Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Deniz zarafeti, hem hücre soyları hakkındaki bilgimiz hem de tüm genomunu dizileyip analiz etmekten üretilen bilgi zenginliği nedeniyle inanılmaz derecede faydalı bir model organizmadır. Bu videoda, şeffaf ve çok hücreli bir hayvan olarak floresan mikroskobu kullanarak deniz zarafetine mikro plazmitlerin mikro enjekte edilmesi sürecini ve transgenik yavruların seçimini gösteriyoruz, deniz zarafeti, floresan etiketli proteinleri in vivo olarak ifade eden transgenleri görselleştirmek için idealdir. Merhaba, benim adım Laura Berkowitz ve Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Caldwell Laboratuvarı'nda araştırma görevlisiyim.

Ve ben Adam Knight, aynı zamanda Alabama Üniversitesi'ndeki Calwell Laboratuvarı'ndan. Bugün size transgenik deniz zarafeti oluşturmak için Plasmin Mikroenjeksiyonuna nasıl hazırlanacağınızı ve uygulayacağınızı göstereceğim ve size transgenik conta zarafet çizgilerini nasıl seçeceğinizi ve koruyacağınızı göstereceğim. Öyleyse başlayalım.

Mikroenjeksiyona başlamadan önce, şimdi size göstereceğim birkaç hazırlık adımımız var. İlk olarak, enjekte edilecek plazmit DNA'sını hazırlayın, biri ilgilendiğimiz genin dokuya özgü ekspresyonunu kodlayan ve ikincisi seçilebilir bir dönüşüm belirteci sağlayan iki plazmit gereklidir. Plazmitleri mikrolitre başına 50 nanogramlık bire bir oranda karıştırın.

Her birbiriyle, solucanları enjeksiyon için hareketsiz hale getirmek için kullanılacak burgu pedleri hazırlayın. Burgu pedlerini yapmak için önce tezgahın üzerine birkaç adet 22 x 50 milimetrelik kapak camı yerleştirin. Bir mera pipeti kullanarak, bir kapak camına bir damla eritilmiş %2 agros koyun ve hemen ikinci bir kapak camını damlanın üzerine, birinciye 90 derecelik bir açıyla yerleştirin.

Aeronun birkaç saniye katılaşmasına izin verin ve ardından üst kapak camını çıkarın. Düzleştirilmiş aero diskinin çapı 15 ila 20 milimetre arasında olmalıdır. Bir evcil hayvan gibi, pedin birkaç saat veya gece boyunca tamamen kurumasına izin verin.

Kuruduktan sonra, pedleri oda sıcaklığında bir kapak cam kutusunda saklayın. Ardından, iğne yükleyicileri DNA çözeltisi için hazırlayın. Bunu yapmak için, yüz mikrolitrelik bir kılcal boru alın ve açık bir alevin ortasında ısıtın ve hızla uzunluğunun yaklaşık iki katına kadar çekin.

Kılcal boru soğuduktan sonra, iki yarıyı birbirinden ayırın. Enjeksiyon için 10 ila 20 iğneli yükleyici stoklayın. Bunları bir mikro santrifüj tüpünde dik olarak saklayabilirsiniz.

Brack, dikkatli ol. İğne yükleyici noktaları çok keskindir. Şimdi mikro enjeksiyon iğnelerini yapın.

Bu iğneler, dahili bir cam filament içeren özel bir kılcal borudan yapılmıştır. Bu filament, DNA çözeltisi için bir fitil görevi görür. İğneleri yapmak için bir Niki PP sekiz 30 Polar kullanıyoruz 24.8 ısı ayarı ile, saklama için bir seferde birkaç iğne çekilir.

Bir modelleme kili şeridi üzerine birden fazla iğne monte edilebilir. Çekilen iğne ucunu kırmak için küçük kapak camı parçaları kullanılacaktır. Bu parçalar, 18 x 18 milimetrelik bir kapak camının bir Kim mendiline sarılması ve birkaç parçaya ayrılana kadar hafifçe basınç uygulanmasıyla hazırlanır.

Yaklaşık üç x dört milimetre boyutunda parçalar kullanın. DNA ve iğneleri hazırlamaya ek olarak, uygun şekilde hazırlanmış yaklaşık 50 ila 100 tane hazırlayın. Her bir ifade vektör yapısı için iki vahşi tip solucan enjekte edilecektir.

Artık mikroenjeksiyon mikroskobunu kurmaya hazırız. Mikroskobu kurmaya başlamak için, mikroenjeksiyon iğne koluna ve tutucusuna bağlı olan helyum tankındaki ana valfi açın. Gazın hatta girmesine izin vermek için regülatörü kapatın.

Basıncı 35 PSI'ye getiren gaz, bir ayak pedalı kullanılarak serbest bırakılabilir. Daha sonra, standart bir ağız pipetleyici hortumuna bir iğneli yükleyici yerleştirin ve az miktarda plazmit karışımını yaklaşık bir mikrolitre bırakın. Şimdi yükleyiciyi, direnç hissedilene kadar mikroenjeksiyon iğnesinden yavaşça geçirin.

DNA solüsyonunu hafifçe üfleyerek dışarı atın ve ardından yükleyiciyi çıkarın. DNA yüklendikten sonra, iğneyi mikroenjeksiyon koluna yerleştirin, küçük iç lastik contanın içine yerleştirmeye dikkat edin ve ardından manipülatörün koluna sıkıştırın. Ardından, bir burgu pedinin bir kenarına iğne kıran bir kapak camı parçası yerleştirin.

Parçayı ve burgu pedinin tüm yüzeyini yadigar karbon yağı ile kaplayın. Ardından burgu pedini ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına yerleştirin. Burgu pedi yerleştirildikten sonra, Forex objektifini ve parlak alan aydınlatmasını kullanarak iğneyi görüntüleme alanının ortasına yerleştirin, ancak henüz yağın içine indirmeyin.

Ardından, kapak camı parçasının iç kenarını merkeze yerleştirin ve ardından üzerine odaklanın. İğneyi yağın içine indirin ve kapak camı parçasıyla aynı odak düzlemine getirin. 40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın, ardından parçanın kenarına yeniden odaklanın ve gerekirse iğnenin ucunu yeniden konumlandırın.

Şimdi enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın. İğneyi kapak camı parçasının kenarına doğru nazikçe itin ve aynı zamanda ayak pedalı ile kısa bir gaz darbesi uygulayın. İğne yeterince kırılarak açılacaktır.

Küçük sıvı damlacıkları iğnenin ucundan kaçtığında, çok büyük olması nedeniyle fazla sıvı akar, hayvanları öldüreceği için bir açıklık arzu edilmez. İğne hazır olduğunda mikroenjeksiyona başlıyoruz. Ardından, iğneyi yukarı kaldırarak burgu pedini sahneden çıkarın.

Ancak X veya Y ekseni konumunu değiştirmeyin. Sahneyi iğnenin altından dışarı kaydırın. Burgu pedini çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobuna yerleştirin.

Yağ yüzeyinin altındaki pede bir kelime aktarın. Solucan kıvrılırsa, burgu pedine temas edene kadar hafifçe okşarsa, nemli solucan kuru agroya yapışmalıdır. Burgu pedini hızlı bir şekilde sahneye geri yerleştirin ve solucanı görüş alanında ortalayın.

Ardından iğneyi solucanla aynı odak düzlemine indirin. Ters çevrilmiş dürbün üzerindeki filtreleri Hoffman aydınlatmasına geçirin. Bu kontrast filtresi, solucanın morfolojik detaylarının görünür hale gelmesini sağlar.

40 x objektifi kullanarak, germ çekirdeğinin bal peteği deseninin altındaki solucan gonadının grenli duyusal merkezine odaklanın. Solucanın iğneye bakan tarafında hangi gonadın konumlandırıldığını seçin. İyi. Uç da odakta olana kadar iğnenin konumunu ayarlayın.

İğneyi nazikçe gonadın ortasına yerleştirin ve bir veya iki damla DNA'yı gonad koluna atmak için kısa bir gaz basıncı darbesi uygulayın. Çok fazla pratik ve beceri ile distal keçi boyunca yayılan bir sıvı dalgasını gözlemlemelisiniz. Her seferinde keçi merkezine vurabilirsiniz.

Bir solucan enjekte ederken hızlı çalışmanın önemli olduğunu unutmayın. Kolayca kuruyabileceği için. Tüm süreç ideal olarak bir ila iki dakikadan az sürmelidir.

Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, burgu pedini sahneden çıkarın ve bir diseksiyon dürbünü üzerine yerleştirin. Bir mikrolitre M dokuz tamponu doğrudan enjekte edilen solucanın üzerine uygulayın. Bu, pipet ucunun halo karbonhidrat yağının yüzeyinin altına daldırılmasını gerektirebilir.

Tampon solucanı yeniden sulandırmalı ve daha sonra aeros ped yüzeyinden yüzecek, solucanı bir solucan penası kullanarak normal bir plakaya aktaracaktır. Şimdi enjekte edilen solucanları Adam'a vereceğim ve o bize transgenik hatların seçimini ve bakımını gösterecek. Enjekte edilen solucanlar, tek tek taze tohumlanmış 60 milimetrelik plakalara aktarılır ve çoğalmalarına izin verilir.

Bu solucanlar P sıfır neslini temsil eder. Tipik olarak enjekte edilen hayvanlar, yavrular ortaya çıkana kadar iki ila üç gün boyunca 20 santigrat derecede kuluçkaya yatırılır. Yavrular ortaya çıktığında, transgenik solucanları taramaya başlamaya hazırız.

F1 yavruları, transgenik işaretleyicinin kanıtı için gözlenir. Bu durumda, seçilebilir işaretleyici floresandır, bu nedenle floresan stereo mikroskop kullanarak tarama yapabiliriz. Her floresan taşıyıcı F1 hayvanı ayrı ayrı yeni bir plakaya klonlanır.

Enjekte edilen P sıfır, tüm F1'leri arasında yalnızca bir ila beş floresan yavru üretebilir. F1 hermafroditlerinin, yavrular ortaya çıkana kadar iki ila üç gün boyunca 20 derecede üremesine izin verin. F iki nesil hazır olduğunda, transgenik hayvanlar için de gözlemlenirler. F Transgenik bir markörü miras alan ve eksprese eden iki hayvan, stabil bir çizgi olarak kabul edilir.

Her bağımsız kararlı hat, ayrı bir solucan hattı olarak korunmalı, her nesilde birkaç transgenik hayvanı yeni bir plakaya aktararak her bir hattı çoğaltmalıdır. Bu, floresan stereo mikroskop kullanılarak yapılmalıdır. Seçilebilir işaretleyici, gen kopya sayısındaki değişkenliği kontrol etmek için floresan ise, enjekte edilen yapı başına en az üç bağımsız kararlı çizgi oluşturun.

Az önce size ifadeyi, vektör yapılarını nasıl mikro enjekte edeceğinizi ve elganı nasıl göreceğinizi ve kararlı çizgileri nasıl seçeceğinizi gösterdik. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.