Name: In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-02T17:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Keşfedin, insan embriyonik kök hücrelerinin biyoparlaklık görüntüleme ile canlı fare modelinde izlenmesi yöntemini. Bu protokol, hücre davranışlarını invaziv olmayan şekilde değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tim Doyle, Doktora ve Stanford biyoparlaklık görüntüleme ile yardım için Vivo Görüntüleme Merkezi sayesinde. Ayrıca matris çözümü ile kök hücre ko-enjeksiyon tekniği paylaşmak için Ngan Huang, doktora teşekkür eder. Son olarak, Steve sayesinde Keçe, Doktora veterinerlik hayvan bakımı ile ilgili yardım için.

<ol><li> Double Fusion Reporter Gen İnşaatı <ol><li> Insan embriyonik kök hücreleri biyoparlaklık görüntüleme gerçekleştirmek için, ilk stably ateşböceği lusiferaz Ubiquitin veya EF1a gibi bir kurucu organizatörü tarafından tahrik gibi bir lusiferaz muhabiri gen ifade hücreleri elde etmek için gerekir. </li><li> Bu protokolün odak muhabiri gen uygulamaları, ayrıntılı yordamlar burada verilmez. Ancak, bizim laboratuvar genel stratejisi ateşböceği lusiferaz (fluc) ve pCDNA 3.1 içinde bir boşluk + ayrılmış gelişmiş yeşil flüoresan protein (egfp) içeren bir çift füzyon inşa vektör kullanmaktır. </li><li> Kısaca, çift füzyon geninin ilk pCDNA 3.1 sitomegalovirüs organizatörü (+) akış aşağısında bulunan, bu yüzden 3.3 kbç parçası bir öz-inaktive (SIN çoklu klonlama siteye bağlandı NdeI ve Noti sindirim ve künt uç kullanılarak eksize edildi Ubiquitin promotör kontrolü altında) lentiviral vektör. </li></ol></li><li> Lentiviral İletimi <ol><li> hESC 10 enfeksiyon bir çokluk (İçişleri Bakanlığı) (106 hücreleri ile inkübe yaklaşık 107 viral titresi) 3-5 gün geçtikten sonra transduced olabilir. </li><li> Çözülmüş viral stok taze hESC medya doğrudan eklenebilir. </li><li> Medya 12 ve 24 saat sonra yenileyin. </li><li> 48 saat sonra, transdüksiyon verimliliği niteliksel floresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra, FACS enfekte hücreleri izole etmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Kültürleme hESC ve Set-up Görüntüleme için giriş <ol><li> Kültür lusiferaz olumlu hESC besleyici özgür koşullar. Biz genellikle standart WiCell protokolü takip ve klimalı ortam veya ticari ya Matrigel azalır büyüme faktörü kaplı 6-kuyucuğu, besleyici ücretsiz medya kullanın. </li><li> Lusiferaz pozitif hücrelerin saptamak için, muhabir prob D-luciferase şimdiden hazırlıklı olması gerekir. 1-1.5 mL hazırlıklarında son bir 45 mg / ml konsantrasyonda bu kısım luciferase yapmak için. -20 ° C&#39;de alikotları depolama zaman kağıt havlu ile kaplayarak kullanmak ve ışığa maruz kalmasını önlemek. </li><li> Lusiferaz pozitif hücrelerin görselleştirmek için, biz IVIS 50 ve IVIS 200 Görüntüleme Sistemleri (Xenogen Corporation, Alameda, CA) kullanın. Bu ikinci sistem, küçük hayvanlar geçici anestezi için entegre bir isoflourane cihaz ve indüksiyon odası içerir. </li></ol></li><li> HESC in vitro biyoparlaklık görüntüleme <ol><li> In vitro biyoparlaklık görüntüleme için, steril koşullarda muhafaza etmek önemlidir. Bu nedenle, görüntüleme sistemi, tercihen bir hücre kültürü odada, steril olmalıdır. </li><li> Görüntüleme önce, hücre medyayı çıkartın ve hücreleri kapsayacak şekilde yeterli PBS ekleyin. Örneğin, her bir kuyunun hESC kültürleri içeren 6-plaka 1ml PBS ekleyin. </li><li> D-luciferase PBS oranı 1:100 olmalıdır, bu nedenle 6 plaka her iyi çözülmüş D-luciferase 10 mcL ekleyin. </li><li> Bir dakika bekleyin, sonra 1 saniye pozlama süresi kullanarak bir görüntü alır. Sinyal zayıfsa, pozlama aralığı artırmak ve tekrar deneyin. </li><li> Bioluminescent sinyali hücre sayısı yansıtır, farklı hücre sayıları ile sinyal korele olduğu kantitatif testleri yapılabilir. </li></ol></li><li> In vivo görüntüleme için fare ve hücreleri enjekte hazırlanması <ol><li> Muhabir gen görüntüleme, günler, haftalar, ve hatta aylar boyunca transplantasyonu sonrası izleme hücreler için yüksek verimli, ucuz ve duyarlı bir yöntem sağlar. Nakledilen kök hücreler sık ​​teratom formu konağın bağışıklık sistemi tarafından reddedilir, ya da sadece ölmek bu yana bu özellikle önemlidir. </li><li> In vivo görüntüleme teratom oluşumu için basit yöntem, SCID farelere sırtında ateşböceği lusiferaz muhabiri gen ifade ve IVIS sistemi ile bioluminescent görüntüler elde hESC enjekte etmek. </li><li> Hücre nakli için hazır olduğunuzda, hücreler gevşetmek için birkaç kez yıkayın ve büyüme faktörü azaltılmış matrigel ve DMEM 1:1 karışımı askıya dispase veya kollajenaz kullanın. Genelde ilk soğutulmuş DMEM hücrelerin karışımı ve sonra matrigel ekleyin. Her subkutan enjeksiyon site için, biz matrigel / DMEM karışımı 50-100 ul hacmi askıya 200.000 hücreler enjekte edilir. Hücre sayısı Kullandığınız uygulamaya bağlı olarak ayarlanabilir. Enjeksiyondan önce buz üzerinde her şeyi tutmak için unutmayın. </li><li> Hücrelerin hazır edildikten sonra, açık izofluran akışı ile indüksiyon kutusuna koyarak fare uyutmak. 