Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Proteazlar laboratuvarda peptid bağlarını parçalar. Proteazların aktivitesini ölçmek ve/veya karşılaştırmak sıklıkla gereklidir. Sigma'nın evrensel proteaz aktivite testi, kalite kontrol prosedürlerimiz sırasında yaptığımız gibi, proteazların aktivitesini belirlemek için standardize edilmiş bir prosedür olarak kullanılabilir.

Bu analizde, test ettiğimiz proteaz kasyanı sindirdiğinde kasyan substrat olarak görev yapar. Diğer amino asitler ve peptid fragmanlarıyla birlikte tirozin amino asidi serbest kalır. Serbest tirozin daha sonra, spektrofotometrede absorbans değeri olarak ölçülebilen ve miktar tayini yapılabilen mavi renkli bir kromofor üretmek için folin ve kalai reaktifi veya folin reaktifi ile reaksiyona girer.

Kazeinden ne kadar fazla tirozin salınırsa, o kadar çok kromofor oluşur ve proteaz aktivitesi o kadar güçlü olur. Proteaz aktivitesi tarafından üretilen absorbans değerleri, absorbans değişimlerini ilişkilendirmek amacıyla belirli miktarlardaki tirozin ile FC reaktifinin reaksiyona sokulmasıyla oluşturulan bir standart eğri ile karşılaştırılır. Standart eğriden elde edilen mikromol cinsinden tirozin miktarı ile proteaz örneklerinin aktivitesi, dakikada kazeinden salınan mikromol tirozin eşdeğeri cinsinden birimler şeklinde belirlenebilir. Merhaba, ismim Carrie Cup Vineyard ve Missouri, St. Louis'teki Sigma Aldridge DeKalb tesisinde bilim insanıyım.

Bugün size, Sigma Aldridge bünyesinde proteaz aktivitesini test etmek için kullanılan ve evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem göstereceğim. Bu analizi, proteazı doğrudan laboratuvarınıza göndermeden önce yeterli aktiviteye sahip olduğundan emin olmak için temel olarak kalite kontrol alanımızda kullanıyoruz. Analize başlamadan önce, aşağıdaki reaktiflerin doğru şekilde hazırlandığından emin olmamız gerekmektedir.

pH 7.5'de 50 millimolar potasyum fosfat tamponu. Çözelti, kullanımdan önce 37 °C'ye getirilir; 1 litrede 6,5 mg/mL olacak şekilde karıştırılarak hazırlanan %0,65 ağırlık/hacim oranında kazein çözeltisi eklenir. Homojen bir dispersiyon elde edilene kadar çözelti sıcaklığı, hafifçe karıştırılarak yaklaşık 10 dakika boyunca kademeli olarak 80 ila 85 °C'ye yükseltilir.

Çözeltinin kaynatılmaması çok önemlidir. Ardından gerekirse pH, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit ile ayarlanır. 6,1 normal bir stok çözeltininle saf su ile 1'e 55 oranında seyreltilerek hazırlanan 110 milimolar trikloroasetik asit çözeltisi, 0,5 milimolar, fallen ve seal calts veya fallen fenol reaktifi ile karıştırılır; bu reaktif, tirozin ile reaksiyona girerek ölçülebilir bir renk değişimi oluşturacak olan çözeltidir.

Bu durum, proteazların aktivitesiyle doğrudan ilişkili olacaktır. Saf su içinde mililitre başına 53 miligram susuz sodyum karbonat kullanılarak hazırlanan 500 milimolar sodyum karbonat çözeltisi ve 37 °C'de pH 7,5'te beş milimolar kalsiyum içeren 10 milimolar sodyum asetat tamponundan oluşan bir enzim seyreltme çözeltisi kullanılır. Katı proteaz örneklerini çözmek veya enzim çözeltilerini seyreltmek için bu çözeltiyi kullanıyoruz.

Başlangıç konsantrasyonu 1,1 millimolar olan, L tirosinin 0,2 miligram/mililitre çözeltisi şeklinde hazırlanan L tirosin standart stok çözeltisi, saflaştırılmış su içinde hazırlanır ve tirosin çözünene kadar nazikçe ısıtılır. Kazein işlemini olduğu gibi, bu çözeltiyi kaynatmayın. L tirosin standardının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Gerektiğinde standart eğrimizi oluşturmak için bu çözelti daha da seyreltilecektir; önceden belirlenmiş aktiviteye sahip katı bir proteaz örneği, enzim dilüenti kullanılarak 0.1 ila 0.2 units per milliliter olacak şekilde çözülür. Bu çözelti, kalite kontrol analizi için pozitif kontrol görevi görür ve enzim aktivitesini belirlemek için gerçekleştireceğimiz hesaplamaların doğrulanmasını sağlar. Reaktiflerimizi hazırladığımıza ve hepsi uygun sıcaklığa geldiğine göre, proteaz analizine başlayabiliriz.

Bu analize başlamak için yaklaşık 15 mililitre hacme sahip uygun tüpler bulunuz. Test edeceğiniz her enzim için dört tüpe ihtiyacınız olacaktır. Tüplerden biri kör örnek olarak, diğer üçü ise üç farklı Aktivite analizini gerçekleştirmek için kullanılacaktır.

Proteazın seyreltilmesi; nihai hesaplamalarımızı birbirleriyle karşılaştırırken üç farklı seyreltme düzeyi yararlıdır. Dört adet tüpün her birine 0.65% kasian çözeltisinden 5 mL ekleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda yaklaşık beş dakika boyunca dengeye gelmelerini bekleyin. Ardından, kör numune hariç, test numunesi tüplerinden üçüne farklı konsantrasyonlarda enzim çözeltisi ekleyin. Tüpleri dairesel hareketlerle karıştırın ve tam olarak 10 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.

Bu inkübasyon süresince gerçekleşen proteaz aktivitesi ve buna bağlı olarak açığa çıkan tirozin miktarı ölçülecek ve test numunelerimiz arasında karşılaştırılacaktır. Bu 10 dakikalık inkübasyonun ardından, her tüpe beş mililitre TCA reaktifi ekleyin. Daha sonra, her tüpe (kör numune dahil) uygun hacimde enzim çözeltisi eklenerek, her tüpteki toplam enzim çözeltisi hacminin bir mililitre olması sağlanır.

Bu işlem, enzimin kendi absorbans değerini hesaba katmak için yapılır. Şimdi çözeltileri 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu 30 dakikalık inkübasyon süresinde, altı adet DR tüpü kullanarak tirozin standart dilüsyonlarını hazırlayabilirsiniz.

Bunlar altı flakona sekiz mililitreye kadar kolayca hacim sağlayabilir. 1.1 milimolar tirozin standart stok çözeltileri, mililitre cinsinden sırasıyla 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 ve 0.5 hacimlerinde eklenir. Kör örneğe herhangi bir tirozin standardı eklemeyin.

Az miktarda renk değişimi sağlayacak IPU test numuneleri için daha düşük standartlar gerekebilir. Tirozin standart çözeltisi eklendikten sonra, hacmi iki mililitreye tamamlamak için standartların her birine uygun miktarda saflaştırılmış su ekleyin. İnkübasyonun ardından, test çözeltilerinin her birini ve kör örneği filtreleyin.

0,45 mikronluk bir şırınga filtresi kullanılarak, iki mililitre test örneği ve boş filtrat, en az sekiz mililitre kapasiteli dört adet DR vialine eklenir. Standartların hazırlandığı viallerle aynı tip vialleri kullanabilirsiniz; standartlar ve standart boşu içeren tüm viallere beş mililitre sodyum karbonat eklenir ve en iyi sonuçlar için hemen ardından belirtilen reaktif eklenir; ardından sodyum karbonat test örneklerimize ve test boşuna eklenir. Sodyum karbonat eklendikten sonra bu çözeltilerin bulanıklaştığını fark edeceksiniz.

Ardından, serbest tirozin ile reaksiyona girecek olan çöktürücü reaktif eklenir. DRAM tüpleri dairesel hareketlerle karıştırılır ve bu işlemin ardından 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edilir. Standartların, eklenen tirozin miktarıyla ilişkili olarak renk gradasyonu gösterdiğini, en yüksek tirozin konsantrasyonlarının en koyu renkte göründüğünü fark etmelisiniz.

Test örneklerimizde belirgin bir renk değişimi olduğunu da fark edebilirsiniz. Bu çözeltilerden iki mililitre, 0.45 mikronluk bir şırınga filtresi kullanılarak uygun küvetlere filtrelenir. Analizimizi tamamladığımıza göre, spektrofotometreye geçip absorbans değerlerimizi kaydedelim.

Numunelerimizin absorbansı, 660 nanometre dalga boyu kullanılarak bir spektrofotometre ile ölçülür. Işık yolu bir santimetreye ayarlanarak standartlar, standart boşyla, farklı test numuneleri ve bir test boşu için absorbans değerleri kaydedilir. Tüm veriler toplandıktan sonra, standart eğrimizi oluşturmaya hazırız.

Eğriyi oluşturabilmek için standart ile standart boşluk arasındaki absorbans farkı hesaplanmalıdır. Bu, standart çözeltilerdeki tirozin miktarına atfedilen absorbans değeridir. Bu basit hesaplamanın ardından, standartlarımızın absorbans değişimini Y eksenine, beş standardımızın her biri için mikromol cinsinden miktarı ise X eksenine grafiğe dökerek standart eğrimizi oluştururuz.

Veri noktalarını girdikten sonra en uygun doğruyu (best fit line) oluştururuz, ardından test örneği absorbansı ile test körü absorbansı arasındaki farkı hesaplayarak test örneklerindeki absorbans değişimini buluruz. Standart eğrimize bakarak, test örneklerimizden birine ait absorbans değerini Y ekseninde belirleriz. Şimdi X eksenine paralel olarak, standart eğrimize ulaştığımız noktada duracak şekilde bir çizgi çizeriz.

Ardından, bu noktadan alınan X koordinatından, bu özel proteolitik reaksiyon sırasında serbest kalan tirozin miktarını ve mikromol değerini elde ederiz. Mililitre başına ünite cinsinden enzim aktivitesini belirlemek için şu hesaplamayı yapın: standart eğriden elde edilen serbest kalan tirozin eşdeğeri mikromol sayısını alın ve bunu, bizim durumumuzda 11 mililitre olan toplam analiz hacmi ile çarpın. Daha sonra bu değeri diğer üç niceliğe bölün.

10 dakika boyunca gerçekleştirdiğimiz analiz süresi, analizde kullanılan ve değişkenlik gösteren enzim hacmi; örneğin 1 ml kullanalım. Kolorimetrik tespit için kullanılan mililitre hacmi, kullandığınız küvet tipine göre farklılık gösterebilir.

İki mililitre kullanıyoruz. Tyrosine mikromol miktarının dakika cinsinden zamana bölünmesi, ünite olarak adlandırdığımız proteaz aktivitesi ölçümünü verir. Pay ve paydadaki hacim ölçümü birimlerini sadeleştirebiliriz; böylece mililitre başına ünite şeklinde bir enzim aktivitesi ölçümü elde ederiz.

Enzim dilüenti ile seyreltilmiş katı bir proteaz örneğindeki aktiviteyi belirlemek için, mililitre başına düşen aktivite birimini, bu analizde başlangıçta kullanılan katı maddenin miligram/mililitre cinsinden konsantrasyonuna bölüyoruz; böylece miligram başına birim cinsinden aktivite değerini elde ediyoruz. Sigma'nın üniversal proteaz aktivite analizi kullanılarak proteaz aktivitesinin nasıl analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken gördüğünüz üzere, hem kazein hem de tirozin çözeltilerini yavaşça ısıtmayı ve kaynatmamayı hatırlamak büyük önem taşımaktadır.

Ayrıca, hem standartlarınız hem de sahip olduğunuz her bir test örneği için farklı kör numuneler hazırlamanız kritik önem taşır. İşte hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve proteaz aktivite çalışmalarınızda başarılar dileriz.