Baculovirus lepidopteran Larva Microapplicator destekli Enfeksiyon Protokolleri

Eklembacaklılara özgü baculovirus, ökaryotik protein ekspresyon sistemleri için standart bir araştırma aracı olarak kullanılırken, aynı zamanda doğadaki lepidopteralar gibi herbivor böcekleri öldürebilen, çevreye güvenli bir insektisidal ajan olarak da geliştirilmektedir. Lepidoptera larvaları, enfekte olmuş yaprakları yedikleri sırada baculoviruslar tarafından enfekte olurlar. Larvalar veya tırtıllar, baculovirusu, virüsü kurumaya karşı koruyan büyük kristal bir protein yapısı içine paketlenmiş virüs partikülleri kompleksi olan polihedron olarak bilinen formda alırlar.

Larva enfekte olduktan sonra, bütlenmiş virüs enfeksiyonu böceğin içinde yayar. Virüs, daha fazla virüs ve poliedra üretmek için konakçının nükleik asit ve protein sentez mekanizmalarını ele geçirir. Sonunda larvalar virüsle o kadar yoğun şekilde enfekte olur ki, böceğin yediği bitki yüzeylerine damlayan poliedralardan oluşan karmaşık bir sızıntıya dönüşürler ve ardından belirli bir Baca'nın insektisidal etkinliğini belirlemek için döngü yeniden başlar.

Avir suşu mikro aplikatör teknikleri ve biyolojik testler birleştirilebilir. Leid dorin larvaları, HemosIL'e veya vücut boşluğuna doğrudan virüs enjekte edilerek enfekte edilebilir ve mortalite oranları değerlendirilebilir. Ek olarak, oral mikro aplikatör destekli enjeksiyon kullanılarak larvalar polihedralarla enfekte edilebilir ve bağırsak ile diğer dokuların enfeksiyon zamanlaması test edilebilir.

Merhaba, ben Iowa State Üniversitesi Entomoloji Bölümü'ndeki Brian e boning laboratuvarından Wendy Sparks ve ayrıca boning snap'tenim. Bugün sizlere laboratuvar ortamındaki duct DI'yi backlog virüsü ile enfekte etmek için iki prosedür göstereceğiz. Her iki yöntem de mikro aplikatör kullanır.

Öncelikle, prob aracılığıyla heniye vücut virüsü iletmek için mikro aplikatör kullanımını göstereceğim. Ardından, fare aracılığıyla mid guard'a poly header iletmek için mikro aplikatör kullanımını göstereceğim. Hadi başlayalım.

İnsektisidal amaçlarla geliştirildiklerinde, balo virüsleri genellikle zararlı larvaların oral enfeksiyonunu kolaylaştırmak için polihedron genini içerirler. Ancak, bazı durumlarda, polihedron negatif bir baccula virüsünü potansiyel insektisidal etkiler açısından test etmek veya bir böceğin bağırsağını baypas etmek için nedenler olabilir. Bu durumda, deneye başlamadan önce larvaları enfekte etmek için bir mikro aplikatör kullanılarak butted virüs enjeksiyonu gerçekleştirilebilir.

Butted virüs stok çözeltisinin titresi, plak deneyi veya uç nokta dilüsyon deneyleri kullanılarak belirlenmelidir. Fizyolojik deneyler için, beşinci instar H VNS başına 5 × 10⁴ PFU enjeksiyonları tipik olacaktır. Bu biyolojik deneye başlamak için, her bir butted virüs dilüsyonunu, 28.5 veya 32 gauge keskin iğne uçlu, plastik 1 cc'lik bir şırıngaya doldurun.

Genellikle, mililitre başına 10⁷ ile 10⁸ arasında bir titreye sahip, 1 ila 3 µL arası viral solüsyon her bir larva için kullanılabilir; böylece şırıngaya 300 ila 500 µL yüklemek çoğu işlem için yeterlidir. Ardından, havayı iğne ucuna getirmek için şırıngayı dik tutarak içindeki hava kabarcıklarını dışarı itin ve boşaltın.

Ardından şırıngayı şırınga destek tüpüne sabitleyin. Şimdi hacmi 1,0 microliter olarak ayarlayın. Her bir damla için mikro aplikatörün mikroişlemci kontrol ünitesinde, önce doğru hacmin verildiğinden emin olmak amacıyla kontrol ünitesini kalibre edin; damlanın verilme hızı sıfırdan dokuza kadar olan bir ölçekte ayarlanabilir.

Sıklıkla sıfır ile bir arası bir aralık kullanılır. Çözeltinin uygun şekilde verildiğinden emin olmak için ayak pedalına basın. Çok fazla çözelti verildiğini veya uygulamanın çok yavaş olduğunu fark ederseniz, doğru hacimdeki çözeltinin doğru hızda uygulanana kadar hacim ve hız ayarlarının düzenlenebileceğini unutmayın.

Şimdi H VNS enfeksiyonu için enjeksiyona başlamaya hazırım. Genellikle beşinci evrenin erken dönem larva evrelerine enjeksiyon yapılır; sonraki evrelerin daha büyük olması enjeksiyon işlemini kolaylaştırır. İğne ucunu pro bacaklardan birinin tabanından vücut boşluğuna doğru yerleştirin.

İğne ucu prole yerleştirildiğinde, bağırsak ve vücut duvarına zarar vermekten kaçınmak için larva vücudunun konumunu değiştirin; ardından hemo seal içine dört mikrolitre virüs çözeltisi iletmek için ayak pedalına dört kez basın. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra tüm larvaları 28 °C'deki inkübatöre geri koyun. Ölü larvaları kontrol etmek ve hayatta kalan larvalar için yeterli besin bulunduğundan emin olmak adına sık sık kontrol yapın.

Geç instarlar, enjeksiyon kaynaklı kütikula hasarı nedeniyle ölmeseler bile, bakteriyel enfeksiyondan kaynaklanabilecek bağırsak hasarı ihtimaline karşı enjeksiyondan 24 saat sonra kontrol edilmelidir. Bu erken mortalite veri analizinden hariç tutulmalıdır. Letal konsantrasyon biyosayimleri için butted virüs ile mikro aplikatör destekli biyosayımı kullanılıyorsa, biyosayımı farklı zamanlarda üç veya dört kez tekrarlanmalıdır.

Her bir virüs veya kontrol işlemi için doz başına 30 birey kullanın. LC₅₀ değerlerini, %95 güven aralıklarını ve uygun istatistikleri hesaplamak için polo veya SAS gibi uygun bir probit analiz programı kullanın. Bu biyolojik analiz, sabit bir doz virüs inokülasyonunu takiben ST₅₀ sağkalım süresi değerlerini belirlemek için de kullanılabilir.

Bu vakada, larva mortalitesi her dört ila sekiz saatte bir, daha sık gözlemlerle puanlanır. Mortalite oranı yüksekse, %95 güven sınırları içindeki medyan sağkalım süreleri, s plus veya SAS programı kullanılarak Kaplan-Meier tahmincisi ile hesaplanır. Artık Harran, bütetlenmiş virüs kullanılarak mikro aplikatör destekli biyolojik denemeyi size göstermiş oldu.

Sizlere deneyi göstereceğim. Polihidraların kullanımı: Enfeksiyonun kesin zamanlaması kritik olduğunda, polihidraların doğrudan böcek bağırsağına oral yolla inokülasyonu kullanılır. Örneğin, virüsün böcek içerisinde nasıl yayıldığını izlerken, bu deneye başlamak için polihidraları, gliserin ve sudan oluşan nötr yüklü 3:2 oranındaki bir çözeltide 10 ila 300 arasında süspande edin.

Örneğin, dördüncü instar h için polihedralar kullanılabilir. Ardından bu çözeltiyi, 32 gauge kör uçlu iğneye sahip plastik veya cam bir 1 CC tüberküloz şırıngasına doldurun. Mikroskop altında bakarak şırıngayı mikro aplikatörün destek tüpü üzerine yerleştirin.

Dördüncü veya beşinci instar larva tutulur, iğne ağızdan içeri sokulup orta bağırsağın ön bölgesine yerleştirilir ve ardından polihedralar verilir. Bu teknik biraz pratik gerektirir. İlk olarak, larvaları eldivenle ezmeden tutmak zor olabilir.

İkinci olarak, iğneyi ağız parçalarının ötesine geçirmek biraz pratik gerektirir. Yaklaşık 30 larvayı PBS ile inoküle ederek pratik yapmanızı öneririz. Eğer yanlışlıkla bağırsağı delerseniz, larvalar hızla melanize olup siyahlaşacağı için bu durum belirgin olacaktır.

Mikro aplikatör destekli oral inokülasyon enfeksiyonun kesin zamanını sağladığı için, bu yöntem enfeksiyon zamanının virüsün böcek içinde nasıl yayıldığını belirlemek açısından önemli olduğu deneyler için en kullanışlı olanıdır. Örneğin, beta galaktosidaz ekspres eden virüsler larvalara oral olarak inoküle edilebilir ve ardından hangi dokuların enfekte olduğunu belirlemek için çeşitli zaman noktalarında larvalar diseke edilebilir. Enfeksiyon için mikro aplikatör destekli iki yöntem göstereceğiz. Bunlardan ilki, bütçelenmiş virüsün proleg üzerinden doğrudan inokülasyonudur ve bu yöntem, bağırsak fizyolojisini devre dışı bırakarak ilgilendiğiniz virüsün letalitesini ve letal süresini değerlendirmenize olanak tanır.

İkinci teknik, polihidralar kullanılarak orta bağırsağa doğrudan inokülasyondur. Bu yöntem, orta bağırsağa çok kesin bir doz iletilmesine ve olayın zamanlamasının çok hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır. Böylece virüsün mortalitesini ve diğer fenotiplerini de inceleyebilirsiniz.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, cadavers baula virüsü ile öldürülmüş larvaların genellikle hassas olduğunu ve kolayca yırtılarak virüs salabileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, kontaminasyonu önlemek için çalışma yüzeylerini sterilize edin; kontamine olmuş eldivenleri ve tek kullanımlık malzemeleri uygun bir şekilde bertaraf edin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneyinizde başarılar dileriz.