ek Dosya 2A) ve kontrol sekans dosya adını, .ab1 uzantısı dahil olmak üzere, tırnak işaretleri içinde kaydedildiği şekliyle tam olarak girin. 
		NOT: “Kontrol sekansı”, I-SceI transgeni veya indüksiyonu olmayan ebeveyn DR-white stokundan alınan PCR'ın sekansıdır.</li>
		<li>samplename &#60;- c( ile başlayan satırı bulun ve her bir numune sekans dosya adını parantez içine girin (Ek Dosya 2A). .ab1 uzantısını ekleyin, her dosya adını ayrı tırnak işaretleri içine yerleştirin ve dosya adlarını virgüllerle ayırın.</li>
		<li>Düzenlenen TIDE R script dosyasını, analiz edilecek sekanslarla aynı klasöre kaydedin. Sonraki adımlarda hata oluşmasını önlemek için dosya adını basit tutun.</li>
		<li>IDE'de, Çıktı (Output) panelindeki Dosyalar (Files) sekmesini kullanarak TIDE klasörüne gidin (Ek Dosya 2B).</li>
		<li>More açılır menüsüne tıklayın ve Open New Terminal Here seçeneğini belirleyin (Ek Dosya 2C). Konsol (Console) panelinde (sol alt) yeni bir terminal açılacaktır.</li>
		<li>Yeni açılan Terminal'e “R” yazın ve Enter tuşuna basın (Ek Dosya 2D).</li>
		<li>R terminalde çalışmaya başladığında, source(&#34;TIDE_analysis.R&#34;) yazarak ve Enter tuşuna basarak TIDE R script'ini çalıştırın (Ek Dosya 2E). Terminal script'i çalıştıracak ve grafiksel bir temsil (Ek Dosya 2F) ile her numune için ham verileri içeren bir .csv dosyası (Ek Dosya 2G ve Ek Dosya 3) üretecektir. Çıktı dosyaları, R script'i ve sekans dosyalarıyla aynı klasöre kaydedilir. 
		NOT: Aynı R script'i yeniden çalıştırılırsa, oluşturulan her yeni .csv dosyası eskilerinin üzerine yazılır. Aynı dosyalar üzerinde birden fazla analiz yapılıyorsa, klasörün bir kopyasını alın.</li>
		<li>Her bir .csv dosyasını açarak verileri analiz edin.
		<ol>
			<li>Ham verileri, numune sekansındaki indel oranları olarak yorumlayın. I-SceI tanıma sekansından wild-type SacI sekansına homolog rekombinasyon gen dönüşümü, kanonik 23-bp delesyonu üretir; script bu HR değerini çıktının alt kısmında ayrı bir satırda bildirir (Ek Dosya 2G). 0-indel değeri, DSB olmamasını veya indel içermeyen NHEJ'i temsil eder. İşlemli NHEJ'i elde etmek için diğer tüm indel değerlerini toplayın. İşlemli NHEJ ve HR'nin toplamı, tespit edilebilir toplam DSB onarım olayları sayısıdır.</li>
			<li>Tespit edilebilir DSB onarım olayları arasındaki onarım yolu oranlarını aşağıdaki denklemleri kullanarak hesaplayın: 
			İşlemli NHEJ oranı = (İşlemli NHEJ) / (İşlemli NHEJ + HR) 
			HR oranı = (HR) / (İşlemli NHEJ + HR) 
			NOT: Her genetik deney için her koşulda yaklaşık 10–15 numune kullanılır (örneğin, homozigot mutantlar ve heterozigot kontroller). Her genetik deney 2–3 kez tekrarlanır ve bireysel veriler havuzlanır.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.</li>
	<li>Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.</li>
	<li>Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.</li>
	<li>Figueroa-Gonz&#225;lez G, P&#233;rez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.</li>
	<li>Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.</li>
	<li>Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.</li>
	<li>Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.</li>
	<li>Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.</li>
	<li>Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.</li>
	<li>Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.</li>
	<li>Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.</li>
	<li>Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.</li>
	<li>Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.</li>
	<li>Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.</li>
	<li>Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.</li>
	<li>Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.</li>
	<li>McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.</li>
	<li>Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.</li>
	<li>Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.</li>
	<li>Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.</li>
	<li>Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.</li>
	<li>Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.</li>
	<li>Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.</li>
	<li>Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.</li>
	<li>Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.</li>
	<li>Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.</li>
	<li>Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkar çatışması yoktur.

