Name: Mikobakteriler, Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Öğrenin mikobakterilerin elektroporasyonla genetik dönüşümü için optimize edilmiş protokolü. Mycobacterium smegmatis kullanılarak kalın balmumu hücre duvarını aşma ve yüksek verimli DNA transferi yöntemleri gösterilmektedir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

mikobakteriler, elektroporasyon

Electroporation of Mycobacteria

Yüksek verimlilik dönüşümü mikobakterilerin çalışma önemli bir sınırlama yoktur. Cinsi, Mycobacterium dönüştürmek için zor olabilir; özellikle kalın ve mumsu bir hücre duvarı neden olduğu, ancak en moleküler teknikler, Escherichia coli ve Bacillus subtilis olarak uzaktan ilgili türler için geliştirilmiştir sahip olduğu gerçeği ile birleşir. Bu engellere rağmen, mikobakteriyel plazmid tespit edilmiştir ve birçok mikobakteriyel türlerin DNA dönüşüm tarif edilmiştir. Mikobakteriler içine DNA tanıtmak için en başarılı yöntem elektroporasyon. Birçok parametreler başarılı bir dönüşüme katkıda bulunur; bu türlerin / gerilme, dönüştürücü DNA doğa, seçilebilir marker kullanılan, besi ve elektroporasyon darbe için gerekli koşulları içerir. Hem yavaş ve hızlı-yetiştiricisi dönüşümü için optimize edilmiş yöntemler burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Dönüşüm verimliliği, farklı mikobakteriyel türler için ve çeşitli seçilebilir işaretleri ile rapor edilir.

Mikobakteriyel patojenik stratejileri tam olarak anlaşılamamıştır. Çoğu türlerin yavaş büyüme hızı, hücre duvar aşılmaz doğa ve patojenler ile çalışan tehlikeleri mikobakteriler zor çalışma yapmak ve bu organizmalar bizim kötü anlamak için büyük ölçüde sorumludur. Bu video, DNA girişi sağlamak için kısa bir yüksek elektrik uyarısı konusu hücreler içerir elektroporasyon tekniği, gösterecektir. Mikobakteriyel hücrelerin içine DNA tanıtmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

Yüksek verimli transformasyon, mikobakteriler üzerine yapılan çalışmalarda temel bir kısıtlamadır. Mycobacterium cinsi transformasyonu zor olabilir; bu durum temel olarak...

