Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

Merhaba, ben Newcastle Üniversitesi'nden İnsan Genetiği Enstitüsü ve Kuzeydoğu İngiltere Kök Hücre Enstitüsü'nden Maya Sibu Bloom. Ve yanımda Medical College of Wisconsin'dan bir arkadaşım var. Bugün size farelerin viskeral foliküllerinden Al Eksplan hazırlama prosedürümüzü göstereceğiz.

B Explanlar, epidermal nöral krist kök hücre kültürleri hazırlamak için kullanılan başlangıç dokularıdır. Bu prosedür, bıyık pedinin diseksiyonunu ve kıl foliküllerinin mikro diseksiyonunu, ardından BUL'ların izole edilerek bir kültür plağına yerleştirilmesini içerir. Hadi başlayalım.

Bu prosedür, yetişkin fare bıyık foliküllerinden bulge kısmının diseksiyonu ile başlar. Genellikle iki ila altı aylık fareler kullanıyoruz; ancak daha genç fareler daha fazla kök hücre sağlama eğilimindedir. Hayvanlar sterilize edilir ve dezenfeksiyon için yaklaşık üç dakika boyunca Betadine ve hidrojen peroksit bir bire bir karışımına tamamen daldırılır; ardından tüm fareye, özellikle yüz bölgesine %75 etanol püskürtülür ve fare diseksiyon mikroskobuna taşınır.

Laminar akışlı kabinde, kıl foliküllerine zarar vermemeye dikkat ederek WHI pedlerini dikkatlice disseke edin ve oda sıcaklığındaki dengeli tuz çözeltisine yerleştirin. WHI foliküllerini disseke etmek için, folikülün yanındaki deriyi pensle tutun ve ardından düz makasla folikülün etrafını kesin. Derinlemesine kesin.

Kıl köklerine zarar vermemek için, bıyık folikülünü bıyık pedinden kaldırın ve yeni bir plakaya yerleştirin. Taze HBSS kullanarak folikülleri aynı plaka içinde çekin. Sivritilmiş pens ve iğneler yardımıyla bir kıl folikülünü, HBSS içeren ipek koruyucu kaplı bir cam Petri kabına sabitleyin.

Vibrissa folikülü temizlenene kadar, gevşek adipoz doku ve dermal dokuyu tampon çözelti püskürterek yıkayın. Gerekirse, vibrissa folikülüne giden siniri kesin ve yapışık dokuyu sıyırarak ve tekrarlayan HBSS yıkamalarıyla uzaklaştırın. Visco folikülünü bir mikro bıçakla boylamasına kesin.

Şişkinliğe zarar verebileceği için çok derin kesmekten kaçının. Kan tamamen temizlenene kadar tekrarlanan HBSS püskürtmeleriyle kanı uzaklaştırın. Kanın görülmesi, kesinin yeterince derin olduğunun iyi bir göstergesidir.

Ardından, coness sinüs seviyesinin üzerinden transvers bir kesi yapın ve sonrasında izole edilen folikül parçası içinde, ring sinüs seviyesinde cilde çok yakın bir noktadan ikinci bir transvers kesi gerçekleştirin. Artık kapsülün içindeki şişkinliği göreceksiniz. Bakınız, işte orada.

Kapsülün bir ucunu pensle tutun ve şişkinliği çıkarın. Artık boş kapsülü ve izole edilmiş şişkinlik havuzunu göreceksiniz. İzole edilen şişkinlikleri, oda sıcaklığındaki HBSS içeren ayrı bir kültür plağına yerleştirin.

Havuzlanmış şişkinliklerin başka hiçbir doku tarafından kontamine edilmediğinden emin olun. Bu noktada, şişkinlik bitkileri, kültür tüpleri içine alınmadan önce kültüre edilebilir. 35 milimetrelik kültür plakaları, 50 µL kolajen ve 10 µL steril damlalar yerleştirilerek kolajen ile kaplanır.

%6 saline yan yana gelecek şekilde yerleştirilir. Çift bükümlü bir poster pipetle iyice karıştırılıp kültür plağının kenarına doğru itilir; temiz bir ortamda gece boyunca inkübe edilir ancak kurumasına izin verilmez. Bu amaçla, altında bir kap su bulunan bir desikatör kullanırız.

Ertesi gün, kültür günüdür. Plakaları salin ile durulayın; kolajen kaplı ve durulanmış kültür plakalarını, inkübatörde yaklaşık üç saat boyunca ön inkübasyona bırakın. Kültür medyumu %85 alpha modifiye MEM, %10 fetal bovin serum ve %5 11. gün civciv embriyo ekstraktından oluşmaktadır.

Ön inkübasyondan sonra, kültür ortamını plakalardan uzaklaştırın ve mümkün olduğunca az ortam içeren birkaç BUL ekleyin. Fazla kültür ortamını uzaklaştırın. %10 oksijen ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, hücre inkübatöründe bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saat sonra, yavaşça 1,5 mililitre kültür ortamı ekleyin. CHE bitkileri kolajen substrata yapışmış olmalıdır; kültürel ortamın %50'sini her gün yenileyin. Tamam, şimdi başlayalım.

Şimdi kültürlere bir göz atalım. Üç ila dört gün içinde, yüksek göç kapasitesine sahip hücreler hücre kürelerinden dışarı çıkacaktır. Hücrelerin yıldız benzeri morfolojilerini ve hücreler arası temasların büyük ölçüde yokluğunu not edin.

Önümüzdeki birkaç gün içinde daha fazla hücre göç edecek ve göç eden hücreler hızla çoğalacaktır; yassı morfolojiye sahip olan ve bazen epidermal nöral kristen birkaç gün sonra belirginleşen önemli nadir hücreler görülecektir. Bu kültürlerde bazen kök hücrelere rastlanabilir. Bu hücreler epidermal nöral krist kök hücreleri değil, aksine daha az hareketli olan, muhtemel epidermal kök hücreler veya progenitörlerdir; bu hücreleri içeren kültürler imha edilmelidir.

Epidermal nöro-kök hücreler içeren bulge eksplant kültürlerinin nasıl hazırlandığını size göstermiş olduk. Nöro-kök hücreler oldukça göçer olduklarından, üç ila dört gün içinde bulge eksplantını terk edeceklerdir. Eksplantasyon sonrasında, bulge kısmı çıkarılır ve kültür plakasında saf nöro-kök hücre popülasyonu kalır.

Bu prosedür uygulanırken, kontaminasyonu önlemek için farenin dikkatlice dezenfekte edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Ayrıca, foliküllere zarar vermemek için yastıkçık riskli bölgesinde derin kesiler yapılmalıdır. Kültürlerle ilgili olarak, göç eden distilat, nöral krista hücreleri ve göç etmeyen kaldırım taşı şeklindeki keratinositler arasındaki farkı ayırt etmek önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.