DR-white sisteminin çok yönlülüğü, DNA onarımı alanındaki geçmiş ve gelecekteki etkisi için kritik bir faktördür. İlk olarak, DR-white raporlayıcı konstrüktündeki attB entegrasyon dizisi, araştırmacıların raporlayıcıyı Drosophila genomundaki çok sayıda konuma hedeflemesine olanak tanır21 ve halihazırda birçok hedefli hat mevcuttur22. İkinci olarak, hsp70 promotörü aracılığıyla ısı şoku ekspresyonu (bu çalışma), ubiquitin promotörü aracılığıyla konstitütif ekspresyon23 ve Bam promotörü aracılığıyla premeiyotik germ hattı ekspresyonu24 gibi farklı I-SceI transgenlerinin mevcudiyeti, DSB onarımını keşfetmek için çok sayıda gelişimsel ve doku spesifik bağlam sunar. Kullanılan &#160;I-SceI transgenine bakılmaksızın, uygun DSB indüksiyonunu sağlamak için I-SceI transgeninin yalnızca son çaprazlamada tanıtıldığından emin olmak adına genetik çaprazlamalar dikkatle planlanmalıdır. Onarım frekanslarının, DR-white genomik konumuna ve/veya kullanılan I-SceI&#160;transgenine bağlı olarak önemli ölçüde değişebileceğini belirtmek önemlidir. Gelecekteki deneyler, genomik bağlamın mı yoksa doku spesifikliğinin mi DSB onarımını yönlendirdiğini belirlemek için genomik konumları ve I-SceI transgenlerini daha ayrıntılı olarak karşılaştırabilir.
DR-white testi ve türevlerinin özel bir avantajı, DSB'lerin homolog rekombinasyon, işlemeli NHEJ ve çoğu durumda SSA aracılığıyla onarımını tanımlayabilmeleridir. Sistem, fenotipik olarak germ hattı onarım olaylarını tespit etmek için tasarlanmış olsa da, TIDE algoritmik analizi yoluyla somatik dokuların analizine de olanak tanır. Bu avantajlara rağmen, bu testin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Özellikle, DR-white testi HR frekanslarını olduğundan düşük tahmin edebilir. Nükleaz kaynaklı DSB'ler kullanan diğer genetik raporlayıcı testlerde olduğu gibi, kardeş kromatid aracılığıyla gerçekleşen HR onarımı (intersister HR), DSB olmayan bir olaydan veya işlemesiz NHEJ'den ayırt edilemez. Bu nedenle, "No DSB/NHEJ" sınıfının en az bir kısmı HR olayları olabilir. Bu sınırlama göz önüne alındığında, genetik faktörleri (mutant hatlar gibi) karşılaştıran sonuçlar ihtiyatla değerlendirilmelidir. Testin diğer sınırlamaları arasında, canlı döller üretmeyen premeiyotik olayların skorlanamaması yer alır. Örneğin, onarılmamış olabilecek ve hücre ölümüyle sonuçlanan DSB olayları döllerde skorlanmayacaktır. Genel fertilite, germ hattı hücre ölümü için kalitatif bir ölçüt olsa da, hücre tabanlı testler (TUNEL gibi) gerekebilir. Ek olarak, TIDE R script analizi yalnızca bir hücre popülasyonundaki tespit edilebilir olayların oranını sağlar. Spesifik indel sekans sonuçlarını belirlemek için, multipleks DNA sekanslama kullanılarak bireysel onarım olaylarının sekanslanması gereklidir.
DR-white analizi, DSB onarımı çalışmalarında şimdiden derin bir etki yaratmıştır. Bu analizin uygulaması; yaş25, cinsiyet26, DSB konumu22,26, donör dizilim konumu15, hücre döngüsü ve doku tipi26 dahil olmak üzere çok hücreli organizmalarda DSB onarımına katkıda bulunan faktörleri tanımlamıştır. Ayrıca, bu analizi Drosophila türünde onarım yolu seçimini ve/veya diverjan dizilerin onarımını yönlendiren Msh627, Blm28, Rif116 ve CtIP16,29 gibi çeşitli proteinleri tanımlamak için kullandık. Nitekim, korunmuş DNA onarım proteinlerine sahip genetik bir model organizma olarak Drosophila'nın yerleşik kullanımı, karmaşık biyolojik bağlamlarda DSB onarımına katkıda bulunan genetik, hücresel ve organizmal faktörlerin araştırılması için basit ve çok hücreli bir sistem sunmaktadır.

Genomik bütünlük sıklıkla DNA lezyonları tarafından tehdit edilir ve bunlar arasında çift zincir kırıkları (DSB'ler) özellikle toksiktir. Onarılmadıkları takdirde, bu kırıklar genetik kayba, kromozomal yeniden düzenlemelere ve hücre ölümüne yol açabilir1. Bu nedenle hücreler, DSB'leri onarmak için birden fazla yol geliştirmiştir. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), DSB'nin iki ucunu doğrudan bağlar ve kırılma bölgesinde potansiyel olarak indel oluşumuna neden olur; tek zincir&#160;tavlama (SSA), onarım için kırılma bölgesinin yanındaki tamamlayıcı dizileri kullanır ve kırılma bölgesinde delesyonlarla sonuçlanır; homolog rekombinasyon (HR) ise onarım için bir homolog diziyi şablon olarak kullanır2,3.