1-5 dakika sonra, fare uyuyor ve sürekli izofluran ile ameliyat masasına yerleştirilebilir. </li><li> Kürk doğal otomatik fluoresces ve bioluminescent görüntü gizleyebilir, çünkü biz farenin arka tarafında saç kaldırmak gerekir. Bunu yapmanın en kolay yolu, bir elektrikli tıraş makinesi kullanmak için, ama aynı zamanda saç kaldırılması jelleri kullanabilirsiniz. Sterilize etmek için alkol ile silin.Daha sonra deriyi </li><li> Sonra, bir şırınga hücre süspansiyonu çizin. Hücrelerle birlikte tıkamaz yılından bu yana 23 - 27 gauge iğne en iyi şekilde çalışır. Iğne çok büyükse (23 gauge) iğne yolu hücreleri geri sızıntı olabilir büyük bir delik bırakabilir. </li><li> Hücreler farenin arkasına deri altına enjekte edilir. Cildi oldukça gevşek olduğundan, çimdik, başparmak ve işaret parmağı kullanmak ve enjekte etmek istediğiniz bölgeyi germek. Ponksiyon çok derinden umurumda değil alarak, sadece deri altına enjekte edilir. Ayrıca, Medyumu sırasında enjeksiyon yerinde dışarı kayar iğne tutmaya çalışın: Bu cilt hücreleri tekrar enjekte etmeye çalışırsanız sızıntı olabilir bir delik oluştururken önleyecektir. </li><li> Hücreleri enjekte edildikten sonra, fare uyanmak için izin ve biyoparlaklık görüntüleme için yeniden anestezi önce çalıştırmak için bir kaç saat bekleyin. Bunu yapmak izofluran toksisite önler. </li></ol></li><li> Nakledilen hücrelerin in vivo biyoparlaklık görüntülemede <ol><li> Tüm hayvan biyoparlaklık görüntüleme için, D-luciferase intraperitoneal olarak 375 mg / kg vücut ağırlığı. Enjeksiyondan önce dozu hesaplamak için hayvan tartılır. </li><li> Sadece orta hat kapalı, periton D-luciferase enjekte edilir. Çok derin gitmek ya da iç organlara zarar verebilir dikkatli olun. Fare uyanmak başlarsa, nakavt kutusuna geri koyun ve bir ya da iki dakika bekleyin. Fareler için, maksimum biyoparlaklık genellikle enjeksiyondan sonra 15-40 dakika oluşur. </li><li> HESC tarafından yayılan herhangi bir ışık absorbe yardımcı olmak için mat siyah kağıt görüntüleme kutusunda yer unutmayın. Siyah kağıt üstünde, izofluran ile görüntüleme odasında fare (arka kadar) yerleştirin. 10 saniyelik bir pozlama süresi ile başlayın. Sinyal doymuş ise, pozlama süresini azaltmayı deneyin, çok zayıf, pozlama artırmak. </li><li> Farenizi sinyal maruz kalma süresi için optimize edildikten sonra, sinyal maksimum ulaşıncaya kadar görüntüler her dakika başlar. Bu en iyi enjeksiyon yerlerini gizlemeleri &quot;ilgi alanları&quot; (ROI) seçmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak yapılır. Her ROI sinyal yoğunluğu izleyerek kolayca maksimum sinyal yoğunluğu ulaşıldı belirten sinyal azalmaya başladığında belirleyebilirsiniz. Maksimum sinyal son veri olarak kullanılması gerekir. </li><li> Görüntüleri memnun olduğunuzda, izofluran fare kaldırmak ve onun kafes uyanmak için izin. Genellikle, fare, 15 dakika içinde uyanmak gerekir. </li><li> HESC hayvan hayatta Biyoparlaklık muhabiri gen görüntüleme sürece, günlük, haftalık ve aylık tekrar edilebilir. Gelişmekte olan bir teratom Sinyal hESC sayısı hızla artmaya başlar, genellikle hafta sipariş üzerine, zaman içinde katlanarak artacaktır. </li><li> Biyoparlaklık görüntülerin istenilen zaman içerisinde elde edildikten sonra, hayvan kurban ve histoloji için kullanılan doku kesitlerinde olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Passier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cardiomyocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures.</a> Stem Cells. 23, 772-780 (2003).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Baharvand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+a+defined+adherent+culture+conditi%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi.</a> Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> BMC Neurosci. 4, (2007).</li>
<li>Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Insulin-producing+Islet-like+Clusters+from+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 17, 17- (2007).</li>
<li>Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+hurdles+for+the+transplantation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+role+of+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).</li>
<li>Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging%3A+looking+at+problems%2C+seeing+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions.</a> Science. 302, 605-608 (2003).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature medicine. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Bhaumik, S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+Renilla+luciferase+reporter+gene+expression+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).</li>
<li>Tisi, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+thermostable+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Analyica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a thermostable firefly luciferase.</a> Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).</li>
<li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22.+Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Embryonic+Stem+Cell+Misbehavior+and+Suicide+Gene+Ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation.</a> Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+reporter+genes+for+molecular+imaging+of+transplanted+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells.</a> Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells%3A+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).</li>
<li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Level+Sustained+Transgene+Expression+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Using+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors.</a> Stem Cells. 21, 111-117 (2003).</li>
<li>Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+hematopoietic+cells+differentiated+from+human+embryonic+stem+cell-derived+CD45%28neg%29PFV+hemogenic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors.</a> Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem cells. 26, 119-126 (2008).</li>
<li>Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.</li>
</ol>

