Name: Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Öğrenin, C. elegans gonadına mikroenjeksiyon yaparak transgenik hayvanlar nasıl üretilir. Bu yöntem, floresan mikroskopi ile gen ekspresyonunun canlı görüntülenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir.

İfade Plazmid yapı İki plazmid gereklidir: doku özel ilgi gen ekspresyonu ve seçilebilir dönüşüm belirteci olarak ikinci bir biri. Deneysel Plazmid <ol><li> Örneğin faiz doku / hücre tipi, bir sinir ya da kas-özel organizatörü olarak ifade organizatörü seçin. Aynı doku içinde birden fazla genin ifade etmek için ise, Gateway sisteminin (Invitrogen) plazmid bir yararlanıcı kaset kullanılabilir. Bu yaklaşım, recombinational klonlama 4 organizatörü faiz downstream herhangi bir gen ekleme sağlar. Genellikle 2-5 kb upstream dizilerinin doğru ve doğru ifade etmek için yeterli. </li><li> CDNA ilgi genin iki şekilde klonlanmış olabilir: <ol><li> Restriksiyon enzimlerini kullanarak Konvansiyonel klonlama. </li><li> Gateway klonlama için, PCR Ağ Geçidi att B recombinational dizisi içeren primerler kullanılarak amplifiye. Amplifiye cDNA ilk giriş vektörü oluşturmak için donör vektör pDONR201 recombined ve sonra E. dönüştü coli suşu DH5a. Başarılı rekombinantlar ve DNA mini hazırlık izolasyon seçimi takiben, giriş vektörü ifade plazmid yaratmak için organizatörü içeren hedef vektör recombined. Recombinational klonlama Ayrıntılar Invitrogen Ağ Geçidi manuel veya Caldwell ve ark mevcuttur. 5. </li></ol></li></ol> Plazmid Seçilebilir Marker Transgenik işaret plazmid örnekleri, rol-6 ya da vücut duvarı kas organizatörü unc-54 floresan protein ekspresyonu sürücü kullanımı sayılabilir. Bu işaretleyici plazmidler genellikle istek üzerine araştırma toplum içinde mevcuttur. C. elegans, Mikroenjeksiyon Hazırlık <ol><li> Enjekte edilecek olan iki plazmid DNA izolasyonu gerçekleştirin. Asitli ve 50 ng / ul her 1:1 oranında karıştırın. </li><li> Agar pedleri hazırlayın: <ol><li> Eriyene kadar ısı veya mikrodalga% 2 agaroz su çözümü olun. </li><li> Bir masa üstü birkaç 22 x 50 mm kapak camları yola çıktı. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak, bir kapak cam erimiş agaroz bir damla koyun ve hemen ilk 90 açıyla açılan üzerinden ikinci bir cam kapak yerleştirin. Diğer birçok kapak camları için bu işlemi tekrarlayın. Agaroz basık disk çapı 15-20 mm arasında olmalıdır. </li><li> Agaroz (Bu dakikanızı alır) katılaşmış sonra, kapak camını çıkarın ve pedi tamamen kurumaya izin (bir gecede birkaç saat). </li><li> Cam bir kapakla kutusunda yastıkları, oda sıcaklığında saklayın. </li></ol></li><li> DNA çözümü için iğne yükleyiciler olun: İğne yükleyiciler ortasında açık ateşte ısıtılır ve boyları yaklaşık iki katı hızla çekti 100 ul kılcal tüpler oluşturulur. Kılcal tüp soğutulduktan sonra iki yarısı ayrı tersledi. 