Tarihsel olarak, DSB onarım çalışmaları biyokimyasal analizlerle4 veya bakteriler5,6, maya7,8 ve memeli hücre kültürleri9,10 gibi tek hücreli sistemlerle sınırlı kalmıştır. Bu modeller, temel onarım proteinlerinin ve mekanizmalarının belirlenmesinde etkili olsa da, çok hücreli bir organizmanın biyolojik karmaşıkluğundan yoksundur. Drosophila melanogaster, DNA onarımını incelemek için popüler bir çok hücreli model sistem haline gelmiştir. Ancak, mevcut analizlerin çoğu belirli onarım yollarına göre düzenlenmiş11; P-elementi eksizyonu12 gibi büyük kromozomal aberasyonları kullanmakta; veya zaman alıcı moleküler analizler gerektirmektedir13. DR-white analizi, Drosophila içinde DNA onarımına yönelik basit, genetik bir raporlayıcı sağlayarak bu zorlukları gidermektedir14. Bu çalışma, yaygın olarak kullanılan DR-white analizini kullanarak DNA DSB onarımını ölçmek için genetik ve moleküler analizlerin gerçekleştirilmesine yönelik eksiksiz, pratik ve detaylı, adım adım bir iş akışı sunmaktadır.
Analiz, vahşi tip kırmızı göz rengini sağlayan Drosophila white (w) geninin iki doğrudan tekrarını kullanır (Şekil 1). Her iki kopya da işlevsizdir: Birincisi olan Sce.white, vahşi tip bir SacI bölgesinde I-SceI meganükleaz tanıma dizisini taşıyan bir insersiyon içerir ve erken bir stop kodonu getirir; ikincisi olan iwhite ise hem 5' hem de 3' uçlarından kısalmış olup HR onarımı için kalıp görevi görür. İki white tekrarı arasında, vahşi tip kahverengi gövde rengini sağlayan bir Drosophila yellow transgeni (y+) bulunur. DR-white kaseti bir y w mutant arka planına entegre edildiğinden, DR-white sinekleri fenotipik olarak vahşi tip kahverengi gövdeli ve mutant beyaz gözlüdür.
DSB'ler, DR-white sineklerinin I-SceI transgeni taşıyan sineklerle çaprazlanmasıyla Sce.white bölgesinde indüklenebilir. Premeiyotik germ hattındaki DSB'lerin onarımı, bir test çaprazlamasının progeny'lerinin skorlanmasıyla ölçülebilir. NHEJ yoluyla onarım, ebeveyn tipi kahverengi gövdeli, beyaz gözlü fenotip ile sonuçlanırken (Şekil 1A), HR yoluyla onarım vahşi tip white dizisini geri getirir ve kahverengi gövdeli, kırmızı gözlü progeny'lerle sonuçlanır (Şekil 1B). DSB'nin SSA onarımı veya mitotik crossover, aradaki yellow transgeninin kaybına yol açarak sarı gövdeli, beyaz gözlü sineklerle sonuçlanır (Şekil 1C). Somatik hücrelerdeki onarım sonuçlarını analiz etmek için, özellikle DR-white analizinde işlem görmüş NHEJ'i ve HR onarımını tespit etmek amacıyla Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) algoritmasını uyarladık15,16.
DR-white analizi, Drosophila'da önceden kurulmuş DNA onarım analizlerine kıyasla birçok avantaj sunar. Kırılmalar germ hattında oluşturulup onarıldığı için, onarım sonuçları fenotipik analiz yoluyla kolayca tespit edilebilir. Aynı zamanda, analiz son derece çok yönlüdür. Analiz temel olarak HR onarımını ölçmek için tasarlanmış olsa da, her üç onarım yolağını da tespit edebilir. Ayrıca iki ek fonksiyonel onarım şablonu da geliştirdik (Şekil 2). iwhite.mu şablonu 28 sessiz tek nükleotit polimorfizmi (SNP) içerir ve kırmızı gözlü döller üretir (Şekil 2A); bu durum, gen dönüşüm bölgesi (GCT) uzunluklarının ve farklılaşmış diziler arasındaki HR onarımının çalışmalarını kolaylaştırır14.&#160;iwhiteΔ9 şablonu, yaban tipi SacI bölgesinde dokuz baz çiftlik bir delesyon içerir ve turuncu gözlü döllerle sonuçlanır (Şekil 2B). Bu özellik, araştırmacıların farklı şablonlardan gelen HR onarımını takip etmelerine olanak tanır ki bu, DR-white analizine özgü bir özelliktir15.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL RNAse/DNAse içermeyen havanlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>gDNA ekstraksiyonu için örneklerin homojenizasyonu için</td></tr><tr><td>Pamuk topları</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>standart Drosophila kültürü için</td></tr><tr><td>Drosophila Peltier Soğutmalı İnkübatör</td><td>Shel Laboratuvarı</td><td>SRI6PF</td><td>standart Drosophila kültürü için</td></tr><tr><td>Drosophila stoğu: y[1] w[1]</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stok Merkezi</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila stoku: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque Laboratuvarı</td><td>Metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni giriniz.</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden alınan stok RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2])'in standart rekombinasyonu yoluyla LaRocque laboratuvarı tarafından oluşturulmuştur; sorumlu yazardan talep üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>Drosophila stoku: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Laboratuvarı</td><td>Çevrilecek metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz İngilizce metni iletiniz.</td><td>Stok RRID:BDSC_24482'ye entegre edilmiş DR-white analizi (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); sorumlu yazardan talep edilebilir</td></tr><tr><td>Drosophila stoku: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Laboratuvarı</td><td>Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın.</td><td>stok RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP})'e entegre edilmiş DR-white.mu analizi&amp;rsquo;}ZH-51C); sorumlu yazardan talep edilebilir</td></tr><tr><td>Drosophila stoku: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque Laboratuvarı</td><td>Girdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.</td><td>iwhite&amp;Delta;stok RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP içine entegre edilmiş 9 donör&amp;rsquo;}ZH-51C); sorumlu yazardan talep üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>Flugs Drosophila şişe kapakları</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>standart Drosophila kültürü için</td></tr><tr><td>Floresan stereomikroskop (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>standart Drosophila için &quot;sinek itme&quot; ve floresan tabanlı ayıklama</td></tr><tr><td>FlyStuff Drosophila Sinek pedi</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>standart Drosophila için &quot;sinek itme&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MyBath 4L Benmari Cihazı</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>için&amp;nbsp; ısı şoku</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>DNA kantitasyonu için</td></tr><tr><td>Nutri-fly Bloomington Formülasyon Besiyeri</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>standart Drosophila kültürü için</td></tr><tr><td>Pellet Pestle Kablosuz Motorlu Homojenizatör</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>gDNA ekstraksiyonu için örneklerin homojenizasyonu için</td></tr><tr><td>Polipropilen Şişeler</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>standart Drosophila kültürü için</td></tr><tr><td>Polistiren Flakonlar</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>ısı şoku dahil olmak üzere standart Drosophila kültürü için</td></tr><tr><td>Primer/oligonükleotid DR-white_8f</td><td>Y/A; herhangi bir oligonükleotid sentez hizmeti yeterlidir</td><td>Girdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni paylaşın.</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Primer/oligonükleotid DR-white_8a</td><td>Yok; herhangi bir oligonükleotit sentez hizmeti yeterlidir</td><td>Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz profesyonel standartlar ve akademik kriterler çerçevesinde İngilizce'den Türkçe'ye çevirisini gerçekleştireceğim.</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Primer/oligonükleotid DR-white_9f</td><td>U/A; herhangi bir oligonükleotid sentez servisi yeterlidir</td><td>Metin sağlanmamıştır. Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynağı iletiniz.</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Varsaymak</td><td>Sürüm 2023.06.1+524</td><td>Ücretsiz indirilebilir versiyon; sunulan veriler şu sürüm kullanılarak analiz edilmiş olsa da R Studio'nun herhangi bir versiyonu kabul edilebilir:&amp;nbsp; versiyon 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>R Studio paketleri: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Versiyon 3.24)</td><td>Sürüm 2.76.0</td><td>R betiği, kullanıcıdan bu paketi yüklemesini isteyecektir</td></tr><tr><td>R Studio paketleri: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Sürüm 3.24)</td><td>Sürüm 1.44.0</td><td>R betiği, kullanıcının bu paketi yüklemesini isteyecektir</td></tr><tr><td>SapphireAMP Hızlı PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>standart Drosophila için &quot;Sinek itme&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV Jel ve PCR Temizleme&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster'da dr-white analizi kullanarak dna Çift zincir kırığı onarımının Ölçülmesi

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

DNA çift zincir kırığı (DSB) onarımına yönelik geleneksel çalışmalar sıklıkla biyokimyasal incelemeler veya tek hücreli sistemlerle (örneğin hücreler, maya) sınırlıdır. Çok hücreli bir organizmada DSB onarımı çalışmalarını kolaylaştırmak için Drosophila melanogaster'de DR-white analizi kullanıyoruz. DR-white analizi, I-SceI meganükleaz ekspresyonu ile kesilebilen tek bir I-SceI tanıma dizisi taşıyan, basit ancak çok yönlü bir DSB onarım raporlayıcı analizidir. I-SceI ekspresyonu konstitütif olarak, ısı şoku aracılığıyla veya diğer promotörler altında indüklenebilir; bu da dokuya veya gelişime özgü onarımların incelenmesine olanak tanır. Analizin temel bir avantajı, homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) ve tek zincir tavlaması (SSA) içeren onarım sonuçlarını ayırt edebilmesidir. Bu makale, premeiyotik germ hattında DSB'lerin indüklenmesi ve progeny skorlaması yoluyla onarım olaylarının fenotipik olarak analiz edilmesine yönelik adım adım bir iş akışı da dahil olmak üzere, yerleşik DR-white analizi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ayrıca, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), dizileme ve Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) R betiği ile onarım olaylarının moleküler analizini açıklamaktadır. Bu protokol, bir organizma modelinde DNA onarımının genetik ve moleküler mekanizmalarını araştırmak için kullanışlı bir araç sağlamaktadır.

