Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Bireysel proteinlerin karmaşık protein karışımlarından ayrılması, poliakrilamid jel elektroforezi veya yaygın adıyla PAGE olarak bilinen jel elektroforezi ile gerçekleştirilebilir; proteinler, elektrik alanının etkisiyle jel matrisindeki gözenekler aracılığıyla hareket ederler. Jel gözenek boyutu ile proteinin yükü, boyutu ve şeklinin kombinasyonu, proteinin göç hızını belirler. Bu videoda, proteinlerin elektroforetik ayrımı için bir yöntemi göstereceğiz.

Merhaba, ben Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences Proteomik Merkezi'nden Dr. Bobul Chakravarti. Bugün sizlere 1D jel elektroforez uygulaması için bir prosedür göstereceğim. Haydi başlayalım.

Başlamak için, iki temiz cam plaka ve iki 1,5 millimeter ara parça kullanarak elektroforez cihazının cam plaka sandviçini üretici talimatlarına göre birleştirin. Ardından, cam plaka sandviçini döküm standına sabitleyin. Son olarak, güncel protokollerde açıklanan ayırıcı jel çözeltisini hazırlayın.

Belirtilen miktarda %10 amonyum persülfat ve TEMED'i çözeltiye ekleyin ve karıştırmak için nazikçe çalkalayın. Akrilamid konsantrasyonunun yüksek olması nedeniyle gaz giderme işlemine gerek yoktur. 10 mililitrelik tek kullanımlık plastik bir pipet kullanarak, ayırıcı jel çözeltisini, cam plakalar arasındaki çözelti yüksekliği yaklaşık 11 santimetre olana kadar, ayırıcıların birinin kenarı boyunca sandviçe hemen uygulayın.

Ardından, başka bir pipet kullanarak jelin üst kısmını yaklaşık bir santimetre kalınlığında suyla doyurulmuş izobütil alkol veya distile su tabakasıyla yavaşça kaplayın. Bunu, suyu önce bir, ardından diğer ayırıcı şeridin kenarına nazikçe ekleyerek yapın ve jelin 30 ila 60 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Oda sıcaklığında, üstteki su tabakası akrilamid jelin düz bir hat şeklinde polimerize olmasını sağlar.

Jel polimerize olduktan sonra, istifleme jelini dökmeye hazırız. İlk olarak, distile su tabakasını dökün, ardından pH 8.8'de 1x tris CL in SDS ile durulayın. Şimdi, güncel protokollerde belirtildiği şekilde istifleme jeli solüsyonunu hazırlayın.

Ardından, plastik bir pipet kullanarak, sandviç içerisindeki çözelti yüksekliği plakaların üst kısmından yaklaşık bir santimetre aşağıda kalana kadar, yığma jeli çözeltisinin ara parçalardan birinin kenarı boyunca sandviçin merkezine yavaşça akmasını sağlayın. Yığma jel içerisine hava kabarcığı kaçırmamaya dikkat edin. Jel döküldükten sonra, yığma jeli çözeltisi tabakasına 0,75 milimetrelik bir Teflon tarak yerleştirin.

İstifleme jeli çözeltisinin oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin; artık protein örneklerini hazırlamaya hazırız. Protein örnek hazırlığına başlamak için, analiz edilecek protein örneğinin bir kısmını iki XSDS örnek tamponu ile bire bir oranda seyreltin.

Seyreltik protein çözeltileri için, beş birim protein ile altı birim 6X SDS örnek tamponu karışımı kullanmayı değerlendirin. Örnek çöktürülmüş bir protein peleti ise, proteini 50 ila 100 µL 1X SDS örnek tamponu içerisinde çözün. Ardından örnekleri, sızdırmaz vidalı kapaklı bir mikro santrifüj tüpü içinde, su banyosunda 100 °C'de üç ila beş dakika ısıtın.

Ardından, poliakrilamid kuyucuklarının kenarlarını yırtmamaya dikkat ederek Teflon tarağı dikkatlice çıkarın. Tarak çıkarıldıktan sonra, kuyucukları 1X SDS elektroforez tamponu ile durulayın. Daha sonra bir pipet kullanarak, kuyucukları 1X SDS elektroforez tamponu ile doldurun.

Kuyucuklar durulandıktan ve tamponla doldurulduktan sonra, jel sandviçini üst tampon haznesine takın. Üretici talimatlarını izleyerek, alt tampon haznesini önerilen miktarda bir XSDS elektroforez tamponu ile doldurun. Ardından, üst tampon haznesine takılı olan sandviçi alt tampon haznesinin içine yerleştirin.

Şimdi, istifleme jelinin örnek kuyucukları tamponla dolacak şekilde üst tampon haznesini tamamen 1X SDS elektroforez tamponu ile doldurun. Jel, artık 25 veya 100 mikrolitrelik, jel yükleme uçlarına sahip bir otomatik pipetle yüklenmeye hazırdır; protein örneğini, örnekleri kuyucukların tabanına ince bir tabaka halinde dikkatlice uygulayarak bir veya daha fazla kuyucuğa yükleyin. Kontrol kuyucuklarını moleküler ağırlık standartları ile doldurun.

Bitişik hatların yayılmasını önlemek için boş kuyucuklara eşit hacimde bir XSDS örnek tamponu ekleyin. Artık jel elektroforezine başlamaya hazırız. Jeli çalıştırmak için güç kaynağını hücreye bağlayın ve 1,5 mm kalınlığındaki bir slab jel için 30 mA sabit akımda çalıştırın.

Mentol mavisi takip boyası ayırma jelinin altına ulaştıktan sonra güç kaynağının bağlantısını kesin. Jel yürütme işlemi tamamlandığına göre, elektroforez tamponunu boşaltın ve ekli jel sandviçi ile birlikte üst tampon haznesini çıkarın. Örnek kuyucuklarının sırası bilinecek şekilde jeli yönlendirin.

Ardından sandviçi üst tampon odacığından çıkarın ve emici bir kağıt veya kağıt havlu üzerine yerleştirin. Sonra dikkatlice, ara parçalardan birini sandviçin kenarından başlayarak tüm uzunluğu boyunca yarıya kadar kaydırın. Cam plakayı kanırtarak açmak ve jeli dikkatlice açığa çıkarmak için dışarıda kalan ara parçayı bir kaldıraç olarak kullanın.

Jeli alt plakadan çıkarın. Boyama ve kurutma sırasında şerit yönünün kaybolmaması için jelin bir köşesinden küçük bir üçgen kesin. Jel elektroforezi prosedürü bu şekilde tamamlanmış olur.

Jel artık çeşitli protein tespit prosedürleri kullanılarak işlenebilir. Size proteinlerin jel elektroforezi kullanılarak nasıl ayrıştırılacağını göstermiş olduk. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.