Mikobakteriler, Elektroporasyon

Çoğu türün yavaş büyüme hızı nedeniyle mikobakteriyel patojenik stratejiler hala yeterince anlaşılamamıştır. Hücre duvarının geçirmez doğası ve patojenlerle çalışmanın beraberinde getirdiği riskler, mikobakterilerin incelenmesini zorlaştırmakta ve bu organizmalar hakkındaki bilgi eksikliğimizin temel nedenlerini oluşturmaktadır. Bu videoda, hücrelerin DNA girişine izin verecek kısa ve yüksek bir elektrikle impulsa maruz bırakılmasını içeren elektroporasyon tekniğini göstereceğiz.

Bu, mikobakteriyel hücrelere DNA aktarmak için en yaygın kullanılan yöntemdir. Merhaba, ben Barts and The London School of Medicine and Dentistry Enfeksiyon Hastalıkları Merkezi'nden Tanya Parish laboratuvarından Ron Good. Bugün size mikobakterilerin elektroporasyonu için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda microbacterium tuberculosis üzerinde çalışıyoruz ancak bu bakteri yüksek derecede patojen olduğu ve C3 koruma tesisleri gerektirdiği için, sizlere bu tekniği patojen olmayan microbacterium m Mcma ile göstereceğiz. Öyleyse hadi bazı bakterileri elektropore edelim. Mikobakterileri elektropore etmek için kompetan hücreler hazırlamamız gerekir.

Patojenik mikobakterilerin önemli bir biyotehlike oluşturduğunu unutmamak önemlidir. Bu nedenle, tüm kültürleme ve genetik manipülasyon işlemleri uygun bir koruma ortamında gerçekleştirilmelidir. Sınıf bir güvenlik kabini içindeki tesisler kullanılmalıdır. Risk değerlendirmesi, patojenik mikobakterilerle yapılan her türlü deneyin ilk aşamasını oluşturmalıdır.

Bunları hazırlamak için, laboratuvarda lemko gibi katı besiyerlerinde sürdürülen kültürle başlarız; tween içeren beş mililitre Lemko broth'a bir öze dolusu mycobacteria ekimlenir. Birçok mycobacteria nispeten yavaş büyüyen organizmalar olduğundan, bu kültürlerin mycobacteria'ları hızla bastırabilecek bakteri veya mantarlarla kontamine olmasını önlemek için iyi bir aseptik teknik uygulamak son derece önemlidir. Birinin kontamine olması durumuna karşı, genellikle paralel kültürler hazırlamak mantıklıdır.

Mycobacteria hücreleri, kalın balmumu tabakaları nedeniyle kültür ortamında kümelenme eğilimi gösterirler. Vorteksleme ve tween 82 medium gibi non-iyonik deterjanların eklenmesi bu kümelenmeyi azaltarak daha homojen bir hücre süspansiyonu sağlar. İnokülasyon sonrası kültürü 37 °C'de, 100 RPM hızında çalkalayarak gece boyunca inkübe edin.

Başlangıç kültürü büyüdükten sonra, 250 ml'lik konik erlenmeyle yaklaşık yüz ml lemko tw içeren büyük ölçekli bir kültürü, gece boyunca büyütülen kültürün 1:100 seyrelmesiyle inoküle edin. Yaklaşık 16 ila 24 saat boyunca 37 °C'de çalkalamalı inkübasyona devam edin; bu sürenin sonunda optik yoğunluk spektrofotometre ile kontrol edilebilir. Değer 0,8 ile 1 arasındaysa, hücreler optimal log büyüme fazındadır.

Ardından, hücreleri hasat etmeden önce 1,5 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin; bu işlem transformasyon verimliliğinin dört kat artmasına yardımcı olacaktır. Buz üzerinde daha uzun süreli inkübasyonlar, verimliliğin azalmasına neden olur. Daha sonra, kültürleri büyük santrifüj tüplerine boşaltarak hücreleri hasat edin.

Santrifügeden sonra 10 dakika boyunca 300 Gs hızında döndürün; hücreleri buz gibi soğuk, %10 gliserol ile üç kez yıkayın ve her seferinde hacmi azaltın; örneğin yüz ml'lik bir kültür hacmi için ilk yıkamada 20 ml, ardından 10 ml ve son yıkama için beş ml kullanın. Yıkama işlemlerinin ardından, hücreleri orijinal hacmin 1/10 ile 1/100'ü kadar buz gibi soğuk %10 gliserol içinde yeniden süspande edin. Bu aşamada hücreler alikotlanabilir, dondurulabilir ve gelecekteki kullanımlar için -70 °C'de saklanabilir.

Transformasyon verimliliği genellikle hücreler dondurulduktan sonra artar. Bu kompetan hücreler kullanılmadan önce çözülmeli, santrifüj ile hasat edilmeli ve kullanımdan önce taze %10 gliserol içinde yeniden süspande edilmelidir. Elektroporasyon gerçekleştirmek için, 2,5 yüksek voltajlı bir impuls verebilen bir cihaz olan elektroporatör kullanılır.

Kilovolt kullanılır. Bakteriler ve DNA, elektroporasyon küvetlerine yerleştirilir. Farklı küvetlerde açıklık veya yol uzunluğu aynı olsa da, alabilecekleri hacim bakımından farklılık gösterirler.