Drosophila homolog rekombinasyon yoluyla onarım için Rad51 gereksinimi
Başarılı germ hattı deneyleri, Şekil 3A'da gösterilen beklenen fenotipik sınıfları ve şişe başına en az 20 puanlanabilir döl verir. Beklenmedik fenotipler veya 20'den az puanlanabilir döl, kontaminasyonu veya yetersiz üretkenliği gösterir ve adım 1.4.3'te belirtildiği gibi hariç tutulmalıdır. TIDE analizi için başarılı örnekler, yaklaşık 1.7 kb boyutunda bir amplikon ve kırılma bölgesinden önce düşük arka plan gürültüsüne sahip kromatogramlar üretir; düşük verimli veya kontamine DNA ile gürültülü kromatogramlar suboptimaldir ve analiz edilmemelidir.
Isı şokuyla indüklenebilir I-SceI kaynağı kullanılarak DR-white deneyi yapıldığında, yabanıl tip sineklerde HR onarım sıklığı %38,5 ± 1,2'dir (ortalama ± SEM), buna karşın SSA yaklaşık %3,2 ± 0,35 oranında gerçekleşir (Şekil 3B&#160; ve Ek Dosya 4). Rad51 (Drosophila'daki homologu olan spnA tarafından kodlanır), homolog rekombinasyonun zincir istilası basamağı için gereklidir14,19. Bu nedenle, Rad51 kaybı verimsiz HR ile sonuçlanmalıdır. Nitekim, bir DmRad51-/- arka planında, HR onarımı %1,3 ± 0,4'e düşerken, eş zamanlı olarak SSA onarımında bir artış görülür (%34,5 ± 1,8; Şekil 3B&#160; ve Ek Dosya 4)14. Bu durum, büyük olasılıkla homolog rekombinasyona yönelen onarım olaylarının, alternatif olarak white tekrar dizilerinin tek zincirli tavlaması (single-strand annealing) ile onarılmasından kaynaklanmaktadır.
Drosophila CtIP'in somatik dokularda etkili HR onarımına katkısı
TIDE algoritması, somatik hücrelerde onarım yolu seçiminin ölçülmesine olanak tanır. Mutant olmayan bir arka planda, saptanabilir onarım olaylarının %59,0'ında işlemli NHEJ, %41,0'ında ise HR meydana gelir (Şekil 4B&#160;ve Ek Dosya 4). CtIP, DNA uç rezeksiyonunu teşvik ederek HR onarımının başlatılmasında önemli bir rol oynar20. Buna bağlı olarak, DmCtIP-/- arka planında, somatik hücrelerde HR yolu seçimi, heterozigot kontrollerdeki %41,0'dan homozigot mutantlardaki %10,9'a belirgin şekilde düşer (Şekil 4B ve Ek Dosya 4)16. Bu durum, Drosophila'da CtIP'in HR onarımına katkıda bulunduğunu ancak bunun için temel bir gereklilik olmadığını göstermektedir.
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Şekil 1: DR-white DSB reporter deneyi ve onarım sonuçları. Direct Repeat of white deneyi, white geninin iki işlevsiz kopyasını içerir: Sce.white (I-SceI tanıma bölgesini içeren ve erken bir stop kodonu getiren 23-bp'lik bir insersiyona sahip) ve iwhite (5′- ve 3′- uçları kesilmiş donör dizisi). DR-white ve bir I-SceI transgeni taşıyan sineklerin çaprazlanması, fenotipik veya moleküler olarak analiz edilebilen bölgeye özgü bir DSB oluşturur. Ortaya çıkan fenotipler şunlardır: (A) beyaz gözlü döller (y+ w−), DSB, kardeş kromatitler arası HR veya NHEJ olmadığını gösterir; (B) kırmızı gözlü döller (y+ w+), iwhite donöründen vahşi tip SacI dizisini restore eden intronkromozomal HR'yi gösterir; ve (C) sarı gövdeli, beyaz gözlü döller (y− w−), SSA veya mitotik CO'yu gösterir. Şekil Do ve ark. çalışmasından uyarlanmıştır14. Kısaltmalar: CO = crossover; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = çift zincir kırığı; HR = homolog rekombinasyon; NHEJ = homolog olmayan uç birleşmesi; SSA = tek zincir tavlama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Şekil 2: DR-white analizinin türevleri. (A) DR-white.mu analizi, iwhite.mu donör dizisinde 28 sessiz SNP içerir ve doğrudan tekrarlar arasında %1,4 dizi farklılığı oluşturur. Münferit polimorfizmlerin gen dönüşümü HR olayları arasında farklılık gösterir ve sekanslama ile belirlenebilir. (B) iwhiteΔ9 donörlü DR-white, homologlar arası rekombinasyonu kromozom içi rekombinasyondan ayırır. Kromozom içi iwhite donöründen kaynaklanan HR, yabani tip SacI dizisini geri yükler ve kırmızı gözlü döl üretir. Homologlar arası iwhiteΔ9 donöründen kaynaklanan HR, 9-bp delesyon white ekspresyonunu azalttığı için turuncu gözlü döl üretir. Şekil Do ve ark.14 ve Fernandez ve ark.15 çalışmalarından