In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

İn vivo olarak, teratom oluşumu, bir hücrenin pluripotentliğini veya üç germ katmanını da oluşturma yeteneğini belirlemek için altın standarttır. Teratomlar da kök hücre nakli için büyük bir engeldir ve şu anda büyüme kinetiğindeki oluşumları hakkında çok az şey bilinmektedir. Farklılaşmamış hücreler konakçı ortama implante edildikten sonra, biyolüminesan raportör, gen transdüksiyonu ve ultra hassas yük bağlantılı cihaz veya CCD fotoğrafçılığının geliştirilmesi, hücre yeri göçünün, proliferasyonunun ve farklılaşmasının in vivo olarak invaziv olmayan tekrarlayan değerlendirmesini mümkün kılmıştır.

Bu videoda, canlı bir farede nakledilen insan embriyonik kök hücre çoğalmasını etkili bir şekilde izlemek için ayrıntılı bir protokol göstereceğiz. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Tıp ve Radyoloji Bölümleri'nde Joseph Wu'nun laboratuvarından Kit Wilson. Bugün size insan embriyonik kök hücrelerini hem in vitro hem de canlı bir fareye nakledildikten sonra görüntüleme prosedürlerini göstereceğiz.

Bu prosedürler aşağıdaki adımları içerir: insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro biyolüminesans görüntülemesi, fare hazırlığı ve in vivo görüntüleme için kök hücre enjeksiyonu in vivo görüntüleme ve nakledilen hücrelerin in vivo biyolüminesans görüntülemesi. Öyleyse, bu prosedürlerin bazı temel bileşenlerini gözden geçirerek başlayalım. İnsan embriyonik kök hücrelerinin biyolüminesans görüntülemesini gerçekleştirmek için, öncelikle ubiquitin veya eef bir alfa kültürü gibi kurucu bir promotör tarafından yönlendirilen ateşböceği lusiferaz gibi EL lusiferaz raportör genlerini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler elde etmeniz gerekir, EL Luciferase pozitif insan embriyonik kök hücreleriniz besleyici serbest koşullarda.

Tipik olarak standart Y hücresi protokolünü takip ederiz ve durum ortamı veya ticari besleyici içermeyen ortam kullanılarak matrigel ile kaplanmış altı kuyucuklu plaka kullanırız. Lusiferaz pozitif hücreleri tespit etmek için, bunu yapmak için zaten hazırlanmış olan muhabirin d Lucifer araştırmasına sahip olmanız gerekir. Aliquot Lucifer, mililitre başına 45 miligramlık bir nihai konsantrasyonda bir ila 1.5 mililitre preparatlarda.

Alikotları kullanılmadığı zaman eksi 20 santigrat derecede tutun ve depolamada değilken kağıt havluyla örterek ışığa maruz kalmaktan kaçının. Lusiferaz pozitif hücreleri görselleştirmek için iki farklı görüntüleme sistemi kullanacağız. İn vitro prosedür için steril bir görüntü sistemi olan Xeno IVUS 50'yi kullanacağız ve in vivo için Xeno IVUS 200'ü kullanmak üzere in vivo görüntüleme için Stanford Center'a gideceğiz.

Bu sistem, küçük hayvanların geçici anestezisi için entegre bir lorrine aparatı ve indüksiyon odası içerir. Tamam, kendime sahibim. İn vitro biyolüminesans görüntülemeye geçelim.

İn vitro biyolüminesans görüntüleme için steril koşulların korunması önemlidir. Bu nedenle, görüntüleme sistemi steril olmalı, tercihen bir hücre kültürü odasında olmalıdır. Görüntülemeden önce, hücre ortamını çıkarın ve hücreleri kaplayacak kadar PBS ekleyin.

Örneğin, insan embriyonik kök hücre kültürlerinizi içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre PBS ekleyin. Derin'in PBS'ye oranı bire 100 olmalıdır. Bu nedenle, altı kuyulu plakanın her bir oyuğuna 10 mikrolitre derin çözülme ekleyin.

Kültürlerinize eklemeden önce derinleri filtrelemeyi unutmayın. Bir dakika bekledikten sonra plakayı hazneye yerleştirin, ardından 10 saniyelik pozlama süresini kullanarak bir görüntü çekin, pozlama süresini ayarlayın. Sinyal doymuş veya çok zayıfsa, biyolüminesans sinyali hücre numarasını yansıtır, bu nedenle sinyali farklı hücre numaralarıyla ilişkilendiren kantitasyon testleri yapılabilir.

Bunlar, tipik bir kantitasyon testinden alınan görüntülerdir. Sol üstte, bazı insan embriyonik kök hücre kolonilerinin parlak bir alanı var. Bu hücrelerin muhabir genimizi taşıdığını biliyoruz çünkü aslında yeşil renkte floresan veriyorlar.

Mavi rengi sıralamak zarif bir lekelemedir. Alt panel, artan sayıda hücreye sahip kültürel kuyuları göstermektedir. Hücre sayıları, bu grafikte görüldüğü gibi biyolüminesans sinyali ile ilişkilidir.

Bu korelasyon bize in vivo hücre proliferasyonunu izlemek için yarı kantitatif bir test verir. Tamam, bu in vitro prosedür. Şimdi in vivo biyolüminesans görüntülemeye geçelim.

Teratom oluşumunu in vivo olarak görüntülemek için, ateşböceği lusiferaz raportör genini ifade eden insan embriyonik kök hücrelerimizi bir kızak faresinin arkasına enjekte edeceğiz ve IVU sistemi ile biyolüminesan görüntüler alacağız. Hücreleri nakletmeye hazır olduğunuzda, hücreleri gevşetmek için disk alanı veya kollajenaz kullanın, birkaç kez yıkayın ve bire bir büyüme faktörü, azaltılmış matrigel ve dmm karışımı içinde askıya alın. Tipik olarak, önce hücreleri soğutulmuş DMM ile karıştırırız ve ardından matrigel ekleriz.

Her deri altı bölgesi için, matrigel DMM karışımının 50 ila 100 mikrolitre hacminde asılı 200.000 hücre enjekte ediyoruz. Hücre numarası, uygulamanıza bağlı olarak ayarlanabilir. Enjeksiyondan önce her şeyi buz üzerinde tutmayı unutmayın.

Hücreler hazır olduğunda, fareyi indüksiyon kutusuna yerleştirerek uyuşturuyoruz. İzo flor akışı açıkken. Yaklaşık bir dakika sonra, fare uyuşturulur ve sürekli iso flor ile ameliyat masasına yerleştirilebilir.

Doğal olarak otomatik floresanlar ve biyolüminesan görüntüyü gizleyebileceğinden, farenin arka tarafındaki tüyleri çıkarmamız gerekecek. Bunu yapmanın en kolay yolu elektrikli tıraş makinesi kullanmaktır, ancak daha sonra cildi sterilize etmek için epilasyon jelleri kullanabilir, alkolle silebilirsiniz. Daha sonra, 23 ila 27 gauge iğneli bir şırıngada yüz mikrolitrelik hücre süspansiyonu hazırlayın, çünkü hücrelerle tıkanmazlar.

Şimdi, deri altındaki hücreleri farenin sırtına enjekte edin çünkü cilt oldukça gevşektir. Enjekte etmek istediğiniz alanı sıkıştırmak ve germek için baş parmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın. Çok derinden delmemeye dikkat ederek derinin hemen altına enjekte edin.

Ayrıca, pistona bastırırken iğnenin enjeksiyon bölgesinden kaymasını önlemeye çalışın. Bu, ciltte hücrelerin sızabileceği bir delik oluşmasını önleyecektir. Hücreler enjekte edildikten sonra tekrar enjekte etmeye çalışırsanız, farenin tekrar uyutmadan önce uyanmasına ve etrafta koşmasına izin vermek için birkaç saat bekleyin.

Biyolüminesans görüntüleme için, bunu yapmak izofluran toksisitesini önler. Tamam, şimdi enjekte edilen hücrelerin in vivo biyolüminesans görüntülemesine devam etmeye hazırız. Aşağıdaki görüntüleme çalışmaları için, tüm hayvan biyolüminesans görüntülemesi için bir teratom oluşumunu göstermeye başlamış bir fare kullanacağız.

