Name: Sigmanın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin proteaz aktivitesini kazein substratı kullanarak spektrofotometri ile ölçme yöntemini. Bu standart prosedür, laboratuvar kalite kontrolü ve enzim aktivitesinin niceliksel analizi için uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Testin başlamadan önce, aşağıdaki reaktifler doğru hazırlanmış olduğundan emin olmanız gerekir: <ol><li> 50 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5. 11.4 mg / ml potasyum fosfat dibazik, arıtılmış su ve 1M HCl ile pH ayarlanması içinde trihidrat kullanarak hazırlayın. Bu çözüm, 37 ° C önceden yerleştirilmiş. </li><li> Kazein 6.5 mg / ml 50 mM potasyum fosfat tamponu karıştırılarak hazırlanan% 0,65 ağırlık / hacim kazein çözüm. Yavaş yavaş ° C yaklaşık 10 dakika boyunca homojen bir dağılım elde edilene kadar nazik karıştırma ile çözüm sıcaklığı 80-85 arttı. Bu çözüm kaynatmak için çok önemlidir. Gerekirse NaOH ve HCl ile pH ayarlanır. </li><li> 6.1N bir stok 01:55 arıtılmış su ile seyreltilmesi ile hazırlanan 110 mM Trikloroasetik asit çözeltisi,. Trikloroasetik asit güçlü bir asit ve bakım ile ele alınmalıdır. </li><li> 0.5 mM Folin &amp; Ciolcaltea ya da proteaz aktivitesi ile doğrudan ilgili olacaktır ölçülebilir bir renk değişikliği oluşturmak için tirozin ile reaksiyona girer çözümdür Folin Fenol Reaktif. Folin Fenol Reaktif bir asittir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. </li><li> Anyhydrous sodyum karbonat 53 mg / ml saf su kullanılarak hazırlanan 500 mm Sodyum Karbonat çözüm. 5mM Kalsiyum Asetat ile 10 mM Sodyum Asetat Tamponu, pH 7.5, 37 ° oluşan bir enzimin seyreltici çözüm ° C. Bu çözüm, katı proteaz örnekleri çözülür veya enzim çözümler sulandırmak için ne kullanın. </li><li> 1.1 mM L-tirozin Standart stok solüsyonu. Arıtılmış su ve tirozin eriyene kadar hafifçe ısıtılır 0.2 mg / ml L-tirozin kullanılarak hazırlanmıştır. Kazein gibi, bu çözüm kaynatın. L-tirozin standart oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Bu çözüm, standart eğri daha seyreltilmiş olacaktır. </li><li> Proteaz çözüm. Proteaz çözülür ve kullanmadan önce hemen, 6. adımda hazırlanan enzim seyreltici çözüm. </li></ol> Gerekirse, önceden belirlenmiş bir aktivite 0.1-0.2 ünite / ml enzim seyreltici kullanılarak çözülür sağlam bir proteaz örnek, kullanın. Bu çözüm, kalite kontrol testi için bir pozitif kontrol ve enzim aktivitesini belirlemek için yapacağı hesaplamalar için doğrulama olarak hizmet vermektedir. Proteaz Testi ve Standart Eğriler ayarlama <ol><li> Bu testte başlamak için, yaklaşık 15 ml tutun uygun şişeleri bulabilirsiniz. Test edilecek her bir enzim için, 4 flakon ihtiyaç vardır. Bir flakon, bir boş olarak kullanılan olacak ve diğer üç proteaz üç dilüsyonları tahlil aktivitesi için kullanılacak. Üç dilüsyonları birbirlerine karşı son hesaplamalar kontrol ederken yararlıdır. <ol><li> Dört şişeleri her set için% 0.65 kazein çözüm 5mls ekleyin. Onları 37 yaşında bir su banyosunda dengeye ° C, yaklaşık 5 dakika. </li><li> Boş değil, test numune şişeleri üç test edilecektir enzim çözeltisi hacimleri değişen, ancak ekleyin. ° C tam on dakika dönen ve 37 inkübe karıştırın. Bu inkübasyon süresi sırasında proteaz aktivitesi ve tirozin dolaylı kurtuluş ölçülür ve test örnekleri arasında karşılaştırıldı ne olacak. </li></ol></li><li> Bu 10 dakika inkübasyondan sonra, reaksiyon durdurmak için her tüpe 5 ml TCA reaktif ekleyin. Daha sonra, her tüpe bile boş, her tüp enzim çözüm son hacmi 1 ml enzim çözeltisi uygun bir hacim kazandırmak. Bu enzim kendisi absorbans değeri hesaba ve her tüp nihai hacmi eşit olmasını sağlamak için yapılır. 37 çözümler ° C&#39;de 30 dakika için. Bu 30 dakikalık inkübasyon sırasında, tirozin standart dilüsyonları kurmak isteyebilirsiniz. 8 mls kolayca tutabilir 6 dram şişeleri (dram şişeleri polipropilen tüpler ile ikame edilebilir) kullanın. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50 altı şişeleri, mls aşağıdaki hacimleri ile 1.1 mM tirozin standart stok çözümleri ekleyin. Tirozin için herhangi bir standart boş katmayın. Alt standartları biraz renk değişikliği verecektir saf test örnekleri için gerekli olabilir. Tirozin standart solüsyonu ilave edildikten sonra, 2 ml hacmi getirmek için her standartlara uygun bir hacimde saf su ekleyin. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, test çözümleri her filtre ve boş bir 0.45 um polyethersulfone şırınga filtre kullanarak. Filtrasyon örneklerinden herhangi bir Çözünmezlerin kaldırmak için gereklidir. <ol><li> En az 8 ml tutabilir 4 dram şişeleri filtrasyon 2 ml test örnekleri ve boş süzüntü ekleyin. Aynı tip standartlar hazırlanmıştır flakon kullanılabilir. </li><li> Tüm standartları ve standart boş içeren flakon, sodyum karbonat 5mls ekleyin. En iyi sonuç için, hemen ardından Folin reaktifi 1 ml ekleyin. </li><li> Folin reaktif ilavesi ile oluşturulan herhangi bir pH düşüşü düzenleyen sodyum karbonat ekleyin. </li><li> Test örnekleri ve tes sodyum karbonatt boş. Bu çözümler, sodyum karbonat ilave edildikten sonra bulutlu olur. Öncelikle ücretsiz tirozin tepki vereceğini Folin reaktifi ekleyin. </li><li> Dönen tarafından dramını şişeleri karıştırın ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bu inkübasyondan sonra, standartlara tirozin eklendi miktarı ile korele bir tonlama renk olduğunu fark; tirozin yüksek konsantrasyonlarda karanlık görünen. Ayrıca test örnekleri içinde kayda değer bir renk değişikliği fark edebilirsiniz. Bu çözümlerin 2mls uygun küvetler içine 0.45 um polyethersulfone şırınga filtresi kullanarak filtrelenir. Tahlil yapılır Şimdi, bizim absorbans değerleri kaydetmek için spektrofotometre devam edebilirsiniz. </li></ol> Absorbans Ölçüm ve Enzim Aktivitesi Hesaplanması <ol><li> Örneklerin absorbansı 660nm dalga boyunda bir spektrofotometre ile ölçülür. Işık yolu 1 cm olarak ayarlanır. Standartları, standart boş, farklı test örnekleri ve test boş absorbans değerleri kaydedin. Bir kez tüm verileri toplandı, standart eğri oluşturulabilir. Standart ve standart boş arasındaki absorbans eğrisi oluşturmak için, fark hesaplanması gerekmektedir. Bu standart çözümler tirozin miktarı atfedilebilecek absorbans değerdir. Bu basit bir hesaplama sonra, standart eğri, Y ekseni üzerinde standartların absorbans değişikliği, X ekseni üzerinde 5 standartlarını her mikromolden miktarına karşı komplo bir grafik programını kullanarak oluşturabilirsiniz. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Tirozin Standart Hacmi </th><th style="text-align:center"> uMoles Tyrosine </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Veri noktaları girildikten sonra, en uygun ve ilgili eğim denklemi bir çizgi oluşturur. Test örneği absorbans ve test boş absorbans arasındaki fark hesaplanarak test örnekleri absorbans değişikliğini bulun. Eğim denklemi içine bir test örnekleri için absorbans değeri takma ve çözme bu özel proteolitik reaksiyon sırasında tirozin kurtarılmış mikromolden neden olacaktır. / Ml başına birim enzim aktivitesi elde etmek için, aşağıdaki hesaplama gerçekleştirin: (Tirozin umole eşdeğerleri piyasaya) x (11) Birimler / ml Enzim = __________________________________________ (1) x (10) x (2) Testin 11 = Toplam hacmi (mililitre) Testin 10 = Zaman (dakika) Birim tanımını başına 1 = Enzim enzim hacmi (mililitre) Kolorimetrik belirlenmesi kullanılan 2 = hacmi (mililitre) Eğim denklemi elde mikromolden tirozin eşdeğerleri piyasaya numarasını alın ve bizim durumumuzda 11mls olan mls, testin toplam hacmi ile çarpın. Kolorimetrik saptanmasında kullanılan mililitre hacmi, bu değeri diğer üç miktarlarda Böl: 10 dakika boyunca koştu tahlil, zaman, hacim, tayininde kullanılan enzim, (Kullanıcı 1ml kullanmak izin) çeşitli olduğu. sizin küvet göre farklılık gösterir. Biz mls 2 kullanılır. </li><li> Tirozin mikromolden &quot;birim&quot; olarak adlandırılan proteaz aktivitesi dakika verim ölçümü zaman bölünür. Biz enzim aktivitesi ünite / ml açısından bir ölçüm bırakarak, pay ve payda hacim ölçümü için birimler iptal edebilirsiniz. , Enzim seyreltici seyreltilmiş sağlam bir proteaz örnek aktivitesini belirlemek amacıyla, ünite / mg açısından aktivitesi ile bize bırakarak, mg / ml. Başlangıçta bu testte kullanılan katı konsantrasyonu ünite / ml faaliyet bölmek . Birimler / ml enzim Birimler / mg&#39;lık katı = _____________________ mg katı / ml enzim </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

Biz sadece Sigma&#39;nın evrensel proteaz aktivitesi tahlil kullanarak proteaz aktivitesi analiz nasıl gösterilir ettik. Buna ek olarak, bu testte deneyler için onları almadan önce proteazlar tam aktivite olduğunu tespit ettik sağlamak için yararlıdır. Görüldüğü gibi, bu işlemi yaparken, yavaş ve onları kaynatmak için kazein ve tirozin çözümler ısı hatırlamak için büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, hem kendi standartları ve sahip olduğunuz her test örneği için farklı boşlukları hazırlamak için önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat, Dibazik, Trihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Kazein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu Fenol Reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Karbonat, Susuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat, Trihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirozin, Serbest Baz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz Profiler Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz Floresan Tespit Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma&#39;nın non-spesifik proteaz aktivitesi testi - kazein bir substrat olarak

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteazlar peptid bağı bölünürler. Laboratuarda, genellikle proteaz aktivitesini ölçmek ve / veya karşılaştırmak için gereklidir. Sigma&#39;nın non-spesifik proteaz aktivitesi tahlil kalite kontrol işlemleri sırasında ne proteaz aktivitesini belirlemek için standart bir prosedür olarak kullanılıyor olabilir. Bu testte, kazein, bir substrat olarak davranır. Test proteaz kazeinin sindirir, amino asit olan tirozin ile birlikte diğer amino asitler ve peptit kurtuldu. Folin ve Fenol Ciocalteus ya da Folin Kullanıcı reaktif öncelikle, ölçülebilir ve spektrofotometre bir absorbans değeri olarak ölçülen bir mavi renkli kromofor üretmek için ücretsiz tirozin ile reaksiyona girer. Kazein salgılanır tirozin, daha kromoforlar proteaz aktivitesi oluşturulan ve güçlüdür. Tirozin bilinen miktarlarda FC reaktifi ile reaksiyona girerek mikromolden tirozin miktarı ile absorbans değişiklikleri ilişkilendirmek için oluşturulan bir standart eğri, proteaz aktivitesi tarafından oluşturulan absorbans değerleri karşılaştırılır. Standart eğrisinden, proteaz örnekleri aktivitesi açısından Üniteleri, kazein dakikada serbest tirozin benzerlerinin mikromolden miktarı tespit edilebilir. Çince Bu makaleyi görüntülemek için <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">buraya tıklayın</a>

Proteazlar peptid bağı bölünürler. Laboratuarda, genellikle proteaz aktivitesini ölçmek ve / veya karşılaştırmak için gereklidir. Sigma&#39;nın non-spesifik proteaz aktivitesi tahlil proteaz aktivitesini belirlemek için standart bir prosedür olarak kullanılıyor olabilir.

Sigma&#39;nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Proteazlar peptid bağlarını koparır. Laboratuvarda, proteazların aktivitesini ölçmek ve/veya karşılaştırmak sıklıkla gereklidir. Sigma'nın non-spesifik proteazı...

Proteazlar laboratuvarda peptid bağlarını parçalar. Proteazların aktivitesini ölçmek ve/veya karşılaştırmak sıklıkla gereklidir. Sigma'nın evrensel proteaz aktivite testi, kalite kontrol prosedürlerimiz sırasında yaptığımız gibi, proteazların aktivitesini belirlemek için standardize edilmiş bir prosedür olarak kullanılabilir.Bu analizde, test ettiğimiz proteaz kasyanı sindirdiğinde kasyan substrat olarak görev yapar. Diğer amino asitler ve peptid fragmanlarıyla birlikte tirozin amino asidi serbest kalır. Serbest tirozin daha sonra, spektrofotometrede absorbans değeri olarak ölçülebilen ve miktar tayini yapılabilen mavi renkli bir kromofor üretmek için folin ve kalai reaktifi veya folin reaktifi ile reaksiyona girer.Kazeinden ne kadar fazla tirozin salınırsa, o kadar çok kromofor oluşur ve proteaz aktivitesi o kadar güçlü olur. Proteaz aktivitesi tarafından üretilen absorbans değerleri, absorbans değişimlerini ilişkilendirmek amacıyla belirli miktarlardaki tirozin ile FC reaktifinin reaksiyona sokulmasıyla oluşturulan bir standart eğri ile karşılaştırılır. Standart eğriden elde edilen mikromol cinsinden tirozin miktarı ile proteaz örneklerinin aktivitesi, dakikada kazeinden salınan mikromol tirozin eşdeğeri cinsinden birimler şeklinde belirlenebilir. Merhaba, ismim Carrie Cup Vineyard ve Missouri, St. Louis'teki Sigma Aldridge DeKalb tesisinde bilim insanıyım.Bugün size, Sigma Aldridge bünyesinde proteaz aktivitesini test etmek için kullanılan ve evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem göstereceğim. Bu analizi, proteazı doğrudan laboratuvarınıza göndermeden önce yeterli aktiviteye sahip olduğundan emin olmak için temel olarak kalite kontrol alanımızda kullanıyoruz. Analize başlamadan önce, aşağıdaki reaktiflerin doğru şekilde hazırlandığından emin olmamız gerekmektedir.pH 7.5'de 50 millimolar potasyum fosfat tamponu. Çözelti, kullanımdan önce 37 °C'ye getirilir; 1 litrede 6,5 mg/mL olacak şekilde karıştırılarak hazırlanan %0,65 ağırlık/hacim oranında kazein çözeltisi eklenir. Homojen bir dispersiyon elde edilene kadar çözelti sıcaklığı, hafifçe karıştırılarak yaklaşık 10 dakika boyunca kademeli olarak 80 ila 85 °C'ye yükseltilir.Çözeltinin kaynatılmaması çok önemlidir. Ardından gerekirse pH, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit ile ayarlanır. 6,1 normal bir stok çözeltininle saf su ile 1'e 55 oranında seyreltilerek hazırlanan 110 milimolar trikloroasetik asit çözeltisi, 0,5 milimolar, fallen ve seal calts veya fallen fenol reaktifi ile karıştırılır; bu reaktif, tirozin ile reaksiyona girerek ölçülebilir bir renk değişimi oluşturacak olan çözeltidir.Bu durum, proteazların aktivitesiyle doğrudan ilişkili olacaktır. Saf su içinde mililitre başına 53 miligram susuz sodyum karbonat kullanılarak hazırlanan 500 milimolar sodyum karbonat çözeltisi ve 37 °C'de pH 7,5'te beş milimolar kalsiyum içeren 10 milimolar sodyum asetat tamponundan oluşan bir enzim seyreltme çözeltisi kullanılır. Katı proteaz örneklerini çözmek veya enzim çözeltilerini seyreltmek için bu çözeltiyi kullanıyoruz.Başlangıç konsantrasyonu 1,1 millimolar olan, L tirosinin 0,2 miligram/mililitre çözeltisi şeklinde hazırlanan L tirosin standart stok çözeltisi, saflaştırılmış su içinde hazırlanır ve tirosin çözünene kadar nazikçe ısıtılır. Kazein işlemini olduğu gibi, bu çözeltiyi kaynatmayın. L tirosin standardının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Gerektiğinde standart eğrimizi oluşturmak için bu çözelti daha da seyreltilecektir; önceden belirlenmiş aktiviteye sahip katı bir proteaz örneği, enzim dilüenti kullanılarak 0.1 ila 0.2 units per milliliter olacak şekilde çözülür. Bu çözelti, kalite kontrol analizi için pozitif kontrol görevi görür ve enzim aktivitesini belirlemek için gerçekleştireceğimiz hesaplamaların doğrulanmasını sağlar. Reaktiflerimizi hazırladığımıza ve hepsi uygun sıcaklığa geldiğine göre, proteaz analizine başlayabiliriz.Bu analize başlamak için yaklaşık 15 mililitre hacme sahip uygun tüpler bulunuz. Test edeceğiniz her enzim için dört tüpe ihtiyacınız olacaktır. Tüplerden biri kör örnek olarak, diğer üçü ise üç farklı Aktivite analizini gerçekleştirmek için kullanılacaktır.Proteazın seyreltilmesi; nihai hesaplamalarımızı birbirleriyle karşılaştırırken üç farklı seyreltme düzeyi yararlıdır. Dört adet tüpün her birine 0.65% kasian çözeltisinden 5 mL ekleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda yaklaşık beş dakika boyunca dengeye gelmelerini bekleyin. Ardından, kör numune hariç, test numunesi tüplerinden üçüne farklı konsantrasyonlarda enzim çözeltisi ekleyin. Tüpleri dairesel hareketlerle karıştırın ve tam olarak 10 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.Bu inkübasyon süresince gerçekleşen proteaz aktivitesi ve buna bağlı olarak açığa çıkan tirozin miktarı ölçülecek ve test numunelerimiz arasında karşılaştırılacaktır. Bu 10 dakikalık inkübasyonun ardından, her tüpe beş mililitre TCA reaktifi ekleyin. Daha sonra, her tüpe (kör numune dahil) uygun hacimde enzim çözeltisi eklenerek, her tüpteki toplam enzim çözeltisi hacminin bir mililitre olması sağlanır.Bu işlem, enzimin kendi absorbans değerini hesaba katmak için yapılır. Şimdi çözeltileri 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu 30 dakikalık inkübasyon süresinde, altı adet DR tüpü kullanarak tirozin standart dilüsyonlarını hazırlayabilirsiniz.Bunlar altı flakona sekiz mililitreye kadar kolayca hacim sağlayabilir. 1.1 milimolar tirozin standart stok çözeltileri, mililitre cinsinden sırasıyla 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 ve 0.5 hacimlerinde eklenir. Kör örneğe herhangi bir tirozin standardı eklemeyin.Az miktarda renk değişimi sağlayacak IPU test numuneleri için daha düşük standartlar gerekebilir. Tirozin standart çözeltisi eklendikten sonra, hacmi iki mililitreye tamamlamak için standartların her birine uygun miktarda saflaştırılmış su ekleyin. İnkübasyonun ardından, test çözeltilerinin her birini ve kör örneği filtreleyin.0,45 mikronluk bir şırınga filtresi kullanılarak, iki mililitre test örneği ve boş filtrat, en az sekiz mililitre kapasiteli dört adet DR vialine eklenir. Standartların hazırlandığı viallerle aynı tip vialleri kullanabilirsiniz; standartlar ve standart boşu içeren tüm viallere beş mililitre sodyum karbonat eklenir ve en iyi sonuçlar için hemen ardından belirtilen reaktif eklenir; ardından sodyum karbonat test örneklerimize ve test boşuna eklenir. Sodyum karbonat eklendikten sonra bu çözeltilerin bulanıklaştığını fark edeceksiniz.Ardından, serbest tirozin ile reaksiyona girecek olan çöktürücü reaktif eklenir. DRAM tüpleri dairesel hareketlerle karıştırılır ve bu işlemin ardından 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edilir. Standartların, eklenen tirozin miktarıyla ilişkili olarak renk gradasyonu gösterdiğini, en yüksek tirozin konsantrasyonlarının en koyu renkte göründüğünü fark etmelisiniz.Test örneklerimizde belirgin bir renk değişimi olduğunu da fark edebilirsiniz. Bu çözeltilerden iki mililitre, 0.45 mikronluk bir şırınga filtresi kullanılarak uygun küvetlere filtrelenir. Analizimizi tamamladığımıza göre, spektrofotometreye geçip absorbans değerlerimizi kaydedelim.Numunelerimizin absorbansı, 660 nanometre dalga boyu kullanılarak bir spektrofotometre ile ölçülür. Işık yolu bir santimetreye ayarlanarak standartlar, standart boşyla, farklı test numuneleri ve bir test boşu için absorbans değerleri kaydedilir. Tüm veriler toplandıktan sonra, standart eğrimizi oluşturmaya hazırız.Eğriyi oluşturabilmek için standart ile standart boşluk arasındaki absorbans farkı hesaplanmalıdır. Bu, standart çözeltilerdeki tirozin miktarına atfedilen absorbans değeridir. Bu basit hesaplamanın ardından, standartlarımızın absorbans değişimini Y eksenine, beş standardımızın her biri için mikromol cinsinden miktarı ise X eksenine grafiğe dökerek standart eğrimizi oluştururuz.Veri noktalarını girdikten sonra en uygun doğruyu (best fit line) oluştururuz, ardından test örneği absorbansı ile test körü absorbansı arasındaki farkı hesaplayarak test örneklerindeki absorbans değişimini buluruz. Standart eğrimize bakarak, test örneklerimizden birine ait absorbans değerini Y ekseninde belirleriz. Şimdi X eksenine paralel olarak, standart eğrimize ulaştığımız noktada duracak şekilde bir çizgi çizeriz.Ardından, bu noktadan alınan X koordinatından, bu özel proteolitik reaksiyon sırasında serbest kalan tirozin miktarını ve mikromol değerini elde ederiz. Mililitre başına ünite cinsinden enzim aktivitesini belirlemek için şu hesaplamayı yapın: standart eğriden elde edilen serbest kalan tirozin eşdeğeri mikromol sayısını alın ve bunu, bizim durumumuzda 11 mililitre olan toplam analiz hacmi ile çarpın. Daha sonra bu değeri diğer üç niceliğe bölün.10 dakika boyunca gerçekleştirdiğimiz analiz süresi, analizde kullanılan ve değişkenlik gösteren enzim hacmi; örneğin 1 ml kullanalım. Kolorimetrik tespit için kullanılan mililitre hacmi, kullandığınız küvet tipine göre farklılık gösterebilir.İki mililitre kullanıyoruz. Tyrosine mikromol miktarının dakika cinsinden zamana bölünmesi, ünite olarak adlandırdığımız proteaz aktivitesi ölçümünü verir. Pay ve paydadaki hacim ölçümü birimlerini sadeleştirebiliriz; böylece mililitre başına ünite şeklinde bir enzim aktivitesi ölçümü elde ederiz.Enzim dilüenti ile seyreltilmiş katı bir proteaz örneğindeki aktiviteyi belirlemek için, mililitre başına düşen aktivite birimini, bu analizde başlangıçta kullanılan katı maddenin miligram/mililitre cinsinden konsantrasyonuna bölüyoruz; böylece miligram başına birim cinsinden aktivite değerini elde ediyoruz. Sigma'nın üniversal proteaz aktivite analizi kullanılarak proteaz aktivitesinin nasıl analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken gördüğünüz üzere, hem kazein hem de tirozin çözeltilerini yavaşça ısıtmayı ve kaynatmamayı hatırlamak büyük önem taşımaktadır.Ayrıca, hem standartlarınız hem de sahip olduğunuz her bir test örneği için farklı kör numuneler hazırlamanız kritik önem taşır. İşte hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve proteaz aktivite çalışmalarınızda başarılar dileriz.

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının...

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Bu video, bir antikorun bir dönüştürücü çip üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir hedef antijen ile etkileşimini incelemek için iletken bir biyosensör testini göstermektedir. Biyosensör, iki işlevli bir kimerik proteine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır - hareketsizleştirilmiş hedef antijene bağlanmak için bir nano gövdeye kaynaşmış fonksiyonel bir katalitik bölgeye sahip bir β-laktamaz enzimi. Bağlanma üzerine, bir antibiyotik substratının β-laktamaz enzimi tarafından katalitik hidrolizi,...

Protein-Protein Etkileşimleri için β-Laktamaz Tabanlı Kondüktimetrik Biyosensör Testi

Bu video, florojenik peptitler kullanılarak proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir testi göstermektedir. Proteaz, peptit üzerindeki bölünme bölgesini tanır, onu parçalar ve söndürücüyü florofordan ayırarak floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyali, farklı peptit varyantlarının bölünme verimliliğini kontrol etmek için tespit edilir ve analiz edilir.

Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

Bu video, florojenik bir peptit testi kullanılarak korku koşullandırılmış ve kontrol sıçan beyinlerinden lateral amigdalanın farklı hücre altı bölmelerindeki proteazom aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermektedir. Proteazom, florojenik peptit substratını parçalayarak, nükleer ve sinaptik protein fraksiyonlarındaki proteazom aktivitesini değerlendirmek için bir plaka okuyucu kullanılarak nicelleştirilen floresan molekülleri serbest bırakır. Artan nükleer aktivite, gen ekspresyonundaki...

Sıçan Beyninin Farklı Hücre Altı Bölmelerinde Proteazom Aktivitesinin Ölçülmesi

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Biz peptidler viral füzyon peptidler bölünme sitenin temsil eden proteaz proteolitik aktivite hızlı bir tarama sağlayan bir fluorogenic peptid bölünme tahlil mevcut. Bu yöntem aynı zamanda bir protein sıra içinde diğer amino asit motif üzerinde proteaz aktivitesi için test etmek için kullanılabilir.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Bu makale, alkalen fosfataz aktivitesi S. aureus biyofilm kültür 96-iyi doku kültürü plaka ölçmek için bir yüksek aktarım yöntemi...

Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Öğrenin proteaz aktivitesini kazein substratı kullanarak spektrofotometri ile ölçme yöntemini. Bu standart prosedür, laboratuvar kalite kontrolü ve enzim aktivitesinin niceliksel analizi için uygulanır.

Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Daha fazla video keşfet