uyarlanmıştır. Kısaltmalar: DSB = çift zincir kırılması; HR = homolog rekombinasyon; SNP = tek nükleotid polimorfizmi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Şekil 3: Premeiyotik germ hattında DSB onarım sonuçlarının saptanması için deneysel iş akışı. (A) Çaprazlama 1, DR-white raporlayıcısını (veya bir türevini) bir I-SceI transgeni ile (bu örnekte, ikinci kromozom üzerinde) birleştirir. Hem DR-white testi hem de I-SceI transgenini içeren döl, germ hattı ve somatik dokularında onarım olaylarını sürdürür. Premeiyotik germ hattındaki bireysel onarım olaylarını analiz etmek için, her iki transgeni de taşıyan döl y w test sinekleri ile çaprazlanır (Çaprazlama 2) ve döl, Şekil 1'de açıklandığı gibi değerlendirilir. (B) Yabani tip sineklerde (n = 106 germ hattı) ve DmRad51 homozigot mutantlarda (n = 46 germ hattı) bireysel germ hattı DSB onarım olayları. **P &#60; 0.01; ****P &#60; 0.0001, iki yönlü ANOVA ve ardından Sidak çoklu karşılaştırma testi ile belirlenmiştir. Çubuklar ortalamaları; hata çubukları SEM değerini temsil eder. Veriler Do ve ark.14 çalışmasından yeniden analiz edilmiştir. Kısaltmalar: ANOVA = varyans analizi; CO = crossover; DSB = çift zincir kırığı; HR = homolog rekombinasyon; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; SEM = ortalamanın standart hatası; SSA = tek zincir tavlanması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Şekil 4: Tracking of Indels by DEcomposition yöntemi kullanılarak DSB onarım sonuçlarının tespitine yönelik deneysel iş akışı. (A) DR-white ve indüklenmiş bir I-SceI transgeni taşıyan sinekler; gDNA ekstraksiyonu, DSB bölgesi boyunca PCR amplifikasyonu, Sanger sekanslama ve R betiği ile TIDE analizi yoluyla analiz edilir. (B) DmCtIP-/-&#160;mutantlarından (n = 23) ve DmCtIP+/-&#160;heterozigot kontrollerden (n = 31) elde edilen temsili veriler. Tespit edilebilir onarım olayları, DSB yok/indel içermeyen NHEJ hariç tutularak, HR ile işlem görmüş NHEJ toplamı olarak hesaplanır. ****İki yönlü ANOVA ve ardından uygulanan Sidak çoklu karşılaştırma testi ile P &#60; 0.0001. Çubuklar ortalamaları; hata çubukları SEM'i temsil eder. Veriler Thomas et al.16 çalışmasından yeniden analiz edilmiştir. Kısaltmalar: ANOVA = varyans analizi; DSB = çift zincir kırılması; gDNA = genomik DNA; HR = homolog rekombinasyon; NHEJ = homolog olmayan uç birleşmesi; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; SEM = ortalamanın standart hatası; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: DSB-olmayan bir kontrole kıyasla sekans kromatogramlarındaki insersiyon ve delesyonları tanımlamak için TIDE R betiği. Kullanıcı tarafından düzenlenebilir kontrol dosya adı, örnek dosya adları ve I-SceI hedef sekansı betiğin sonuna yakın kısımlarda işaretlenmiştir. Gerekli girdiler, çıktı dosyaları ve yorumlama bölüm 2.3'te açıklanmıştır. sangerseqR ve Biostrings paketleri gereklidir.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: TIDE R betiği iş akışının adım adım ekran görüntüsü kılavuzu. Paneller, bölüm 2.3'te açıklanan yazılım işlemlerini göstermektedir.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: Örnek TIDE çıktısı ve onarım olayı hesaplamaları. 0-indel değeri, DSB olmadığını veya indel içermeyen NHEJ'i temsil eder; ayrı HR satırı, kanonik 23-bp delesyon ürününü temsil eder ve geri kalan tüm indel yüzdeleri, işleme tabi NHEJ olarak toplanır. Toplam saptanabilir onarım, HR ile işleme tabi NHEJ'in toplamı olarak hesaplanır.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: Şekil 3B ve Şekil 4B'nin temelini oluşturan ham veriler, ayrı düzenlenebilir çalışma sayfalarında düzenlenmiştir. Bu veriler, ilgili şekil açıklamalarında atıfta bulunulan daha önce yayınlanmış çalışmalardan yeniden analiz edilmiştir.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

DR-white analizi, çok hücreli bir organizma olan Drosophila melanogaster'de DNA çift zincir kırığı onarım sonuçlarını tespit etmek için kullanılan çok yönlü bir genetik raporlayıcı analizidir.