Hücreleri stabilize etmek için rutin olarak 0,2 santimetrelik bir qve içerisinde 200 microliters hücre kullanıyoruz. Öncelikle, DNA örneğini tuzlardan ve diğer kontaminanlardan arındırılmış olacak şekilde hazırlayın. Bu, elektroporasyon sırasında ark oluşma olasılığını en aza indirmek için önemlidir.

Bakterileri gözenekli hale getirmeden önce, DNA örneklerinizin yüksek saflıkta olduğundan emin olun. A260/A280 absorbsiyon oranı 1,8'e yakın olmalıdır. En fazla 5 µL hacimdeki 0,5 ila 5 µg tuzsuz DNA'yı, 200 µL mikro-bakteriyel süspansiyona ekleyin. Antibiyotik dirençli mutantların sıklığını kontrol etmek için DNA içermeyen bir kontrol elektroporasyonu da dahil edilebilir.

Ardından karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu işlem, örnekteki canlı hücrelerin ve DNA solüsyonundaki tuzların varlığını azaltarak buz inkübasyonundan sonra ark oluşumunu minimize edecektir; yüksek voltaj darbesinden önce hücreleri yeniden süspande etmek ve DNA'nın karıştığından emin olmak için hücreleri bir pipet veya vortex ile iyice yeniden dağıtın. Hücrelerin topaklanması, ark oluşumuna yol açacak ve transformasyon verimliliğini düşürecektir.

Ardından, karışımı önceden soğutulmuş 0.2 centimeter elektrot aralıklı bir kaba aktarın. Karışımın içine hava kabarcığı girmemesine tekrar dikkat edin. Bu işlem ayrıca ark oluşumunu azaltacaktır.

qve'yi darbe odasına yerleştirmeden önce dış kısmının tamamen kuru olduğundan emin olun. qve'yi iyice kuruttuktan ve darbe kontrolör direnci bin ohm'a ayarlandıktan sonra, qve'yi elektroporasyon odasına yerleştirin. Ardından voltajı 2,5 kilovolt'a ayarlayıp, QVE'deki kapasitörün boşaldığını belirten bir bip sesi duyulana kadar darbeyi uygulayın.

10'dan büyük bir zaman sabiti, başarılı bir elektroporasyonun göstergesidir. Başarısız elektroporasyonlar genellikle, sıklıkla önlenebilen bir kıvılcıma neden olan ark oluşumuyla belirtilir. Puls kontrolöründeki direnci değiştirerek, Q vet'i 10 dakika boyunca tekrar buza koyun.

İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu beş ml lemko TW besiyeri içeren steril bir üniversal şişeye aktarın. Hücrelerin toparlanmasına yardımcı olmak ve transformantların sağkalımını artırmak için, pals işleminin hemen ardından hücreleri en az on kat seyreltmek önemlidir. Ardından, hücreleri 37 °C'de iki ila üç saat boyunca inkübe edin; böylece hücreler plaklama için hazır hale gelir. İnkübasyon sonrası, hücreleri 3000 G'de 10 dakika boyuncale santrifüj ederek hasat edin.

Santrifüjleme işleminin ardından, her plak üzerinde 30 ila 300 koloni oluşacak şekilde süspansiyonun lemko besiyerinde uygun dilüsyonunu yapın. Dirençli kolonilerin tek bir hücreden kaynaklandığından emin olmak önemlidir, bu nedenle plakalama öncesinde hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Hücreler dilüe edilmezse, duyarlı hücrelerden oluşan bir koloni örtüsü (lawn) arka planında gerçek dirençli kolonileri görselleştirmek çok zor olabilir; şimdi hücreleri uygun antibiyotikli lemko agarına ekerek plakalama işlemini gerçekleştirin.

Plakaları, koloniler görünür hale gelene kadar 37 °C'de inkübe ederler. Koloniler büyüdükten sonra bu işlem üç ila beş gün sürer. Transformantları sayın.

Transformasyon verimliliğini hesaplamak için. Transformasyon verimliliğini etkileyen birkaç faktör vardır. Bunlar arasında hücrelerin toplandığı büyüme evresi, elektroporasyon ortamı ile iletilen palsin alan gücü ve zaman sabiti yer alır.

Elektroporasyon tekniğinin verimliliği ayrıca transformasyon için seçilen DNA'ya ve bazen seçilebilir marker seçimine bağlıdır. Higromisin veya streptomisin direnci kullanılarak ems magma içerisinde mikrogram başına 10⁵ ile 10⁶ koloni arasında verimlilik düzenli olarak elde etmekteyiz. Transformantları büyütmek için elektropore edilmiş mikobakterileri seçici madde içeren katı besiyerine ekerek çizgili ekim yapınız.

Antibiyotiği 37 °C'de iki ila üç gün boyunca inkübe edin. İki ila üç günlük inkübasyonun ardından, çoğu uygulama için gerekli olduğu üzere transformantları analiz edebilirsiniz; üç transformant çizgi şeklinde ekilmeli ve analiz edilmelidir. Transformasyon sonrası ekstra kromozomal plazmidin kimliğinin doğrulanması önemlidir.

Delesyonlar ve yeniden düzenlemeler yaygın olduğundan, size sadece mycobacterium s magma'nın nasıl elektrolize edileceğini gösterdim. Bu prosedürü patojenik mikrobakterilerle gerçekleştirecekseniz, uygun güvenlik önlemlerini kullanmayı unutmayın. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.