Vücut ağırlığının kilogramı başına 375 miligramda intraperitoneal Lucifer enjeksiyonu yapıyoruz. Bu nedenle, dozu hesaplamak için anestezi uygulanmış hayvanı tartmamız, deed lucifer'i orta hattın hemen dışında karın zarına enjekte etmemiz, iğneyi geri çekmemiz ve kan olmadığından emin olmamız gerekir, bu da bir iç organda hasar gördüğünün bir göstergesi olacaktır. Fare uyanmaya başlarsa, indüksiyon odasına geri koyun ve bir veya iki dakika bekleyin.

İnsan embriyonik kök hücreleri tarafından yayılmayan ışığı emmeye yardımcı olmak için görüntüleme kutusuna mat siyah kağıt yerleştirerek görüntülemeye hazırlanın. Fareler için, maksimum biyolüminesans sinyali genellikle enjeksiyondan 15 ila 40 dakika sonra ortaya çıkar. Bu nedenle, 10 ila 15 dakika sonra, fareyi arka yüzü yukarı bakacak şekilde iso flor içeren görüntüleme odasına yerleştirin.

10 pozlama süresiyle başlayın. Sinyal doygunsa, maruz kalma süresini azaltmayı deneyin. Çok zayıfsa, pozlamayı artırın.

Sinyale maruz kalma süresi fareniz için optimize edildikten sonra, sinyal maksimuma ulaşana kadar her dakika görüntü çekmeye başlayın. Bu en iyi şekilde, enjeksiyon bölgelerinizi kapsayan ilgi alanlarını seçmek için görüntüleme yazılımını kullanarak yapılır. İlgilenilen her bölgedeki sinyal yoğunluğunu izleyerek, sinyalin ne zaman azalmaya başladığını kolayca belirleyebilir ve bu da maksimum sinyal yoğunluğuna ulaşıldığını gösterir.

Maksimum civarında meydana gelen üç ardışık görüntünün ortalamasını alıyoruz ve bunu nihai değerimiz olarak kullanıyoruz. Resimlerinizden memnun kaldığınızda, fareyi flordan çıkarın ve kafesinde uyanmasına izin verin. Genellikle fare 15 dakika içinde uyanmalıdır.

İstenilen zaman seyrinden sonra biyolüminesans görüntüleri elde edilir. Hayvan, histoloji için kullanılan doku kesitlerinde kurban edilebilir. Tamam, artık in vivo görüntüleme prosedürleriyle işimiz bittiğine göre, sonuçlarımıza daha yakından bakabilir ve ayrıca laboratuvarımızdan önceki bazı çalışmalara da bakabiliriz.

İşte deri altı teratomlu üç farenin biyolüminesans görüntüsü. Biyolüminesans sinyal verileri, görüntüleme yazılımı tarafından bizim için otomatik olarak yapılan farelerin siyah beyaz bir fotoğrafının üzerine yerleştirilmiştir. Bu, ateşböceği lusiferaz ile mümkün olan uzunlamasına görüntüleme türüne bir örnektir.

Bu durumda, ilk enjeksiyondan sonra insan embriyonik kök hücrelerini doğrudan kalbe enjekte ettik. Çoğu hücre, kalp üzerindeki biyolüminesansta bir azalma ile gösterildiği gibi bir sonraki hafta boyunca ölür. Siyah oka dikkat edin.

Transplantasyondan kurtulan insan embriyonik kök hücreleri, nihayetinde kalpte, yaklaşık 14. günden başlayarak hızla artan bir sinyal olarak görselleştirilebilen bir teratom oluşturur. Yedinci günde, insan embriyonik kök hücrelerinin karın içine ekstra kardiyak sızıntısını gösteren kırmızı okla gösterilen ikinci bir biyolüminesans bölgesi olduğunu fark edeceksiniz. Bu çok yaygındır.

Hem in vitro hem de canlı bir fareye transplantasyondan sonra bir lusiferaz raportör genini kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücrelerinin biyolüminesans görüntülerini nasıl elde edeceğinizi gösterdik. Bu yöntem, hücre kantitasyonu için doğası gereği yanlış olabilecek histoloji için çok sayıda hayvanı feda etmeye gerek kalmadan hücre proliferasyonunun tekrar tekrar görüntülenmesine ve izlenmesine izin verir. Bu prosedürü bir farede yaparken, doğru delucci konsantrasyonunu kullanmayı unutmamak ve çok uzun pozlama aralıklarıyla biyolüminesans görüntüsünün doygunluğundan kaçınmak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.