Baculovirus lepidopteran Larva Microapplicator destekli Enfeksiyon Protokolleri
August 23rd, 2008
Bu video, böcek etkinliğini belirlemek için bakülovirüs lepidopteran larvaları enfekte etmek için kullanılan iki microapplicator teknikleri göstermektedir.
Eklembacaklılara özgü baccala virüsü, ökaryotik protein ekspresyon sistemleri için standart bir araştırma aracı olarak kullanılırken, aynı zamanda doğada lepidoptera gibi otobur böcekleri öldürebilen, çevre açısından güvenli bir böcek öldürücü ajan olarak da geliştirilmektedir. Lepidopteran larvaları, enfekte olmuş yaprakları yerken baccala virüsleri tarafından enfekte olur. Larvalar veya tırtıl, baccala virüsünü, virüsü kurumaya karşı koruyan büyük bir kristalli protein yapısında paketlenmiş bir virüs parçacıkları kompleksi olan polihedron olarak bilinen bir formda yutar.
Larva enfekte olduktan sonra, popo virüsü enfeksiyonu böcek içinde yayar. Virüs, daha fazla virüs ve polihedra yapmak için konakçının nükleik asit ve protein sentez mekanizmasını ele geçirir. Sonunda larvalar virüsle o kadar iyice enfekte olurlar ki, böcek tarafından yenen bitki yüzeylerine damlayan dağınık bir polihedra sızıntısına dönüşürler ve daha sonra belirli bir Baca'nın böcek öldürücü etkinliğini belirlemek için döngü yeniden başlar.
Avir gerinim mikro aplikatör teknikleri ve biyo-tahliller birleştirilebilir. Leid dorin larvaları, butted virüsünün doğrudan HemosIL veya vücut boşluğuna enjekte edilmesiyle enfekte olabilir ve mortalite oranları değerlendirilebilir. Ek olarak, larvalar oral mikro aplikatör destekli enjeksiyon kullanılarak polihedra ile enfekte edilebilir ve bağırsak ve diğer dokuların enfeksiyon zamanlaması test edilebilir.
Merhaba, ben Iowa Eyalet Üniversitesi Entomoloji Bölümü'nde Brian e boning laboratuvarında Wendy Sparks Ve aynı zamanda kemik çıtçıtından geliyorum. Bugün size laboratuvar kanalı DI'yi backlog virüsü ile enfekte etmek için iki prosedür göstereceğiz. Her iki yöntemde de mikro aplikatör kullanılır.
İlk olarak, vücut virüsünü prole yoluyla heni'ye vermek için bir mikro aplikatör kullandığınızı göstereceğim. Daha sonra gösterildiğinde, poli başlığı fare aracılığıyla orta korumaya iletmek için mikro aplikatörü kullanırsınız. Öyleyse başlayalım.
Böcek öldürücü amaçlar için geliştirildiğinde, balo virüsleri genellikle zararlı larvalarının oral enfeksiyonunu kolaylaştırmak için polihedron genini içerir. Bununla birlikte, bazen, potansiyel böcek öldürücü etkiler için bir polihedron negatif baccala virüsünü test etmek veya bir böceğin bağırsağını atlamak için nedenler vardır. Bu durumda, teste başlamadan önce larvaları enfekte etmek için bir mikro aplikatör kullanılarak popo virüsü enjeksiyonu yapılabilir.
Butted virüsün çalışma stoğunun titresi, plak testi veya son nokta seyreltme testleri kullanılarak belirlenmelidir. Fizyolojik deneyler için, beşinci instar H VNS başına beş kez 10 ila dördüncü PFU enjeksiyonları tipik olacaktır. Bu biyo-tahlile başlamak için, her bir poçlu virüs seyreltmesini 28.5 veya 32 gauge keskin bir iğne ucu ile herkül şırıngasına bir cc plastik bir tüpe yükleyin.
Genellikle bir ila üç mikrolitre popolu virüs çözeltisi. Her larva için mililitrede 10 ila yedinci arasında bir titre ile eksi 10 ila sekizinci kullanılabilir, böylece şırıngaya 300 ila 500 mikrolitre yüklemek çoğu amaç için yeterlidir. Ardından, iğne ucuna hava getirmek ve dağıtmak için şırıngayı dik tutarak hava kabarcıklarını şırıngadan çıkarın.
Ardından şırıngayı şırınga destek tüpüne sabitleyin. Şimdi ses seviyesini 1.0 mikrolitreye ayarlayın. Mikro aplikatörün mikroişlemci kontrol ünitesindeki her damlacık için, doğru hacmin dağıtıldığından emin olmak için önce kontrol ünitesini kalibre edin, damlacığın dağıtılma hızı sıfır ila dokuz arasında bir ölçekte ayarlanabilir.
Sıfır ile bir arasında bir aralık yaygın olarak kullanılır. Solüsyonun uygun şekilde dağıtıldığından emin olmak için ayak pedalına basın. Çok fazla çözelti dağıtılırsa veya uygulama çok yavaşsa, doğru çözelti hacmi doğru oranda uygulanana kadar ses ve hız ayarlarının ayarlanabileceğini unutmayın.