PET ve MRI gibi diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, biyoparlaklık sınırlı mekansal çözünürlükte ve nispeten zayıf fotonların enerji (2-3 eV) nedeniyle azalmış doku penetrasyonu; bu nedenden dolayı şimdiye kadar büyük hayvanlara uygulanabilir değil. Ancak, biyoparlaklık in vivo kök hücre küçük hayvanlar izleme için son derece cazip, düşük maliyetli, yüksek verim ve non-invaziv olma avantajına sahiptir. PET ve floresan yapıları gibi Sigara biyoparlaklık muhabiri genler lusiferaz ile birlikte, bireysel muhabiri genleri içeren farklı etki...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modifiye Eagle&amp;rsquo;s Besiyeri (DMEM)</td><td></td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&amp;#8482; Bazal Membran Matrisi</td><td>Büyüme faktörü azaltılmış (isteğe bağlı: fenol-kırmızısı içermeyen)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Embriyonik Kök Hücreleri için mTeSR1 Bakım Besiyeri</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Lusiferin Ateş Böceği, potasyum tuzu</td><td></td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td><td>30 mg Tip IV Kollajenaz'ı 30 mL DMEM-F12 besiyerinde çözün. Steril filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Pişirilmiş Pasteur pipetleri</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu doku kültürü işlemlemiş plakalar</td><td></td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ve in vivo biyoparlaklık reporter gen görüntüleme İnsan embriyonik kök hücreleri