Çoğu türün yavaş büyüme hızı nedeniyle mikobakteriyel patojenik stratejiler hala yeterince anlaşılamamıştır. Hücre duvarının geçirmez doğası ve patojenlerle çalışmanın beraberinde getirdiği riskler, mikobakterilerin incelenmesini zorlaştırmakta ve bu organizmalar hakkındaki bilgi eksikliğimizin temel nedenlerini oluşturmaktadır. Bu videoda, hücrelerin DNA girişine izin verecek kısa ve yüksek bir elektrikle impulsa maruz bırakılmasını içeren elektroporasyon tekniğini göstereceğiz.Bu, mikobakteriyel hücrelere DNA aktarmak için en yaygın kullanılan yöntemdir. Merhaba, ben Barts and The London School of Medicine and Dentistry Enfeksiyon Hastalıkları Merkezi'nden Tanya Parish laboratuvarından Ron Good. Bugün size mikobakterilerin elektroporasyonu için bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvarımızda microbacterium tuberculosis üzerinde çalışıyoruz ancak bu bakteri yüksek derecede patojen olduğu ve C3 koruma tesisleri gerektirdiği için, sizlere bu tekniği patojen olmayan microbacterium m Mcma ile göstereceğiz. Öyleyse hadi bazı bakterileri elektropore edelim. Mikobakterileri elektropore etmek için kompetan hücreler hazırlamamız gerekir.Patojenik mikobakterilerin önemli bir biyotehlike oluşturduğunu unutmamak önemlidir. Bu nedenle, tüm kültürleme ve genetik manipülasyon işlemleri uygun bir koruma ortamında gerçekleştirilmelidir. Sınıf bir güvenlik kabini içindeki tesisler kullanılmalıdır. Risk değerlendirmesi, patojenik mikobakterilerle yapılan her türlü deneyin ilk aşamasını oluşturmalıdır.Bunları hazırlamak için, laboratuvarda lemko gibi katı besiyerlerinde sürdürülen kültürle başlarız; tween içeren beş mililitre Lemko broth'a bir öze dolusu mycobacteria ekimlenir. Birçok mycobacteria nispeten yavaş büyüyen organizmalar olduğundan, bu kültürlerin mycobacteria'ları hızla bastırabilecek bakteri veya mantarlarla kontamine olmasını önlemek için iyi bir aseptik teknik uygulamak son derece önemlidir. Birinin kontamine olması durumuna karşı, genellikle paralel kültürler hazırlamak mantıklıdır.Mycobacteria hücreleri, kalın balmumu tabakaları nedeniyle kültür ortamında kümelenme eğilimi gösterirler. Vorteksleme ve tween 82 medium gibi non-iyonik deterjanların eklenmesi bu kümelenmeyi azaltarak daha homojen bir hücre süspansiyonu sağlar. İnokülasyon sonrası kültürü 37 °C'de, 100 RPM hızında çalkalayarak gece boyunca inkübe edin.Başlangıç kültürü büyüdükten sonra, 250 ml'lik konik erlenmeyle yaklaşık yüz ml lemko tw içeren büyük ölçekli bir kültürü, gece boyunca büyütülen kültürün 1:100 seyrelmesiyle inoküle edin. Yaklaşık 16 ila 24 saat boyunca 37 °C'de çalkalamalı inkübasyona devam edin; bu sürenin sonunda optik yoğunluk spektrofotometre ile kontrol edilebilir. Değer 0,8 ile 1 arasındaysa, hücreler optimal log büyüme fazındadır.Ardından, hücreleri hasat etmeden önce 1,5 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin; bu işlem transformasyon verimliliğinin dört kat artmasına yardımcı olacaktır. Buz üzerinde daha uzun süreli inkübasyonlar, verimliliğin azalmasına neden olur. Daha sonra, kültürleri büyük santrifüj tüplerine boşaltarak hücreleri hasat edin.Santrifügeden sonra 10 dakika boyunca 300 Gs hızında döndürün; hücreleri buz gibi soğuk, %10 gliserol ile üç kez yıkayın ve her seferinde hacmi azaltın; örneğin yüz ml'lik bir kültür hacmi için ilk yıkamada 20 ml, ardından 10 ml ve son yıkama için beş ml kullanın. Yıkama işlemlerinin ardından, hücreleri orijinal hacmin 1/10 ile 1/100'ü kadar buz gibi soğuk %10 gliserol içinde yeniden süspande edin. Bu aşamada hücreler alikotlanabilir, dondurulabilir ve gelecekteki kullanımlar için -70 °C'de saklanabilir.Transformasyon verimliliği genellikle hücreler dondurulduktan sonra artar. Bu kompetan hücreler kullanılmadan önce çözülmeli, santrifüj ile hasat edilmeli ve kullanımdan önce taze %10 gliserol içinde yeniden süspande edilmelidir. Elektroporasyon gerçekleştirmek için, 2,5 yüksek voltajlı bir impuls verebilen bir cihaz olan elektroporatör kullanılır.Kilovolt kullanılır. Bakteriler ve DNA, elektroporasyon küvetlerine yerleştirilir. Farklı küvetlerde açıklık veya yol uzunluğu aynı olsa da, alabilecekleri hacim bakımından farklılık gösterirler.Hücreleri stabilize etmek için rutin olarak 0,2 santimetrelik bir qve içerisinde 200 microliters hücre kullanıyoruz. Öncelikle, DNA örneğini tuzlardan ve diğer kontaminanlardan arındırılmış olacak şekilde hazırlayın. Bu, elektroporasyon sırasında ark oluşma olasılığını en aza indirmek için önemlidir.Bakterileri gözenekli hale getirmeden önce, DNA örneklerinizin yüksek saflıkta olduğundan emin olun. A260/A280 absorbsiyon oranı 1,8'e yakın olmalıdır. En fazla 5 µL hacimdeki 0,5 ila 5 µg tuzsuz DNA'yı, 200 µL mikro-bakteriyel süspansiyona ekleyin. Antibiyotik dirençli mutantların sıklığını kontrol etmek için DNA içermeyen bir kontrol elektroporasyonu da dahil edilebilir.Ardından karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu işlem, örnekteki canlı hücrelerin ve DNA solüsyonundaki tuzların varlığını azaltarak buz inkübasyonundan sonra ark oluşumunu minimize edecektir; yüksek voltaj darbesinden önce hücreleri yeniden süspande etmek ve DNA'nın karıştığından emin olmak için hücreleri bir pipet veya vortex ile iyice yeniden dağıtın. Hücrelerin topaklanması, ark oluşumuna yol açacak ve transformasyon verimliliğini düşürecektir.Ardından, karışımı önceden soğutulmuş 0.2 centimeter elektrot aralıklı bir kaba aktarın. Karışımın içine hava kabarcığı girmemesine tekrar dikkat edin. Bu işlem ayrıca ark oluşumunu azaltacaktır.qve'yi darbe odasına yerleştirmeden önce dış kısmının tamamen kuru olduğundan emin olun. qve'yi iyice kuruttuktan ve darbe kontrolör direnci bin ohm'a ayarlandıktan sonra, qve'yi elektroporasyon odasına yerleştirin. Ardından voltajı 2,5 kilovolt'a ayarlayıp, QVE'deki kapasitörün boşaldığını belirten bir bip sesi duyulana kadar darbeyi uygulayın.10'dan büyük bir zaman sabiti, başarılı bir elektroporasyonun göstergesidir. Başarısız elektroporasyonlar genellikle, sıklıkla önlenebilen bir kıvılcıma neden olan ark oluşumuyla belirtilir. Puls kontrolöründeki direnci değiştirerek, Q vet'i 10 dakika boyunca tekrar buza koyun.İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu beş ml lemko TW besiyeri içeren steril bir üniversal şişeye aktarın. Hücrelerin toparlanmasına yardımcı olmak ve transformantların sağkalımını artırmak için, pals işleminin hemen ardından hücreleri en az on kat seyreltmek önemlidir. Ardından, hücreleri 37 °C'de iki ila üç saat boyunca inkübe edin; böylece hücreler plaklama için hazır hale gelir. İnkübasyon sonrası, hücreleri 3000 G'de 10 dakika boyuncale santrifüj ederek hasat edin.Santrifüjleme işleminin ardından, her plak üzerinde 30 ila 300 koloni oluşacak şekilde süspansiyonun lemko besiyerinde uygun dilüsyonunu yapın. Dirençli kolonilerin tek bir hücreden kaynaklandığından emin olmak önemlidir, bu nedenle plakalama öncesinde hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Hücreler dilüe edilmezse, duyarlı hücrelerden oluşan bir koloni örtüsü (lawn) arka planında gerçek dirençli kolonileri görselleştirmek çok zor olabilir; şimdi hücreleri uygun antibiyotikli lemko agarına ekerek plakalama işlemini gerçekleştirin.Plakaları, koloniler görünür hale gelene kadar 37 °C'de inkübe ederler. Koloniler büyüdükten sonra bu işlem üç ila beş gün sürer. Transformantları sayın.Transformasyon verimliliğini hesaplamak için. Transformasyon verimliliğini etkileyen birkaç faktör vardır. Bunlar arasında hücrelerin toplandığı büyüme evresi, elektroporasyon ortamı ile iletilen palsin alan gücü ve zaman sabiti yer alır.Elektroporasyon tekniğinin verimliliği ayrıca transformasyon için seçilen DNA'ya ve bazen seçilebilir marker seçimine bağlıdır. Higromisin veya streptomisin direnci kullanılarak ems magma içerisinde mikrogram başına 10⁵ ile 10⁶ koloni arasında verimlilik düzenli olarak elde etmekteyiz. Transformantları büyütmek için elektropore edilmiş mikobakterileri seçici madde içeren katı besiyerine ekerek çizgili ekim yapınız.Antibiyotiği 37 °C'de iki ila üç gün boyunca inkübe edin. İki ila üç günlük inkübasyonun ardından, çoğu uygulama için gerekli olduğu üzere transformantları analiz edebilirsiniz; üç transformant çizgi şeklinde ekilmeli ve analiz edilmelidir. Transformasyon sonrası ekstra kromozomal plazmidin kimliğinin doğrulanması önemlidir.Delesyonlar ve yeniden düzenlemeler yaygın olduğundan, size sadece mycobacterium s magma'nın nasıl elektrolize edileceğini gösterdim. Bu prosedürü patojenik mikrobakterilerle gerçekleştirecekseniz, uygun güvenlik önlemlerini kullanmayı unutmayın. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri, Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, hücre hazırlama, elektroporasyon, geri kazanım ve transformantların seçimi dahil olmak üzere Escherichia coli'yi antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürme prosedürünü göstermektedir.

Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Plazmid DNA'sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Bu protokol, mikobakterilerden yüksek kaliteli DNA çıkarmak için CTAB yöntemini tanımlar; bu yöntem, onların dayanıklı, mikolik asit açısından zengin hücre duvarlarının getirdiği zorlukları aşmaktadır. Bu süreç, enzimatik sindirim, CTAB ile hücre lizisi ve organik ekstraksiyon ile etanol çökeltilemesiyle DNA arındırmasını içerir. Bu yöntem, moleküler çalışmalar için uygun DNA üretir ve mikobakteriyel araştırmalar için güvenilirdir.

Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Öğrenin mikobakterilerin elektroporasyonla genetik dönüşümü için optimize edilmiş protokolü. Mycobacterium smegmatis kullanılarak kalın balmumu hücre duvarını aşma ve yüksek verimli DNA transferi yöntemleri gösterilmektedir.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet