Tre Recombinase Moleküler Evrim

Benim adım Frank Alz. Dresden'deki Maxx Plunk Maküler Hücre Biyolojisi ve Genetiği Enstitüsü'nde grup lideriyim. Şimdi sizlere, moleküler cerrahi için bölgeye özgü rekombinaz geliştirme çalışmalarımızdan bahsedeceğim.

Temel olarak, genomdan önceden tanımlanmış dizileri, daha spesifik olarak ise virüsten etkilenen HIV enfekte hücrelerini yok etmek için kullanılan bir araç olarak tasarlanmıştır. Yani temel amaç, HIV provirüsü enfekte hücrelerin genomundan çıkarmaktır. Diğer bir kavramsal yaklaşım ise, halihazırda iyi bilinen genetik bir araç olan Cre Rekombinaz'ı, önceden belirlediğimiz bir hedef bölgeye bağlanması, bunu tanıması ve kullanması için adapte etmektir.

Bu nedenle, bir HIV virüsünün LTR bölgesinde doğal olarak bulunan bir bölgeye bağlanan bölgeye özgü bir rekombinaz yapıp yapamayacağımızı belirlemek için yola çıktık. Bunu başarabilirsek, provirüsü genomdan kesip çıkarmanın mümkün olacağını öngörüyorduk. Temel olarak viral yaşam döngüsü, virüsün hücrelere entegre olduğu ve ardından ters transkripsiyon yoluyla, iki terminal tekrarlarla çevrelenmiş bir DNA şablonu oluşturduğu bir aşamadan geçer.

Bunlara uzun terminal tekrarları veya kısa LTR'ler denir. Bu yapı daha sonra çekirdeğe taşınır ve konak genomuna aşağı yukarı rastgele bir şekilde entegre olur. Böylece, iki uzun terminal tekrarı yani iki LTR ile çevrelenmiş ve entegre olmuş, sözde bir provirüs durumuna sahip olursunuz.

Şu anki konsept, LT R'de bulunan bir diziyi tanıyan bir rekombinaz yapabilirsek, provirüsü konak genomundan dairesel bir yapı şeklinde çıkarabileceğimiz ve böylece virüsü hücrelerden tamamen yok edebileceğimiz üzerineydi. Kavramsal fikir buydu. Rekombinaz aslında bir DNA bağlayıcı proteindir ve çok spesifik bir bölgeyi bulur.

Bu nedenle, DNA içindeki belirli bir diziyi tanıyan bir DNA bağlanma alanına sahiptir. Enzim, yalnızca bu kesin diziyi bulduğunda aktiftir. Diğer dizilerin hiçbirinde aktif değildir.

Moleküler evrimin ilkeleri, aslında ıslah çalışmalarından başka bir şey olmadığı için temel olarak herkes tarafından bilinir. Moleküler evrimin temel ilkesi, mutasyonlar oluşturmak ve ardından belirli bir özelliğin seçildiği bir seleksiyon süreci uygulamaktır. Bu durum, bitki ıslahı yaparken uygulanan yöntemle aynıdır.

Belirli bir boyuta veya belirli bir renge sahip olmak istediğinizi bilirsiniz ve ardından sonraki nesil dövüşlerden bu belirli özelliklere sahip olanları seçip onları birbirleriyle çiftleştirmeye başlarsınız. Moleküller için yaptığımız şey de tam olarak budur. Yani bu, temel olarak her şeyin küçük ölçekte yapılmasıdır.

Öncelikle, bizim durumumuzda CRE rekombinaz olan ve belirli bir aktiviteye sahip bir enzim ile vahşi tip bir proteinle başlıyoruz. Ardından, bu rekombinazın bağlandığı bölgeyi hafifçe mutasyona uğratıyoruz, ancak bu bölge hala çok, çok düşük bir aktiviteye sahip oluyor. Daha sonra enzime, yani rekombinaza rastgele mutasyonlar getiriyoruz ve artık bu mutasyona uğramış bölgeye bağlanabilen mutantları seçiyoruz.

Buna sahip olduğumuzda, rekombinazın LTR'de tanımladığımız diziyi tanımasını sağlayacak nihai ürüne ulaşmak için farklı mutantları birleştirebiliriz. Belirttiğim gibi, işe rastgele bir mutajen kütüphanesiyle başlarız. Bu işlem genellikle hata eğilimli PCR ile gerçekleştirilir.

Bu nedenle, örneğin hata yapma oranı yüksek olan Taq polimeraz gibi PCR koşulları kullanıyoruz. Bu sayılarda, her yerde mutasyonlar taşıyan rastgele bir kütüphane oluşturuyoruz. Ayrıca, belirli transkriptlerde birçok mutasyon meydana getiren bir mutator suşu, yani bakteriyel bir mutator suşu da kullanabiliriz.

Bunlar daha sonra başlangıç materyali olarak kullanılır. Kullandığımız diğer teknoloji ise, bir süre sonra DNA karıştırma (DNA shuffling) yöntemine başvurmaktır. Bu, temel olarak farklı faydalı mutasyonları birleştirmenize olanak tanıyan bir teknolojidir; çünkü hangi mutasyonun faydalı olduğunu tam olarak bilemezsiniz, ancak farklı mutasyonlara sahip çeşitli mutantlarınız olacaktır.

Böylece, burada faydalı bir mutasyona sahip olan bir geniniz var. Burada bir mutasyona sahip olan ikinci bir klonunuz var ve bu ikisini bir araya getirmek için, önce farklı parçaların rastgele fragmantasyonunu gerçekleştirirsiniz ve ardından ürünleri yeniden birleştirmek için bunları bir PCR reaksiyonunda bir araya getirirsiniz. Artık, belirli bir frekansta, rekombinasyonun bir kısmının bu mutanttan ve bir kısmının bu mutanttan oluştuğu bir kombinasyona sahip olacaksınız.

Ve ardından buradaki bu faktör, istenen özelliklere sahip adayları çok daha hızlı seçebilmenizi sağlayacak ek bir etki yaratacaktır. Bu nedenle, yabani tip proteinin belirli bir bölge üzerinde kesinlikle hiçbir aktivite göstermediğini belirten bir tanım yapardım. Örneğin, HIV-LTR'den seçtiğimiz dizimizi ele alırsak, bu dizi üzerinde cre rekombinaz denediğinizde kesinlikle hiçbir aktivite görmeyeceksiniz.

CRE rekombinaz bölgeyi rekombine edemiyor ve tanım gereği, bu diziye bağlanabilen ve onu rekombine edebilen bir enzim elde ettiğinizde yeni bir rekombinaza sahip olmuş olursunuz. Kaç döngü yapacağımızı önceden belirlemedik; ancak istediğimiz aktiviteye sahip bir enzim elde edene kadar gerekli olan döngü sayısını gerçekleştirdik. Böylece, bölgede çok küçük mutasyonlarla başladık ve ardından farklı mutasyonları bir araya getirmeye başladık.

Bu, sürecin neden işe yaradığının önemli adımlarından biriydi. Böylece ara ürünler üzerinden geçtik ve bir sonraki döngüye geçebilecek kadar aktif bir enzim bulmak için bu kadar çok döngüden geçmek zorunda kaldık. Bu durum, herhangi bir ıslah sürecine çok benzer.

İstediğiniz belirli bir aktiviteyi, istediğiniz belirli bir özelliği belirlersiniz ve ardından yetiştirme işlemine başlarsınız. İstediğiniz sonucu elde edene kadar süreç tamamlanmamış olur ve daha fazla nesil üretmeniz gerekir. Temelde durum budur.

Ayrıca, bazı aktivite gözlemlediğimiz ve durabileceğimiz bir ara aşamayı bulmak için 120 evrim döngüsü veya tam olarak yüz yirmi sekiz döngü gerçekleştirdiğimizi belirtmeliyim. Şu an elimizdeki rekombinasyon, CRE rekombinazın yabani tip formuna göre hala daha az aktiftir. Dolayısıyla, daha aktif bir rekombinaz elde etmek için daha fazla evrim döngüsü yapmamız gerekecektir.

Dolayısıyla, evrim süreci için şu an bulunduğumuz noktada temel olarak sona ermiyor. Herhangi bir teknik sınırlama görmüyorum. Bunu ne kadar ileriye götürebileceğiniz tartışmaya açıktır.

Böylece LTR tarafındaki bölgeler, yani LTR HA içinde bulduğunuz sekans, doğal loks P tarafıyla, yani karier rekombinazın tanıdığı doğal tarafla %50 sekans benzerliğine sahiptir. Dolayısıyla soru şudur; kişi bunu daha da ileriye götürebilir mi? Bunu henüz bilmiyoruz ancak vahşi tip bölgeyle yalnızca %50 sekans benzerliğine sahip olmamız, bunu daha da ileriye taşıyabileceğinizi göstermektedir. Daha önce belirttiğim gibi, kendi bölgesi üzerindeki karier rekombinaz kadar aktif olmasa da, rekombinaz insan doku kültürü hücrelerinde iyi çalışmaktadır.

Bu nedenle, stabilitenin muhtemelen sorgulanan rekombinazdan, yani yabanıl tip enzimden biraz daha düşük olduğu söylenebilir; bu özellikleri gelecekte geliştirmek için daha fazla seçilim ve daha fazla evrim döngüsü gerekecektir. Dolayısıyla ilk adım, bu spesifik rekombinaz olan TRE rekombinazı iyileştirmek, onu daha aktif hale getirmek, belki bir LTR'de iyi hedefler olabilecek diğer belirgin bölgeleri bulmak ve bunun için çok uygun bir rekombinaz tespit etmektir. Daha sonra bu rekombinazı farklı analizlerde, önce tekrar doku kültürü hücrelerinde, ancak ardından çok daha önemlisi hayvan modellerinde test etmemiz gerekecektir.

Bu nedenle, bu rekombinazın bir organizmada herhangi bir istenmeyen yan etkiye sahip olup olmadığını kontrol etmemiz gerekecektir. Ardından, elbette oldukça zorlu bir yönü de, basit olmayan bir süreç olan bu rekombinaz için iyi bir iletim sistemi geliştirmektir. Bu, kendi başına geliştirilmesi gereken koca bir araştırma alanıdır.

Temelde uygulamamız gereken bir gen tedavisi yaklaşımıydı. Tıbbın giderek daha fazla moleküler düzeye evrildiği bir değişim yaşadığımızı düşünüyorum. Elbette bunun için, bu ölçekte çalışabilmemizi sağlayacak araçlara ihtiyacımız var.

Ve işte evrim sürecinin geleceğini gördüğüm nokta burası. Dolayısıyla, rekombinaz örneğinde olduğu gibi, gerçekten kullanabilmeyi istediğimiz bir süreç üzerinde çalışan özel yapım enzimler üretmemiz gerekiyor; bunu, bir cerrahın ameliyat sırasında kesip çıkarması gereken bir şeye yönelik kullandığı bir araca benzetebiliriz. Burada artık, moleküler bir cerrahın genomdan belirli bir DNA parçasını spesifik olarak kesip çıkarmak istediği araçlara ihtiyaç duyuyoruz.

Ve bunun için, bunu yapabilmesini sağlayacak araçlara ihtiyaç duyar. Dolayısıyla moleküler evrim, temel olarak bu işlevi yerine getirebilir. Doğada, bunu yapabilmek için oldukça arzu edilen özelliklere sahip birçok enzim bulunmaktadır.

Ve onları faydalı hale getirebilmek için kendi ihtiyaçlarımıza göre uyarlamamız gerekiyor. Moleküler evrimin burada çok önemli bir rol oynayabileceğini düşünüyorum. Sınırların nerede olduğu şu an için söylemek zor çünkü bu alan gerçekten henüz başlangıç aşamasında.

Bu nedenle, sınırlamaların neler olduğu zamanla ortaya çıkacaktır. Bazı sınırlamalar olacağından eminim, ancak şu an için kısıtlamalardan çok fırsatların olduğunu düşünüyorum.