Drosophila melanogaster'da DR-white Analizi Kullanarak DNA Çift Zincir Kırığı Onarımının Ölçülmesi

DNA çift zincir kırığı (DSB) onarımı üzerine yapılan geleneksel çalışmalar, sıklıkla biyokimyasal incelemelerle veya tek hücreli sistemlerle (örneğin hücreler, ...

Laboratuvarımız, hücrelerin DNA çift zincir kırıklarını nasıl onardığına odaklanarak genom bütünlüğü alanı ile ilgilenmektedir. Diğer DNA onarım analizlerinden farklı olarak, Drosophila DR- white analizi, somatik ve germ hattı hücreleri dahil olmak üzere çok hücreli bağlamlarda çift zincir kırığı onarımını ölçer.Genetik çaprazlamalar ve çift zincir kırılması indüksiyonu tamamlandıktan sonra, test çaprazlaması progenilerinin çıkmasına izin verin. İlk sinekler ortaya çıktığında başlayarak, progenileri yaklaşık dokuz gün boyunca skorlayın. Sinekleri karbondioksit kullanarak anestezi edin veya sinekleri yiyecek bulunmayan boş bir viyale aktarıp en az 30 dakika boyunca -20 °C'de dondurun. Sinekleri bir sinek pedinin üzerine yerleştirin. Skorlama yapmak için, RFP floresansı kullanarak white'ın doğrudan tekrarını veya DR-white kasetini taşıyan sinekleri belirleyin. Göz ve vücut renklerini skorlayın. DR-white kasetine bağlı y-plus transgeni, tamamen yaban tipinde olmayan orta derecede kahverengi bir vücut rengi oluşturur. Çift zincir kırılmaması veya homolog olmayan uç birleşmesini, tek zincir tavlamasından ayırt etmek için bu sinekleri, DR-white kromozomundan yoksun olan RFP-negatif sarı beyaz progenilerle karşılaştırın. Daha koyu, daha kahverengi vücutlu sinekleri çift zincir kırılması yok veya homolog olmayan uç birleşmesi olarak sınıflandırın. Veri setine yalnızca en az 20 skorlanmış sinek içeren viyalleri dahil edin.Onarım olaylarının moleküler analizi için, Cross 1 progenisinde olduğu gibi hem DR- white hem de I-SceI transgenlerini taşıyan ısı şoku uygulanmış sinekleri toplayın. Tekil sinekleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin ve örnekleri kuru buz ve etanol banyosunda hızlıca dondurun. Her bir örneği, elektrikli bir homojenizatör kullanarak 50 µL tampon A içerisinde homojenize edin. Ardından, örnekleri 65 °C'lik su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Her örneğe 100 µL tampon B ekleyin ve tüpleri ters çevirerek kısa süreli karıştırın. Örnekleri buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin, ardından 4 °C'de yaklaşık 16.000 g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Herhangi bir çökelekten kaçınarak, berrak süpernatantın 125 µL'sini yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 100 µL izopropanol ekleyin ve tüpü ters çevirerek kısa süreli karıştırın. Örnekleri oda sıcaklığında yaklaşık 16.000 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. DNA peletini bozmamaya dikkat ederek süpernatantı aspire edin. Peleti 250 µL buz soğukluğundaki %70 etanol ile yıkayın ve tüpü ters çevirerek nazikçe karıştırın. Örnekleri 4 °C'de yaklaşık 16.000 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı tekrar aspire edin. Peletin aşırı kurumaması için residual etanolün buharlaşması amacıyla tüpün kapağını açık bırakarak oda sıcaklığında bekletin. Ardından, 20 µL nükleaz içermeyen su ekleyin ve peletin 4 °C'de gece boyunca yeniden çözünmesine izin verin. Ertesi gün, karıştırmak için tüpe nazikçe vurun ve DNA konsantrasyonunu ölçün.100 nanogram genomik DNA ve DR- white ileri ve geri primerlerini kullanarak PCR ile Sce.white bölgesini amplifiye edin. I-SceI transgenini taşımayan bir DR- white kontrol sineğinden alınan genomik DNA'yı ekleyin ve ardından uygun döngü koşullarını kullanarak reaksiyonu gerçekleştirin. Sce.white amplifikasyonunu doğrulamak için PCR ürününün yaklaşık 2 mikrolitresini %1'lik Tris-asetat-EDTA jelinde yürütün. Amplikonun yaklaşık 1,7 kilobaz olduğunu doğrulayın ve ardından Sce.white amplikonlarını saflaştırın. DNA konsantrasyonunu ölçün ve saflaştırılmış PCR ürününü DR- white sekanslama primeri kullanarak sekanslayın.Gerekli R paketlerini indirdikten sonra sekans kromatogramlarını inceleyin ve analiz için yalnızca kırılma bölgesinden önce arka plan gürültüsü az olan veya hiç olmayanları seçin. .ab1 uzantılı sekans iz dosyalarını indirin. Bunların tamamını tek bir bilgisayar klasörüne yerleştirin ve sekans dosya isimlerini mümkün olduğunca sadeleştirin. RStudio entegre geliştirme ortamında Tracking of Indels by DEcomposition veya TIED R betiğini açın. Kaynak panelinde control ile başlayan satırı bulun ve kontrol sekans dosya adını, uzantısı dahil olmak üzere tırnak içinde tam olarak kaydedildiği şekilde girin. sample name ile başlayan satırı bulun ve her bir örnek sekans dosya adını parantez içine, her dosya adını ayrı tırnaklar içine alarak ve aralarına virgül koyarak girin. Ardından, düzenlenmiş TIED R betiğini analiz edilecek sekanslarla aynı klasöre kaydedin. Entegre geliştirme ortamında, çıktı panelindeki Files sekmesini kullanarak TIED klasörüne gidin. More açılır menüsüne tıklayın ve Open New Terminal Here seçeneğini belirleyin. Yeni açılan terminale R yazıp Enter tuşuna basın. R çalışmaya başladığında, source komutunu betik dosya adıyla birlikte yazarak TIED R betiğini çalıştırın ve Enter tuşuna basın. Betik, grafiksel bir gösterim ve her örnek için ham verileri içeren virgülle ayrılmış değerler dosyası oluşturur. Her bir virgülle ayrılmış değerler dosyasını açın ve ham verileri örnek sekanstaki indel oranları olarak yorumlayın. Son olarak, çıktının alt kısmında ayrı olarak bildirilen kanonik 23 baz çiftlik delesyonu homolog rekombinasyon değeri olarak tanımlayın. 0 indel değerini, çift zincir kırılması olmadığı veya indelsiz non-homolog uç birleşmesi olduğu şeklinde yorumlayın ve işlem görmüş non-homolog uç birleşmesini belirlemek için kalan indel değerlerini toplayın.Başarılı germ hattı deneyleri, beklenen fenotipik sınıfları ve flakon başına en az 20 değerlendirilebilir döl sağlamıştır. Isı şokuyla indüklenebilir I-SceI eksprese eden yaban tip sineklerde, homolog rekombinasyon dölün yaklaşık %38,5'inde gerçekleşmişken; tek zincir tavlanması için bu oran %3,2 olmuştur. DmRad51 homozigot mutant arka planında, homolog rekombinasyon onarımı yaklaşık %1,3'e düşmüş ve buna paralel olarak tek zincir tavlanması onarımı yaklaşık %34,5'e yükselmiştir. Mutant olmayan bir arka plana sahip somatik hücrelerde, işlemlemeli homolog olmayan uç birleştirme tespit edilebilir onarım olaylarının yaklaşık %59'unu, homolog rekombinasyon ise %41'ini oluşturmuştur. DmCtIP homozigot mutant arka planında, homolog rekombinasyon yolak seçimi %10,9'a düşmüştür.Bu protokol, onarımı etkileyen faktörleri belirlemek amacıyla çeşitli dokulara, gelişim evrelerine ve genomik konumlara uygulanabilir. Ayrıca, bu analiz gen dönüşüm iz uzunlukları ve onarım şablonu tercihi gibi onarım sonuçlarını ölçmek için modifiye edilmiştir. Bu DNA onarım analizi, Drosophila'daki genetik mutantlar kullanılarak onarıma dahil olan çeşitli faktörlerin belirlenmesinde kullanılabilir.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Bu videoda, insan mononükleer hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılma bölgelerinde lokalize olan spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini tespit etmek için immünofloresan mikroskopi tekniğini açıklıyoruz. Proteinler, spesifik birincil antikorlar tarafından tanınır ve bu antikorlar, mikroskobik görselleştirme sırasında floresan olan florofor etiketli ikincil antikorlara bağlanır ve proteinlerin hücre çekirdeği içinde farklı floresan odaklar olarak görselleştirilmesini sağlar.

DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Bu protokol, Drosophila'nın embriyodan yetişkine kadar her gelişim aşamasındaki canlılığını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yöntem, farklı genotiplerin veya büyüme koşullarının canlılığını belirlemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

Kan-beyin bariyerbütünlüğü sinir sistemi fonksiyonu için çok önemlidir. Drosophila melanogasterolarak, kan-beyin bariyeri geç embriyogenez sırasında glial hücreler tarafından oluşur. Bu protokol, D. melanogaster embriyolarında ve üçüncü instar larvalarında kan-beyin bariyeri oluşumu ve bakımı için taht yöntemlerini açıklamaktadır.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Öğrenin Drosophila melanogaster'da DR-white analizi ile DNA çift zincir kırığı onarımını ölçme yöntemini. Bu protokol homolog rekombinasyon, NHEJ ve SSA yollarını ayırt ederek çok hücreli organizmalarda onarım mekanizmalarını incelemenizi sağlar.

Drosophila melanogaster'da DR-white Analizi Kullanarak DNA Çift Zincir Kırığı Onarımının Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet