MODS tüberküloz tanısı için yöntem ve dirençli tüberküloz ilaca

Dünyadaki her üç kişiden biri tüberküloz ile enfekte. Aktif tüberküloz teşhisi yeni enfeksiyonları önler, çünkü aktif tüberkülozlu hastalar, tedavi edildikleri veya öldükleri zamana kadar yılda 10 ila 15 kişiyi enfekte etmeye devam edecektir. Mods, mikroskobik gözlem, ilaç duyarlılık testi demek zorunda kalmamak için kullandığımız bir kısaltmadır ve buna neden denildiği, metodoloji açıklandıkça ortaya çıkacaktır.

Kısa videoda, tüberküloz ve çoklu ilaca dirençli tüberkülozun hızlı ve ucuz teşhisi için mods metodolojisini özetleyeceğiz. Video, metodolojiyi adım adım ortaya koyacaktır. Sıvı kültürle çalışmanın biyogüvenlik etkilerini tartışacağız ve ayrıca bu metodolojinin kullanımı için gerekli olan bazı önemli kalite güvence konularını açıklayacağız.

Mod testi, Peru'nun Lima kentindeki Kayana Üniversitesi'nde Bob Gilman'ın laboratuvarında geliştirildi. Başlangıçta gevşek cavi tarafından yapılan gözlemlerin ardından. LOOSE, kolorimetrik göstergeler kullanarak kültürlerde mikobakteri tüberkülozunu tespit etmenin hızlı yollarını belirlemeye çalışıyordu.

Ancak, bu kültürlerin mikroskop altında gözlemlenmesinin, Kolormetrik göstergelerin renk değiştirmesinden birkaç gün önce mikrobakterilerin büyümesinin varlığını ortaya çıkardığını ve MOD'un testinin geliştirildiği bu gözleme dayandığını belirtti. MOD'un testi, kaynak sınırlı bir ortamda geliştirilmiştir ve kaynak sınırlı ayarlarda hedeflenmiştir, bu nedenle TB'nin sıvı kültür tabanlı tespiti ve çoklu ilaç direnci tespiti için test başına 3'ün biraz altındadır. Son derece çekici ve ilk kez kaynakların sınırlı olduğu yerlere bu tür bir teşhis kapasitesi getiriyor.

Dolayısıyla mod tahlili üç temel ilkeye dayanmaktadır. Birincisi, mycobacterium tuberculosis'in sıvı ortamda, katı ortamda olduğundan çok daha hızlı büyümesidir. Bu uzun yıllardır bilinen bir gerçektir.

İkincisi, bu sıvı ortamları mikroskop altında gözlemlersek, myb tüberkülozunun büyümesini, katı ortamdaki kolonilerin makroskopik görünümünü beklemekten çok daha hızlı bir şekilde tespit edebiliriz. Ve aslında, bu büyüme tamamen karakteristiktir, öyle ki sıvı ortamdaki M tüberkülozunu bakteri veya mantar kontaminasyonundan veya gerçekten de mevcut olabilecek atipik tüberküloz olmayan mikobakterilerin büyümesinden ayırt edebiliriz. Son olarak, ve bu belki de mod tahlili ile ilgili en heyecan verici şey, ilaçları rifampisin ve dolayısıyla çoklu ilaç direncini doğrudan balgamdan dahil edebilmemizdir.

Bu ilaçları testin başlangıcında kullanarak, hem tüberkülozu hem de izolatın bu iki ilaca dirençli olup olmadığını aynı anda tespit edebiliriz. Bu da alt kültüre olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve dolaylı bir ilaç duyarlılık testi oluşturur. Şimdi sadece mod tahlilini yapmak için gereken ekipmanı ana hatlarıyla belirteceğiz.

Hazırlanan medyayı saklamak için bir buzdolabına ihtiyaç vardır. Is ve Rifampin'i tartmak için bir terazi gereklidir. Balgamın karıştırılması için bir girdaba ihtiyaç vardır.

Dekontaminasyon çözeltisi ile, dekontamine balgam örneğini konsantre etmek için santrifüj gereklidir ve bu, 3000 G'ye ulaşabilmelidir. Santrifüj kovalarının kilitlenebilir kapaklarla kapatılabilmesini gerektiren mikobakteriyel çalışma için. 37'ye ulaşabilen ve 37 santigrat dereceyi koruyabilen bir inkübatör gereklidir.

Bunun CO2 ile zenginleştirilmiş olması gerekmez. Mod plakalarını okumak için ters çevrilmiş bir mikroskop gereklidir ve bunun dört x ve 10 x hedefleri olmalıdır ve ortamı sterilize etmek için otoklav gereklidir ve ayrıca mikrobakteri kültürünün atılması için, ortamda alikot için atık mikroplar gereklidir, biyolojik bir güvenlik kabini. İkinci sınıf, balgam örneklerinin manipülasyonunu ve plakaların aşılanmasını içeren prosedürler için gereklidir.

Mods testini gerçekleştirmek için gerekli reaktifler aşağıdaki gibidir, Middlebrook yedi H dokuz medya cascione ve antibiyotik takviyesi olan gliserol Panta ve OADC. Antibiyotiklerin besin takviyesi stokları ve Rifampin dimetil sülfoksit, balgam dekontaminasyonu için rifampisin, sodyum hidroksit, sodyum sitrat ve nil sistein hazırlanması için DMSO, fosfat tamponunun hazırlanması için sodyum fosfat ve mono potasyum fosfat, enfekte atıkların atılması için %10 sodyum hipoklorit ve çalışma yüzeylerinin temizlenmesi için dezenfektandır. Aşağıdaki plastikler ve sarf malzemeleri de gereklidir: steril cam tüpler, sulu çözücüler için 0.2 mikrometre filtreler ve organik çözücüler için 0.2 mikrometre filtreler, mikro santrifüj tüpleri, 15 mil santrifüj tüpleri, steril 50 mililitre, 10 mililitre serolojik peppes, peppes geçmiş steril mikropipet uçları, 24 kuyulu doku kültürü tipi plakalar ve sızdırmaz Ziploc tipi ine torbalar, balgam numunesi ortama aşılandıktan sonra 24 oyuklu plakanın yerleştirildiği torbalardır.

Önceden hazırlanabilecek dört grup stok çözümü vardır. Fosfat tampon Çözeltisi, 6.8 artı veya eksi 0.2 pH'a ayarlanmış sodyum fosfat, diba ve potasyum fosfat mono bazik çözeltilerinin bir kombinasyonundan yapılır. Bu çözelti, sterilize etmek için 15 dakika boyunca 121 ila 124 santigrat derecede otoklavlanır ve steriliteyi doğrulamak için besleyici agar üzerinde bir alikot kültürlenir.

Bu, buzdolabında bir aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklanabilir. Her balgam numunesi 10 mililitre Fosfat tampon çözeltisi gerektirir. Balgam dekontaminasyonu için stok çözelti, bir sodyum hidroksit sodyum sitrat kombinasyonudur.

Bu çözeltiler eşit hacimlerde birleştirilir ve 121 ila 124 santigrat derecede 15 dakika boyunca otoklavda birleştirilir ve ayrıca buzdolabında bir aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklanabilir. Her balgam numunesi için bu çözeltiden iki mililitre gereklidir. Temel kültür ortamı, kasion ve gliserol ile Middlebrook yedi H dokuzdan oluşur.

Yedi H dokuz tozu, gliserol ve kascion içeren steril damıtılmış su içinde çözülür ve tamamen eriyene kadar sürekli çalkalama ile karıştırılır. Bu ortam, 15 dakika boyunca 121 ila 124 santigrat derecede otoklavlanır ve soğuduktan sonra steril 16 x 100 milimetre cam tüplerde 4,5 mililitrelik kuatlara bölünür. Ortam, steriliteyi doğrulamak için 48 saat boyunca 37 derecede inkübe edilir, bu süreden sonra bulanıklık eksikliği ile gösterilir ve kapak bir aya kadar sıkıca kapalıyken iki ila sekiz santigrat derecede saklanabilir.

Her balgam örneği, bu kültürden 4.5 mililitre içeren bir tüp gerektirir. Orta antibiyotik stok çözeltileri aşağıdaki gibi hazırlanır, steril distile suda tamamen çözülür ve sulu çözücüler için 0.2 mikrometre şırınga filtresi ile süzülür. 20 mikrolitrelik alikotlar daha sonra steril mikro santrifüj tüplerinde eksi 20 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir; Her biri yüz numuneye kadar 20 mikrolitre alikot yeterlidir.

Mil başına sekiz miligramlık rifampin stok çözeltileri, rifampisinin DMSO ve steril damıtılmış su içinde çözülmesiyle hazırlanır. Bu karışım, organik çözücüler için 0.2 mikrometrelik bir şırınga filtresi ile filtrelenir ve çözelti, steril mikro santrifüj tüplerinde eksi 20 santigrat derecede 20 mikrolitrelik alikotlarda saklanabilir, her biri altı aya kadar, 20 mikrolitrelik alikot yeterlidir 100 numuneye kadar. Şimdi metodolojinin kendisinin bir kısmına ve işlem gününde atmanız gereken üç adıma geliyoruz.

Bu, stok çözeltilerini çalışan çözümlere dönüştürüyor. Önce dekontaminasyon solüsyonumuz var, sonra medya solüsyonumuz var. Ve son olarak, ilaçların çalışma solüsyonları isen ve Rifampin'dir.

Mods metodolojisi için kullanılan dekontaminasyon yöntemi, standardize edilmiş sodyum hidroksit nalk dekontaminasyon metodolojisidir. Nalk, balgamın sindirilmesine yardımcı olan ve sodyum hidroksitin dekontaminasyonu yapmasına izin veren bir mukolitiktir. Bunun için sodyum hidroksit sodyum sitrat stok solüsyonumuza ihtiyacımız var ve bu solüsyonun 20 ml'sine 0.1 gram NA ekleniyor.

Hazırlandığı gün kullanılmayan herhangi bir çözelti atılmalıdır. Kültür ortamının son hazırlığı da sadece kullanım gününde yapılmalıdır. Depolanan yedi H dokuz ortam OADC ve panta ile birleştirilir, 4.5 mililitre ortam her tüpte 0.5 mililitre OADC ve 0.1 mililitre Panta ile birleştirilir.

Bu bir numune için yeterlidir. Her ilacın çalışma solüsyonları kullanım gününde hazırlanır ve kullanılmayan solüsyonlar atılmalıdır çünkü aktivite garanti edilemez, saklanan alikotlar 24 derecede seyreltilir. Kuyu doku kültürü plakaları, ortam ile seri olarak yedi H dokuz oh A DC ile, öyle ki, ortam ile balgam numunesi eklendikten sonra elde edilen son kuyu konsantrasyonu, mil forik asit başına 0.4 mikrogram ve Rifampin için mil başına bir mikrogramdır.

Dekontaminasyon işlemine geçildikten sonra, iki mil balgam numunesi konik bazlı bir Falcon tüpüne yerleştirilir ve ardından iki mil sodyum hidroksit süt Dekontaminat solüsyonu eklenir. Kapak değiştirilir ve sıkıca vidalanır, ardından süspansiyon girdap haline getirilir ve 15 dakika bekletilir, bu süre zarfında dekontaminasyon prosedürü gerçekleşir. Bu sürenin sonunda 14 mililitre fosfat tampon çözeltisi eklenir.

Kapak değiştirilir ve sıkıca vidalanır ve tüp 3000 G'de 50 dakika sonra santrifüje yerleştirilir, S süpernatantı boşaltılır ve kalan pelet, yedi H dokuz OEDC panterinin 5.1 mililitrelik tüplerini kullanarak plakalamak istediğimiz numunedir. Peletimiz yaklaşık iki mililitrelik bir hacme yeniden süspanse edilir. Bu yeniden askıya alınan numunenin yarısı, bir mikro santrifüj tüpünde yedek olarak saklanır.

Bu, kültürümüzün kontamine olması ve numuneyi tekrar plakalamamız gerekmesi durumunda kullanılabilir. Diğer mililitre, cam tüpümüzde bulunan kalan yedi H dokuz oh a DC pantere eklenir ve bu, kaplamaya hazır olan örneğimizdir. Bu ortam ve numune süspansiyonunun 900 mikrolitresi, 24 oyuklu bir plakanın bir sütunundaki dört kuyucuğun her birine yerleştirilir.

24 oyuklu plakanın kalan oyukları, beş numune, beş sütunun her biri için bir tane olmak üzere 24 oyuklu bir plakayı dolduracak şekilde müteakip numunelerle doldurulur ve altıncı kolon numunesiz bırakılır. Altıncı sütun, bu sütuna negatif bir kontrol görevi görür. Tüm medya bileşenlerine balgam örneği olmadan yerleştirilmiştir ve bu sütundaki herhangi bir büyüme, çapraz kontaminasyonla ilgili bir sorunumuz olduğunu ve tüm plakanın atılması gerektiğini açıkça göstermektedir.

Çalıştırdığımız her plaka bir negatif kontrol sütunu gerektirir. Şimdi tüm numunelerimizi ve medyamızı içeren plakamız var. Antibiyotik süspansiyonlarımızı ayrı bir plakaya eklemeliyiz.

Daha önce Rifampin ve Isid için tarif edildiği gibi seyreltmelerimizi hazırladık ve dört kanallı bir çoklu PET ile bu kuyucukların her birinden 100 mikrolitre topluyoruz ve iki kontrol kuyusunun her birine 100 mikrolitre yedi H dokuz OADC ve iki ilaç içeren kuyucuğun her birine 100 mikrolitre Rifampin ve 100 mikrolitre isid dağıtıyoruz. Plaka tamamlandıktan sonra kapak değiştirilir ve içine yerleştirilir. Bu noktadan itibaren bir Ziploc torba torba tekrar açılmaz ve bu nedenle sıvı ortamda büyüyen herhangi bir kültür asla torbayı terk etme fırsatına sahip olmaz.

Plakanın bundan sonraki tüm okumaları torba içinde yapılır ve torba otoklav torbasına yerleştirilir ve kültür sonunda atılır. Ve bu şekilde, mikobakterilerin yüksek konsantrasyonlu süspansiyonlarının manipülasyonundan kaçınırız. Şimdi kalite kontrol hakkında birkaç kelime söyleyeceğiz.

Mods metodolojisinde, tahlilin doğru kullanımı için gerekli olan dahili kalite kontrolleri vardır. Her şeyden önce, negatif kontroller var ve bunlar her bir plakada çalıştırılıyor. Bunlardan daha önce bahsedilmişti, ancak özet olarak, bir plaka üzerinde diğer beş balgam örneğinin yanı sıra bir balgam örneği olmadan tüm medya bileşenlerini içeren bir sütunumuz var, sütundaki kuyular da diğer kuyular gibi incelenmelidir ve bu kuyularda herhangi bir büyümenin varlığı, çapraz kontaminasyonun gerçekleştiğini ve bu nedenle plakadaki sonuçların hiçbirine güvenilemeyeceğini gösterir.

Bu nedenle plaka atılmalı ve tüm numuneler yeniden kaplanmalıdır. Ek olarak, pozitif kontroller olan iç kontroller vardır. Bunlar ayrı bir plaka üzerinde çalıştırılır ve bu plaka, laboratuvar içinde çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için günün sonunda diğer tüm numune plakaları hazırlandıktan sonra hazırlanır.

Bu ayrı plakada, tamamen duyarlı bir mikobakteri tüberkülozu suşu ve isid ve rifampisine dirençli bir suşu çalıştırıyoruz. Bir plaka üzerinde çoklu ilaca dirençli bir suşun çalıştırılmasıyla ilgili endişeler varsa, bu iki duyarlı ve MDR suşunun yerine mono dirençli bir suş olmadan bir rifampin mono dirençli suş çalıştırılabilir. Bu suşların amacı, sadece medyanın büyümeyi desteklediğini göstermek değil, bu nedenle tüm pozitif kontrollerimizin ilaçsız zenginlikte büyümeye sahip olması gerektiğini, aynı zamanda ilaç konsantrasyonlarımızın doğru olduğunu ve bu nedenle duyarlı pozitif kontrollerin is ve Rifampin varlığında büyümemesi gerektiğini ve dirençli pozitif kontrollerin plakada bulunan Rifampin konsantrasyonları yoluyla büyümesi gerektiğini göstermektir.

Tamam, şimdi tabak okumaya geçelim. Numune alma cihazlarımızdan kaplama gününü kabul edersek, sıfırıncı gün plaka okuması beşinci günde başlar. Bundan önce, mikobakteri üremesi çok nadiren görülür.

Plaklar ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında incelenir. Yani, plakalar aşağıdan yukarıya doğru incelenir ve bu, kordonları çok net bir şekilde görmemizi sağlar, kültürleri yukarıdan görselleştirmeye çalışmak, plakaların kapağındaki yoğunlaşma nedeniyle engellenir ve ayrıca odak uzaklığı standart bir mikroskop için yeterli değildir. Mikroskobik inceleme genellikle, her iki ilaçsız kuyucukta en az iki koloni oluşturan birimin bulunduğu 10 x objektif pozitif kültür ile yapılır.

Kontaminasyonun varlığı kolayca fark edilir, çünkü ortam bulanıklaşır ve beşinci güne kadar genellikle kuyunun çoğunda aşırı büyüme olur. Buna karşılık, mikobakteri büyümesi, mikobakterilerin iyi başlangıçtaki büyümesinin, karakteristik akorlar veya karışıklıklar oluşturmak için sürekli olarak ilerleyen küçük virgül benzeri formlar oluşturması durumunda bir bulanıklığa yol açmaz. İki hafta içinde, güçlü bir pozitif büyüme, kordonların yalnızca ekstremitelerde gerçekten görülebildiği mikobakteri kümeleri oluşturmuş olacaktır.

Pozitif hale gelecek kültürlerin büyük çoğunluğu 14. güne kadar pozitiftir ve bu nedenle beşinci günden 14. güne kadar günlük okumalar yapılmasını ve daha sonra laboratuvar iş yüküne göre her iki veya üç günde bir okumalar yapılmasını öneririz. Her iki ilacın varlığındaki herhangi bir büyüme, o ilaca karşı direnci gösterir. İlacın kuyucuk içeren bölgesi, ilaçsız kuyucuklarda pozitif bir kültür kaydedildikten sonra bir haftadan daha uzun bir süre sonra yapılırsa, ara sıra atılım büyümesi görüldüğünden, bunun direnci temsil etmeyebileceğini not etmek çok önemlidir.

Bir kültür negatifse okumalar 21. günde durabilir, çünkü bu süreden sonra tedavi almayan hastalarda pozitif kültürlere asla rastlanmaz 21 günlük inkübasyonun tamamlanmasının ardından kültürler atılabilir. Kültürler Ziploc torbalarında kalır ve otoklav torbalarına ve otoklava 121 ila 124 santigrat derecede 45 ila 60 dakika boyunca yerleştirilir, daha sonra güvenli bir şekilde atılabilirler. Şimdi biyogüvenlik ve mod tahlili hakkında birkaç kelime söyleyeceğim çünkü modları sadece Peru'da değil, aynı zamanda Afrika ve Asya'daki ortamlarda da kullanıma sunuyoruz.

Sıvı ortamlarda mikrobakteriyel kültürlerin kullanılmasının güvenliği ve biyogüvenliği hakkında tekrarlayan bir soru ortaya çıkmaktadır. Bu anlaşılabilir bir korkudur, çünkü açıkçası sıvılar dökülebilir ve katı ortamlar bu riski taşımaz ve ayrıca mikobakteri süspansiyonları ile uğraşırken aerosolizasyon riski vardır. Aslında tam da bu nedenlerden dolayı, mod metodolojisinin dolaylı ilaç duyarlılık testi gerektiren herhangi bir metodolojiden daha güvenli bir metodoloji olduğuna inanıyoruz.

Bunun nedeni, dolaylı duyarlılık testi için, bilinen bir mikrobakteri konsantrasyonunun bir süspansiyonunun hazırlanmasıdır. Bu nedenle bu, yüksek konsantrasyonlu mikrobakteri çözeltilerinin manipülasyonunu ve buna eşlik eden tüm dökülme ve aerosolizasyon risklerini içerir. Buna karşılık, mods metodolojisi, şimdi göreceğiniz gibi, basitçe bir balgam örneğinin tabağımıza aşılanmasını ve ardından plakanın plastik bir torba içinde kapatılmasını içerir.

Bu çanta bir daha asla açılmaz ve bu nedenle bu yüksek konsantrasyonlu süspansiyonlarla uğraşmak zorunda kalmayız. Bu, mod metodolojisinin tamamen güvenli olduğuna inandığımız anlamına gelmez: mikobakterileri işlemek her zaman bir risk taşır. Bununla birlikte, 2006'da yayınlanan Kore verileri, modların başka herhangi bir kültürü kaplamaktan daha tehlikeli olmadığı yönündeki konumumuzu haklı çıkarmış gibi görünüyordu.

Bu, laboratuvar çalışanlarında yapılan bir çalışmaydı ve bu, kültürleri inceleyen ve ilaç duyarlılık testi için hiçbir sorumluluğu olmayan laboratuvar çalışanlarına yönelik mesleki risklerin, balgam yayma mikroskobu yapanlardan daha büyük olmadığını gösterdi. Buna karşılık, mikobakterilerin süspansiyonlarını ele alan ve ilaca duyarlılık testi yapanlar, tüberküloz için çok daha yüksek mesleki risk oranlarına sahiptir. Açıkçası, tüm iş laboratuvarı personelinin mümkün olduğunca korunması büyük önem taşımaktadır ve bu nedenle, bu prosedürlerin hiçbirinin, N95 standart maskeleri kastettiğimiz uygun kişisel solunum koruması olmadan gerçekleştirilmemesini şiddetle tavsiye ediyoruz.

Ek olarak, tüm tükenmiş alanların HEPA filtrelerden süzüldüğü ikinci sınıf bir biyolojik güvenlik kabini veya başlık gereklidir. Son olarak, bir laboratuvarda hava akışının türbülansını önlemede çok önemli olan basit bir mekanizma, numuneler işlenirken personelin giriş ve çıkışını durdurmak için laboratuvar kapısına takılan bir kilittir. Bu, laboratuvar içinde bulaşma riskini azaltır, Bu yüzden umarım size, mod metodolojisinin neleri içerdiğine ve kaynakların sınırlı olduğu, ancak yüksek kaliteli TB ve MDR TB teşhislerinin acilen gerekli olduğu ortamlarda ne kadar yararlı olabileceğine dair iyi bir genel bakış verilmiştir.

Daha fazla bilgi için, ayrıntılı standart işletim prosedürlerimizi, modların kullanım kılavuzunu bulabileceğiniz mods peru. org web sitemizi ziyaret edebilirsiniz. Ekstra akciğer numunelerinin işlenmesine yönelik SOP'lara ek olarak, mikobakteri ve tüberküloz, diğer mikobakteriler ve bakteri ve mantar kontaminasyonunu içeren bir fotoğraf kitaplığımız da bulunmaktadır ve ayrıca kalite güvence stratejimizi ve laboratuvarların akreditasyonu için önerdiğimiz prosedürü de bulabilirsiniz.

Son olarak, sık sorulan bir soru sayfası var ve bu yinelemeli bir metodoloji olduğu için şu anda modları kullanan kullanıcılardan gelen her türlü geri bildirimi memnuniyetle karşılıyoruz. Daha önce de açıkladığımız gibi, bu tescilli olmayan bir testtir ve her zaman diğer laboratuvarların yapmayı başardığı iyileştirmelerle ilgileniriz.