10-20 enjeksiyon için iğne yükleyiciler Stoğu. Dik bir mikrosantrifüj tüp rafta saklayın. Noktalarda kendini Impale olarak dikkatli kullanın. </li><li> Mikroenjeksiyon iğne yapın: Bir iç cam elyaf içeren özel bir kılcal tüpten iğne yapılır; bu filament DNA çözümü için bir fitil olarak hizmet vermektedir. Bu iğne çektirmenin makinede çekilir. Biz bir ısı ayarı ile 24.8 Narishige PP-830 çektirmesi kullanın. Bir seferde birkaç iğne çekilir ve küçük bir plastik kutu içinde saklanır. Birden fazla iğne kolayca modelleme kil, uzun süreli depolama için bir şerit üzerinde &quot;monte&quot; olabilir. </li><li> İğne ucu &quot;kesiciler&quot; Mikroenjeksiyon iğne ucu kadar ince aslında sonu kapalı olduğunu çekilir ve küçük kapak cam kırıkları ile açık kırık olmalıdır. Bu bir kağıt havlu, 18 x 18 mm kapak cam ambalaj ve birkaç parçaya kırar kadar hafifçe basınç uygulayarak tarafından hazırlanır. Shard yararlı bir boyutu yaklaşık 3 x 4 mm. </li><li> Vahşi tip (N2) solucanlar standart prosedürler kullanarak 6 enjeksiyon için erken yetişkinlik evresi için büyütün. Yaklaşık 100 hazırlayın düzgün solucanlar sahnelenen / inşa enjekte. </li></ol> Prosedür <ol><li> Mikroenjeksiyon iğne kol ve sahibine bağlı olan bir helyum tankı ana vanayı açın. Gaz basıncı 35 psi getirerek, çizgi girmek için izin vermek için regülatör vanasını kapatın. Ayak pedalı ile gaz açığa çıkabilir dikkat edin. </li><li> Bir iğne yükleyici, standart bir ağız pipetter cam kapiller tüplerin kaplar içinde bulunan tüp içine yerleştirin ve plazmid karışımı (~ 1 ul) küçük bir miktar yukarı çekmek. </li><li> Iğne yükleyici bir enjeksiyon iğnesi arka uç dikkatlice yerleştirilir ve hafifçe uzunluğu boyunca tüm yol takılıiğne kadar direnç hissedilir. Hafifçe üfleyerek DNA çözüm kovduktan sonra yükleyici çıkarın. </li><li> Küçük kauçuk conta içinde yerleştirmek için dikkatli olmak, mikroenjeksiyon koluna iğne takın. </li><li> Agar bir ped bir kenarı cam kapak iğne kırma shard yerleştirin. Halokarbon yağ ile, shard, agar pad gibi tüm yüzeyi örtün. Ters bir mikroskop sahnede agar yastık yerleştirin. </li><li> 4X objektif ve parlak bir alan aydınlatma kullanarak görüş alanının merkezinde iğne pozisyonu, ama henüz yağa düşürmez. Ayrıca, merkezde kapak cam shard iç kenarı konumu, o zaman odaklanmak (hala 4X objektif kullanarak). Cam kapak shard aynı odak düzlem haline getirerek, yağ içine iğne indirin. 40X objektif geçiş büyütme kaldırın. Shard kenarı üzerinde odaklanılması ve gerekirse iğne ucu yeniden konumlandırmak. </li><li> Ayak pedalı ile gaz kısa bir darbe uygulayarak, aynı zamanda da bir iğne ucu kadar açmak için, yavaşça, kapak cam Shard kenarına iğne dürtmek. Sıvı küçük damlacıklar iğne sonunda kaçmak iğne yeterince açık kırılmış olacaktır. Hayvanları öldürecek gibi çok büyük bir açılış nedeniyle Aşırı sıvı akış, arzu edilen değildir. </li><li> Iğne kadar yükselterek aşamasından agar pedini, ancak X ya da Y ekseni konumunu değiştirmez. Aşamada iğnenin altından dışarı doğru kaydırın, agar pad kaldırmak ve diseksiyon mikroskobu üzerine yerleştirin. Petrol yüzeyinin altında bir solucan, ped üzerine aktarın. Eğer solucan wriggles, yavaşça felç temas agar pad kadar. Nemli solucan kuru agaroz uymalıdır. </li><li> Enjeksiyon <ol><li> Hızla, sahneye agar pad yerine geri görüş alanı solucan merkezleme. </li><li> Solucan gibi odak aynı düzlem içine iğne indirin. </li><li> Hoffman Işık (kontrast filtre türü) filtreleri geçin. Bu solucanın morfolojik ayrıntı görünür olmasını sağlar. Nomarski / DIC optik ters kapsamı üzerinde de çalışacak. 40X objektif kullanarak, mikrop çekirdeğinin &quot;petek&quot; desen altında solucan gonad &quot;grenli&quot; sinsityal merkezi, (solucan iğne bakan tarafında konumlandırılmış hangisi gonad seçin) odaklanmak. </li><li> İnce ayar iğne ucu (gonad &quot;grenleşme&quot; olarak aynı düzlemde) odak kadar pozisyonu. </li><li> Gonad merkezi haline hafifçe iğne takın ve DNA ile ilgili bir ya da iki damlacık gonad kol sınırdışı gaz basıncı kısa bir darbe uygulayın. Distal gonad boyunca sıvı yayılmış bir dalga dikkat etmelisiniz. Oosit üretim kapatabilirsiniz gonad kol proksimal viraj içine çok fazla sıvı akabilir yılından bu yana daha fazla sıvı, daha iyi kabul etmeyin. Eğer mümkünse, solucanın pozisyonuna bağlı olarak, aynı şekilde diğer gonad kol enjekte edilir. </li><li> Kolaylıkla birbirinden ayrılacak gibi, bir solucan enjekte ederken hızlı çalışması için önemlidir. Ikinci gonad kol enjekte kararı iğne ve solucan yeniden pozisyonu ne kadar hızlı bağlıdır. Tüm süreci, ideal olarak 1-2 dakika daha az almalıdır. </li></ol></li><li> Aşamasından cam kapak çıkarın ve diseksiyon kapsamı üzerine yerleştirin. Doğrudan enjekte solucan üzerine M9 tampon 1μl (22mm KH 2 PO 4, 42mm, Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1mm MgSO 4) (Bu Halokarbon petrol yüzeyinin altında pipet daldırarak yol açabilir) uygulayın. Tampon solucan rehidrate; sonra agaroz ped yüzeyi yüzer. Bir solucan almak kullanarak normal bir plaka solucan aktarın. Agaroz ped, tampon ve solucanlar artık uymak çok doymuş hale kadar birkaç kez daha tekrar edilebilir. </li></ol> Transgenik seçimi <ol><li> Enjekte solucanlar, P 0 nesil, bireysel taze, bakteriyel numaralı seribaşı levhalar (60 mm) aktarılır ve üremek için izin verilir. Tipik olarak, enjekte edilen hayvanların yavrular ortaya çıkıncaya kadar 2-3 gün süreyle 20 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> F 1 yavrular floresan stereomikroskopta kullanarak transgenik marker (örneğin floresans) kanıt görülmektedir. Her floresan, taşıyıcı F 1, hayvan ayrı ayrı (her F 1 yavrulara ayrı bir hat kabul edilir) yeni bir plaka üzerine klonlanmış olduğunu. F 1 çift cinsiyetli, üremek için izin verilir . Yine, yavrular ortaya çıkıncaya kadar bu genellikle 20 ° C de 2-3 gün için yapılır. </li><li> F 2 nesil transgenik hayvanlar için de görülmektedir. F 2 hayvan miras ve transgenik dizi ifade &quot;istikrarlı&quot; bir çizgi olarak kabul edilir . NOT: F 1 styaşı birçok transgenik hayvanlar olabilir, ama onlar kararlı değildir. F 1 transgenik hayvanlar çoğunluğu F 2 istikrarlı hatları içine yayılır olmayacaktır. NOT: gen kopya sayısı değişkenliği kontrol etmek için, en az enjekte inşa başına üç bağımsız sabit hatları oluşturur . </li><li> Her bağımsız istikrarlı bir çizgi solucanlar ayrı bir çizgi olarak muhafaza edilmelidir. Her satır, her nesil yeni bir plaka birkaç transgenik hayvanlar transfer tarafından yayılan olabilir; seçilebilir marker floresan ise bu floresan stereomikroskopta kullanarak yapılmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Bu işlemi yaparken, hatırlamak önemlidir: - Gonad merkezi içine doğrudan enjekte - Çok fazla sıvı enjekte - Kuruma önlemek için hızlı bir şekilde çalışır. Çok büyük kırık gibi iğne ile ilgili sorunlar yaşarsanız, bu daha az ideal bir iğne ile enjekte etmeye çalışıyor yerine, taze bir iğne yeniden en iyisidir. Transgenik solucanlar nesil gibi birçok uygulama vardır: - Mutant genlerin belirlenmesi, dönüşüm kurtarma yöntemi denir - Kesilmiş proteinleri ifade ile protein etki haritalama ...

<table><tbody><tr><td>Agaroz</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Halokarbon Yağı, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lam örtüsü 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Lam örtüsü 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Lam örtüsü 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Kılcal boru</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>İğneler için Cam Kılcal Boru</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>İğne Çekici</td><td>Alet</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>microINJECTOR Sistemi</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Oküler, Tabla, Manipülatör</td></tr><tr><td>Diseksiyon, Floresan özellikli</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroenjeksiyon kararlı transgenik c. elegans Üretimi

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenik Caenorhabditis elegans gonad 1 DNA plazmid çözüm mikroenjeksiyon ile kolayca oluşturulabilir. Plazmid DNA, stabil bir şekilde olsa da gerçek kromozom 2 olarak aynı verimlilikle değil, miras alınır ekstrakromozomal concatamers oluşturmak için yeniden düzenler . Diseksiyon mikroskobu altında transgenik hayvanlar seçimi izin vermek, ilgi bir gen rol-6 ya da GFP gibi bariz bir fenotipik işaretleyici ile ortak enjekte edilir. Eksojen gen hücresel yerelleştirme çalışmaları için ana organizatörü ifade edilebilir. Alternatif olarak, transgen, bu belirli bir hücre ya da doku gen ürünü rolünü değerlendirmek için farklı bir doku-spesifik organizatörü tarafından sürülebilir. Bu teknikte verimli C. elegans germline ya da erken embriyo 3 hariç bütün dokularda gen ekspresyonu sürücüler. Transgenik hayvanlar oluşturulması, deneysel paradigmalar bir dizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu video transgenik solucanları oluşturmak için mikroenjeksiyon işlemi göstermektedir. Ayrıca, istikrarlı transgenik C. elegans hatları seçimi ve bakım açıklanmıştır.

Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenik Caenorhabditis elegans, bir DNA plazmit çözeltisinin gonad içine mikroenjeksiyonu yoluyla kolaylıkla oluşturulabilir. Plazmit DNA'sı şu şekilde yeniden düzenlenir...

Sea elegance, hem hücre soyaları hakkındaki bilgimiz hem de tüm genomunun dizilenmesi ve analiz edilmesiyle elde edilen bilgi zenginliği sayesinde inanılmaz derecede kullanışlı bir model organizmadır. Bu videoda, plazmidlerin sea elegance'a mikroenjeksiyon sürecini ve floresan mikroskobu kullanarak transgenik yavruların seçilmesini gösteriyoruz; şeffaf ve çok hücreli bir hayvan olan sea elegance, floresan işaretli proteinler eksprese eden transgenlerin in vivo olarak görselleştirilmesi için idealdir. Merhaba, benim adım Laura Berkowitz ve Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Caldwell Laboratuvarı'nda araştırma görevlisiyim.Ben de Alabama Üniversitesi, Calwell Laboratuvarı'ndan Adam Knight. Bugün sizlere, transgenik *C. elegans* üretmek için plazmid mikroenjeksiyonuna nasıl hazırlanacağını ve bu işlemin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim. Ayrıca, transgenik *C. elegans* hatlarının nasıl seçileceğini ve sürdürüleceğini göstereceğim. Haydi başlayalım.Mikroenjeksiyona başlamadan önce, şimdi size göstereceğim birkaç hazırlık adımı bulunmaktadır. İlk olarak, enjekte edilecek plazmit DNA'yı hazırlayın; hedef genimizin dokuya özgü ekspresyonunu kodlayan bir plazmit ve seçilebilir bir transformasyon markörü sağlayan ikinci bir plazmit olmak üzere iki plazmit gereklidir. Plazmitleri, mikrolitre başına 50 nanogram olacak şekilde bire bir oranda karıştırın.Sıradaki adım olarak, solucanları enjeksiyon için sabitlemek amacıyla kullanılacak olan auger pedlerini hazırlayın. Auger pedlerini yapmak için öncelikle tezgaha birkaç adet 22 x 50 milimetrelik lamellen yerleştirin. Bir pastör pipeti kullanarak bir lammelin üzerine bir damla eritilmiş %2 agroz yerleştirin ve hemen ardından ikinci bir lammeli, ilkine 90 derecelik bir açıyla gelecek şekilde damlanın üzerine koyun.Aerogelin birkaç saniye boyunca katılaşmasını bekleyin ve ardından üst örtü camını çıkarın. Yassılaşmış aerogel diskinin çapı 15 ile 20 milimetre arasında olmalıdır. Pedin, birkaç saat boyunca veya gece boyunca tamamen havada kurumasını bekleyin.Kuruduktan sonra, pedleri oda sıcaklığında bir lam kutusunda saklayın. Ardından, DNA çözeltisi için iğne yükleyicilerini hazırlayın. Bunun için, yüz mikrolitrelik bir kapiler tüp alın, tüpün orta kısmını açık alevde ısıtın ve hızla çekerek yaklaşık iki katı uzunluğa getirin.Kılcal tüp soğuduktan sonra, iki yarıyı kırarak ayırın. Enjeksiyon için 10 ila 20 adet iğne yükleyiciyi stoklayın. Bunları bir mikro santrifüj tüpünde dik konumda saklayabilirsiniz.Brack, dikkatli ol. İğne yükleyici uçları çok keskindir. Şimdi mikro enjeksiyon iğnelerini hazırla.Bu iğneler, içinde dahili bir cam filament bulunan özel bir kapiler tüpten yapılmıştır. Bu filament, DNA çözeltisi için bir fitil görevi görür. İğneleri üretmek için 24,8 ısı ayarına sahip bir Niki PP eight 30 Polar kullanıyoruz; depolama amacıyla aynı anda birkaç iğne çekilmektedir.Birden fazla iğne, bir şerit modelleme kiline monte edilebilir. Çekilmiş iğne ucunu açmak için küçük lamel cam parçaları kullanılacaktır. Bu parçalar, 18 by 18 milimetrelik bir lamel camın Kim wipe ile sarılıp birkaç parçaya ayrılana kadar nazikçe üzerine baskı uygulanarak hazırlanır.Yaklaşık üç çarpı dört milimetre boyutunda parçalar kullanın. DNA ve iğneleri hazırlamanın yanı sıra, yaklaşık 50 ila 100 adet uygun evredeki, enjekte edilecek her bir ekspresyon vektörü konstrüktü için ikişer adet wild type solucan hazırlayın.Artık mikroenjeksiyon mikroskobunu kurmaya hazırız. Mikroskobun kurulumuna başlamak için, mikroenjeksiyon iğne koluna ve tutucusuna bağlı olan helyum tankındaki ana valfi açın. Gazın hatta girmesini sağlamak için regülatörü kapatın.Basınç 35 PSI'a getirildikten sonra, gaz bir ayak pedalı kullanılarak tahliye edilebilir. Ardından, standart bir ağız pipetleyici tüpüne bir iğne yükleyici yerleştirin ve plazmit karışımından yaklaşık bir mikrolitre gibi küçük bir miktar damlatın. Şimdi, direnç hissedilene kadar yükleyiciyi mikroenjeksiyon iğnesinin tamamen içine yavaşça itin.DNA çözeltisini hafifçe üfleyerek boşaltın ve ardından yükleyiciyi çıkarın. DNA yüklendikten sonra, iğneyi küçük iç lastik contanın içine yerleştirmeye dikkat ederek mikroenjeksiyon koluna takın ve ardından manipülatör koluna sabitleyin. Sonra, bir kapak camı kırma parçasını bir vidalı pedin kenarına yerleştirin.Parçayı ve auger pedinin tüm yüzeyini halojen karbon yağı ile kaplayın. Ardından auger pedini bir ters mikroskobun tablasına yerleştirin. Auger pedi yerleştirildikten sonra, Forex objektif ve parlak alan aydınlatması kullanarak iğneyi görüş alanının merkezine konumlandırın, ancak iğneyi henüz yağın içine indirmeyin.Ardından, lamellek parçasının iç kenarını merkeze konumlandırın ve ona odaklayın. İğneyi, lamellek parçası ile aynı odak düzlemine gelecek şekilde yağın içine indirin. 40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın, ardından parçanın kenarına yeniden odaklanın ve gerekirse iğnenin ucunu yeniden konumlandırın.Şimdi enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın. Ayak pedalı aracılığıyla kısa bir gaz darbesi uygularken, aynı zamanda iğneyi lam parçasının kenarına hafifçe itin. İğnenin ucu yeterince kırılmış olacaktır.İğnenin ucundan, aşırı sıvı akışı nedeniyle küçük sıvı damlacıklarının sızması, hayvanları öldüreceği için istenmeyen bir durumdur. İğne hazır olduğunda mikroenjeksiyona başlarız. Ardından, iğneyi yukarı kaldırarak auger pedini sahneden çıkarın.Ancak X veya Y ekseni konumunu değiştirmeyin. Sahneyi iğnenin altından kaydırarak dışarı çıkarın. Auger pedini çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin.Bir solucanı, yağ yüzeyinin altındaki pedin üzerine transfer edin. Solucan kıvranırsa, auger pedi ile temas edene kadar onu nazikçe okşayın; nemli solucan kuru agroya yapışmalıdır. Auger pedi, solucanı görüş alanının merkezine gelecek şekilde hızla tekrar sahne üzerine yerleştirin.Ardından iğneyi, solganla aynı odak düzlemine indirin. Ters mikroskoptaki filtreleri Hoffman aydınlatmasına getirin. Bu kontrast filtresi, solganın morfolojik detaylarının görünür hale gelmesini sağlar.40x objektif kullanarak, solucan gonadının germ çekirdeklerinin petek deseninin altında kalan granüllü duyusal merkezine odaklanın. Solucanın iğneye bakan tarafında konumlanmış olan herhangi bir gonadı seçin. İğnenin ucu da odaklanana kadar iğnenin konumunu hassas bir şekilde ayarlayın.İğneyi nazikçe gonadın merkezine yerleştirin ve gonad koluna bir veya iki damla DNA göndermek için kısa bir gaz basıncı uygulayın. Çokça pratik ve beceriyle, sıvının distal gonad boyunca yayılan bir dalgasını gözlemlemelisiniz. Gonad merkezini her seferinde isabetle vurabilirsiniz.Bir solucana enjeksiyon yaparken hızlı çalışmanın önemli olduğunu unutmayın. Çünkü solucan kolayca kuruyabilir. Tüm işlem ideal olarak bir ila iki dakikadan kısa sürmelidir.Enjeksiyon tamamlandığında, auger pedini sahneden kaldırın ve bir diseksiyon mikoskobuna yerleştirin. Enjekte edilen solucanağa doğrudan bir mikrolitre M9 tamponu uygulayın. Bu işlem, pipet ucunun halo karb yağı yüzeyinin altına daldırılmasını gerektirebilir.Tampon çözelti solucanı yeniden nemlendirmeli ve böylece solucan aeros ped yüzeyinden ayrılıp yukarı çıkacaktır; solucanı bir solucan toplama çubuğu kullanarak standart bir plakaya aktarın. Şimdi, enjekte edilen solucanları Adam'a devredeceğim ve o da bize transgenik hatların seçimi ve sürdürülmesini gösterecek. Enjekte edilen solucanlar, taze ekilmiş bireysel 60 milimetrelik plakalara aktarılır ve üremelerine izin verilir.Bu solucanlar P sıfır neslini temsil eder. Genellikle enjekte edilen hayvanlar, yavrular ortaya çıkana kadar 20 °C'de iki ila üç gün inkübe edilir. Yavrular göründüğünde, transgenik solucanlar için taramaya başlamaya hazırız.F1 dölü, transgenik belirteç kanıtları açısından gözlemlenir. Bu durumda, seçilebilir belirteç floresan özelliktedir, bu nedenle floresan stereo mikroskop kullanarak tarama yapabiliriz. Floresan taşıyıcı olan her bir F1 hayvanı, ayrı ayrı yeni bir plakaya klonlanır.Enjekte edilen P sıfır, tüm F1 yavruları arasında yalnızca bir ila beş floresan yavrular üretebilir. F1 hermafroditlerinin, yavrular görünene kadar 20 °C'de iki ila üç gün boyunca üremesine izin verin. F iki nesli hazır olduğunda, onlar da transgenik hayvanlar açısından gözlemlenir. Transgenik bir markörü miras almış ve eksprese etmiş olan F iki hayvanları, stabil bir hat olarak kabul edilir.Her bir bağımsız stabil hat, ayrı bir solucan hattı olarak korunmalı ve her nesilde birkaç transgenik hayvan yeni bir plakaya aktarılarak her hat çoğaltılmalıdır. Bu işlem floresan stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Seçilebilir marker floresan ise, gen kopya sayısındaki değişkenliği kontrol etmek için, enjekte edilen konstrükt başına en az üç bağımsız stabil hat oluşturun.Ekspresyon vektör konstrüktlerinin nasıl mikroenjekte edileceğini, nasıl seçileceğini ve stabil hatların nasıl belirleneceğini gösterdik. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için...

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.

Gonad Mikroenjeksiyonu: C. elegans'ın Germ Hattına Doğrudan Bileşik Verme Yöntemi

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Öğrenin, C. elegans gonadına mikroenjeksiyon yaparak transgenik hayvanlar nasıl üretilir. Bu yöntem, floresan mikroskopi ile gen ekspresyonunun canlı görüntülenmesini sağlar.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Daha fazla video keşfet