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) keşif dramatik rejeneratif tıp ilgilenen tıp bilim adamları, mevcut araçları arttı. Ancak, canlı organizmaların içine hESC ayırt hESC ve hücrelerin doğrudan enjeksiyon şimdiye kadar önemli hücre ölümü, teratom oluşumu ve konağın bağışıklık ret engel olmuştur. Naklinden sonra in vivo hESC davranışı anlamak roman görüntüleme teknikleri boyuna hESC lokalizasyonu, proliferasyon ve canlılığı izlemek için gereklidir. Moleküler görüntüleme araştırmacılar, gün boyunca in vivo hücre çoğalması, haftalar ve hatta aylar izlemek için yüksek verimli, ucuz ve duyarlı bir araç vermiştir. Bu gelişme, uzay-zamansal hESC engraftman, yayılması ve yaşayan kişilerde teratom oluşumu kinetiği anlayışı önemli ölçüde artmıştır. Moleküler görüntüleme alanında önemli bir ilerleme noninvaziv raportör gen deneyleri, in vivo ve çok amaçlı görüntüleme platformlar moleküler ve hücre biyolojisi uzantısı olmuştur. Bu muhabir genler, konak hücre s transkripsiyonel makine yararlanmak mühendislik rehberleri ve arttırıcılar kontrolü altında, vektör ve vektörel olmayan yöntemleri kullanarak çeşitli hücre içine tanıtıldı. Muhabiri genler hücre kullanılan organizatörü türüne göre, biyolojik veya hücresel belirli şartlar altında ya yapısal ya da sadece transkripsiyonu olabilir. Biyoaktif proteinlerin içine muhabiri genlerin transkripsiyon ve tercümesi sonra D-luciferase gibi sinyal üreten problar kullanılarak hassas, noninvaziv enstrümantasyon (örneğin, CCD kamera) ile tespit edilir. Floresan görüntüleme için gerekli olan kök hücrelerin in vivo olarak izlemek için eksitatör ışık için ihtiyaç önlemek için, biyoparlaklık muhabiri gen görüntüleme sistemleri, ışık emisyon ikna etmek için sadece bir Eksojen olarak uygulanan prob gerektirir. Firefly lusiferaz, ateşböceği Photinus pyralis türetilen, optik olarak aktif metaboliti, oxyluciferin D-luciferase katalize bir enzim kodlar. Optik faaliyet, daha sonra harici bir CCD kamera ile takip edilebilir. Stabil muhabir taşıyan hücreler kendi kromozomal DNA&#39;da inşa transduced muhabiri hESC hayatta kalma ve in vivo çoğalması boyuna izlenmesi için izin kızı hücrelerinin DNA inşa geçecek. Ayrıca, muhabir gen ürünü ifade sinyal üretimi için gerekli olduğundan, tek uygun anne-baba ve kızı hücreleri biyoparlaklık sinyal yaratacak, apoptotik ya da ölü hücrelerden olmaz. Bu video, özel malzemeler ve biyoparlaklık görüntüleme izleme kök hücre çoğalması ve teratom oluşumu için gerekli yöntemler ele alınacaktır.