Artık H VNS enfeksiyonu için enjeksiyona başlamaya hazırım. Erken beşinci, instar larvaları tipik olarak enjekte edilir, daha sonraki instarların daha büyük boyutu enjeksiyon işlemini kolaylaştırır. İğne ucunu pro bacaklardan birinin planından geçirin ve vücut boşluğuna yerleştirin.
Not: İğne ucu prole içine girdiğinde, larva vücut pozisyonunu değiştirin Bağırsaklara ve vücut duvarına zarar vermemek için, şimdi dört mikrolitre virüs solüsyonunu hemo contasına vermek için ayak pedalına dört kez basın. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, tüm larvaları 28 santigrat derece inkübatöre geri koyun. Ölü larvaları sık sık kontrol edin ve hayatta kalan larvalar için yeterli diyetin mevcut olduğundan emin olun.
Geç instarlar enjeksiyondan kaynaklanan kütikül yaralanmasından ölmese de, bakteriyel enfeksiyondan kaynaklanabilecek bağırsakta hasar olması durumunda larvalar enjeksiyondan 24 saat sonra kontrol edilmelidir. Bu erken mortalite veri analizinden çıkarılmalıdır. Öldürücü konsantrasyon biyotahlilleri için popo virüsü ile mikro aplikatör destekli biyo-tahlil kullanılıyorsa, biyo-tahlil ayrı durumlarda üç veya dört kez tekrarlanmalıdır.
Her virüs veya kontrol tedavisi için doz başına 30 kişi kullanın. Lc 50 değerlerini, %95 güven aralıklarını ve uygun istatistikleri hesaplamak için polo veya SAS gibi uygun bir veraset analiz programı kullanın. Bu biyo-tahlil, sabit bir virüs dozunun aşılanmasını takiben ST 50 sağkalım süresi değerlerini belirlemek için de kullanılabilir.
Bu durumda, larva ölümleri daha sık gözlemlerle her dört ila sekiz saatte bir puanlanır. Mortalite oranı yüksekse, %95 güven sınırlarında medyan sağkalım süreleri, s plus veya SAS programı kullanılarak Kaplan Meyer tahmincisi kullanılarak hesaplanır. Artık Harran size popo virüsü kullanarak mikro aplikatör destekli biyo-tahlili gösterdi.
Size tahlili göstereceğim. Polihedra kullanımı: Polihedranın doğrudan böcek bağırsağına oral aşılanması, enfeksiyonun tam zamanlamasının kritik olduğu durumlarda kullanılır. Örneğin, bu tahlili başlatmak için virüsün böcek içinde nasıl yayıldığını izlerken, polihedrayı nötr olarak yüzen üç ila iki gliserin ve 10 ila 300 su çözeltisi içinde askıya alın.
Örneğin polihedra dördüncü yıldız için kullanılabilir. Daha sonra bu çözeltiyi 32 gauge künt uçlu bir iğne ile plastik veya cam bir CC tüberkülin şırıngasına yükleyin. Şırıngayı, mikroskoba bakarak mikro aplikatörün destek tüpüne yerleştirin.
Dördüncü veya beşinciyi yıldız larvasında tutun, iğneyi ağızdan ve orta bağırsağın ön bölgesine sokun, ardından çokyüzlüyü verin. Bu teknik biraz pratik gerektirir. İlk olarak, larvaları ezmeden eldivenlerle tutmak zor olabilir.
İkincisi, iğneyi ağız kısımlarından geçirmek biraz pratik gerektirir. PBS ile yaklaşık 30 larvayı aşılamanızı öneririz. Bağırsakları delerseniz, larvalar melany ve oldukça hızlı bir şekilde siyaha döndüğü için açık olacaktır.
Yine, mikro aplikatör destekli oral aşılama, enfeksiyonun tam zamanını sağladığından, bu yöntem en çok, virüsün böcek içinde nasıl yayıldığını belirlemek için enfeksiyon süresinin önemli olduğu deneyler için yararlıdır. Örneğin, beta galaktoz dase eksprese eden virüsler oral yoldan larvalara aşılanabilir, bunlar daha sonra hangi dokuların enfekte olduğunu belirlemek için çeşitli zaman noktalarında diseke edilir. Size enfeksiyon için sadece iki mikro aplikatör destekli damar göstereceğiz. Vir ile böcek sevgisi, Bunlardan ilki, popolu virüsün pro Legg aracılığıyla doğrudan aşılamaydı ve bu, bağırsak fizyolojisini atlamanıza ve ilgilendiğiniz virüsün ölümcüllüğünü ve ölümcül süresini değerlendirmenize olanak tanır.
İkinci teknik, polihedra kullanılarak orta bağırsağa doğrudan aşılamaydı. Bu, doğrudan orta bağırsağa çok hassas bir doz vermenin yanı sıra olayın çok hassas zamanlamasını kontrol etmenizi sağlar. Daha sonra virüsün ölüm oranını ve diğer fenotiplerini de inceleyebilirsiniz.
Bu prosedürü yaparken, kadavraların baula virüsü tarafından öldürülen larvaların tipik olarak kırılgan olduğunu ve virüsü salgılayarak kolayca yırtılabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, kontaminasyonu önlemek için çalışma yüzeylerini sterilize edin ve kontamine eldivenleri ve tek kullanımlık malzemeleri uygun bir şekilde atın. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler. Denemenizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu video, böcek öldürücü etkinliğini değerlendirmek için lepidopteran larvalarının bakülovirüs ile enfekte edilmesine yönelik iki mikroaplikasyon tekniğini gösterir. Yöntemler, kesme virüsünün doğrudan enjeksiyonu ve polihedronların oral inokülasyonunu içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Entomoloji
- Viroloji
- Böcek öldürücü araştırma
Arka Plan
- Bakülovirüsler, ökaryotik protein ekspresyonu için araştırmalarda kullanılmaktadır.
- Çevreye zarar vermeyen böcek öldürücüler olarak geliştirilmektedirler.
- Lepidopteran larvaları, enfekte olmuş bitki örtüsünü yutma yoluyla enfekte edilebilir.
- Virüs, larvaların polihedral bir sıvıya çözülmesine neden olabilir ve enfeksiyon döngüsünü sürdürebilir.
Çalışmanın Amacı
- Larvaları bakülovirüs ile enfekte etme yöntemlerini göstermek.
- Farklı bakülovirüs suşlarının böcek öldürücü etkinliğini değerlendirmek.
- Larval mortaliteyi değerlendiren biyoansayılar için protokoller sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Larvalar hemosel kısmına kesme virüs enjeksiyonu.
- Larvalar bağırsağına polihedronların oral inokülasyonu.
- Viral çözeltilerin hassas dağıtımı için mikroaplikasyonların kullanılması.
- Mortaliyet oranlarının ve enfeksiyon zamanlamasının değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Her iki yöntem de lepidopteran larvalarını bakülovirüs ile etkili bir şekilde enfekte eder.
- Enjeksiyon, viral etkilerin kontrollü bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
- Oral inokülasyon, enfeksiyonun zamanlaması hakkında bilgiler sağlar.
- Biyoansayılar, ölümcül konsantrasyonları ve hayatta kalma sürelerini belirleyebilir.
Sonuçlar
- Mikroaplikasyon teknikleri, bakülovirüs enfeksiyonlarının incelenmesi için etkilidir.
- Bu yöntemler, bakülovirüslerin böcek öldürücü olarak potansiyelini değerlendirmeye yardımcı olabilir.
- Daha fazla araştırma, bu teknikleri çeşitli uygulamalar için optimize edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Precise delivery of viral agents to insect models enables mechanistic de-risking of baculovirus-based biopesticides by isolating infection variables and quantifying dose-response relationships. This supports target validation in entomological pathways and predictive confidence in lethality assays prior to field deployment. The method aids in screening viral strains for insecticidal potency and informs go/no-go decisions in early-stage biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering controlled doses of baculovirus to bypass gut physiology and assess direct tissue effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through standardized microapplicator-assisted injection of budded virus into the hemocoel.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by isolating infection timing and dissemination patterns for lethal phenotype assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling oral inoculation of polyhedra into the midgut with precise temporal control.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through calibrated microapplicator delivery of defined virus titers (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Scalability Value: Highlights screening readiness via replication of bioassays three to four times with 30 individuals per dose for LC₅₀ determination.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant systems by enabling study of virus dissemination in tissues following gut-targeted or systemic infection.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by measuring mortality and survival time (ST₅₀) using Kaplan-Meier estimator.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on viral strain selection based on lethal concentration and survival time outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing by enabling quantitative infection modeling in lepidopteran hosts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise delivery of virus to specific tissues (hemocoel or midgut) to isolate mechanisms of pathogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through standardized microapplicator protocols for delivering polyhedra or budded virus with volume control (1.0 µL droplets) and speed settings (0–1 scale).
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as mortality scoring every 4–8 hours, LC₅₀ calculation via Polo or SAS, and ST₅₀ estimation using Kaplan-Meier analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling time-resolved dissection of infected larvae to track tissue-specific infection dynamics.
- Enterprise Reuse: Frames the microapplicator as a reusable platform for standardized viral challenge across insecticidal R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in infection routes, and clarification of viral dissemination kinetics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viral delivery via microapplicator calibration and syringe-based dosing.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in strain screening, and reduced late-stage biological risk in biopesticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of baculovirus strains based on quantified lethality and infection timing data.
Implementation Considerations
- Required expertise in entomological handling, microapplicator operation, and bioassay design.
- Instrumentation includes microapplicator with microprocessor control, syringe support tube, 28.5–32 gauge needles, and incubators at 28°C.
- Cross-team standardization requires consistent virus titer determination (plaque or endpoint dilution), volume calibration, and mortality scoring protocols.
- Adaptation considerations include larval instar selection (early fifth instar for injection, fourth/fifth for oral), gut integrity monitoring, and avoidance of bacterial contamination post-injection.
- Practical limitations include larval fragility post-infection, need for sterile disposal of cadavers, and exclusion of early mortality from injection trauma.