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

İnsan embriyonik kök hücrelerinin (hESK'ler) keşfi, rejeneratif tıp ile ilgilenen tıp bilimcilerinin erişebileceği araçları önemli ölçüde artırmıştır...

In vivo, teratom oluşumu, bir hücrenin pluripotensini veya her üç germ tabakasını da oluşturma yeteneğini belirlemek için altın standarttır. Teratomlar aynı zamanda kök hücre transplantasyonu için büyük bir engel teşkil etmektedir ve günümüzde bunların büyüme kinetiğindeki oluşumları hakkında çok az şey bilinmektedir. Diferansiye olmamış hücreler konakçı ortama implante edildikten sonra; biyolüminesans raporlayıcıların geliştirilmesi, gen transduksiyonu ve ultra-hassas şarj bağlı aygıt (CCD) fotoğrafçılığı, hücre yerleşimi, migrasyonu, proliferasyonu ve diferansiyasyonunun in vivo olarak invaziv olmayan şekilde tekrarlı değerlendirilmesine olanak sağlamıştır.Bu videoda, canlı bir farede transplant edilen insan embriyonik kök hücre proliferasyonunun etkili bir şekilde izlenmesine yönelik ayrıntılı bir protokolü göstereceğiz. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Tıp ve Radyoloji bölümlerindeki Joseph Wu laboratuvarından Kit Wilson. Bugün size, hem in vitro hem de canlı bir fareye transplantasyon sonrası insan embriyonik kök hücrelerin görüntülenmesi prosedürlerini göstereceğiz.Bu prosedürler, insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro biyolüminesans görüntülemesi, in vivo görüntüleme i

in-vitro-vivo-bioluminescence-reporter-gene-imaging-human-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

In vivo biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme (i) ve (ii) post mortem histolojik analiz: Bu makale ile kemirgen beyinde hücresel greft multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi anlatılmaktadır. Tek bir hayvan bu görüntüleme yöntemleri birleştirerek, yüksek çözünürlüklü, duyarlılık ve özgüllük ile hücresel greft değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Kaynak: Weber, R. Z., et al., Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İntraserebral Transplantasyon ve İn Vivo Biyolüminesans İzleme. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, bir fare beynine enjekte edilen genetik olarak değiştirilmiş insan nöral progenitör hücrelerinin in vivo biyolüminesans görüntüleme yöntemini göstermektedir. İşlem, lusiferin enjeksiyonu, görüntüleme hazırlığı ve enjeksiyon bölgesinde nakledilen hücrelerden biyolüminesan sinyallerin tespit edilmesini içerir.

Bir fare beyninde insan nöral progenitör hücrelerinin in vivo biyolüminesans görüntülemesi

Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Fare beyninde lusiferaz-yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden ikili muhabir bir vektör ile transdüke edilen insan nöral progenitör hücrelerinin intraparankimal transplantasyonunu tanımladık. Transplantasyondan sonra, lusiferaz sinyali, floresan mikroskobu kullanılarak beyin bölümlerinde tanımlanan in vivo biyolüminesans ve GFP eksprese eden aşılanmış hücreler kullanılarak tekrar tekrar ölçülür.

İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Keşfedin, insan embriyonik kök hücrelerinin biyoparlaklık görüntüleme ile canlı fare modelinde izlenmesi yöntemini. Bu protokol, hücre davranışlarını invaziv olmayan şekilde değerlendirmeyi sağlar.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Daha fazla video keşfet