Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Xenopus labus yumurta ekstraktları, nükleer montaj ve nükleer protein transportu gibi hücresel olayların in vitro rekonstitüsyonu için sitoplazmik ve organel materyali olarak faydalıdır. Sperm kromatin DNA'sı, kaba veya fraksiyone edilmiş XUS yumurta ekstraktlarından herhangi birine eklendiğinde, ekstraktda bulunan membran vezikülleri kromatin yüzeyine bağlanır, kaynaşır ve tam fonksiyonel sentetik çekirdekler oluşturmak için nükleer por bileşenlerini bünyesine katar. Bu süreçlerin moleküler temelinin karakterizasyonu, daha sonra ekstraktların immünosorpsiyon yoluyla boşaltılması ve protein modifikasyonu ile gerçekleştirilebilir.

Merhaba, benim adım Marie Cross. Atlanta, Georgia'daki Emory Üniversitesi Hücre Biyolojisi Bölümü'nde Dr. Maureen Power'ın laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bugün size, fraksiyone edilmiş ksenopus yumurta ekstraktları kullanarak in vitro çekirdek oluşumunun nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğiz. Bu prosedür; nükleer montaj reaksiyonunun gerçekleştirilmesi ve çekirdek oluşumunun değerlendirilmesi adımlarını içermektedir.

Hadi başlayalım. Nükleer montaja başlamak için, fraksiyone edilmiş sitozolden bir alikot alın ve 0,2 molar stoktan, final konsantrasyonu 20 millimolar olacak şekilde fosfokreatin ekleyin. Ardından, beş miligram per milliliter stoktan, final konsantrasyonu 50 micrograms per mil olacak şekilde kreatin kinaz ekleyin.

Son olarak, 0.2 molar stok kullanarak 20 micromolar A TP ekleyin. Ardından, hafif membranları sitozole 1'e 10 dilüsyonda ekleyin. Bu işlem, orijinal ham özütte bulunan membran miktarını yaklaşık olarak sağlar.

Membranları ekstrakt içinde dağıtmak için tüm bileşenleri pipetle yukarı-aşağı hareketlerle karıştırın. Bu işlem, sperm kromatini eklenmeden önce gerçekleştirilmelidir. Ardından, istenen konsantrasyonda sperm kromatinini fraksiyone edilmiş ekstrekte ekleyin ve ekstrakt ile spermi, ucu kesilmiş bir pipet ucuyla nazikçe yukarı-aşağı pipetleme yaparak derhal birlikte karıştırın.

Sperm kromatini ekstreye eklendiğinde, hemen dekondense olmaya, yoğunlaşmaya ve makaslamaya karşı duyarlı hale gelmeye başlar. Genellikle bu reaksiyonlar, toplam hacmi yüz mikrolitreden az olacak şekilde 500 mikrolitrelik santrifüj tüplerinde kurulur. Yumurta ekstreleri, 8.000 ila 9.000'e kadar oluşumu destekleyecektir.

Mikrolitre başına çekirdek sayısı; çekirdeklerin oluşmasını sağlamak için karışımı oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca inkübe edin. Çekirdekler boyama yöntemiyle görselleştirilir. Yaklaşık 30 dakika sonra, yeni oluşan çekirdekler küçük ve oval yapıda olacaktır.

DNA hâlâ oldukça yoğundur ve DNA yoğunlaştıkça, UV kanalında gözlemlendiğinde çekirdek, hook spinning nedeniyle düz açık mavi renkte görünmelidir. Ayrıca, mavi boyama daha az homojen olacak ve zamanla siyah boşluklar belirecektir. Çekirdek zarı oluşumu, tespit sıvısına erkek başına bir mikrogram 3,3-diaminocarboxamine veya DHCC ekleyerek görselleştirilebilir.

DHCC, floresein kanalında görüntülenen floresan lipofilik bir boyadır. Çekirdek birikiminin erken evrelarında, membran vezikülleri kromatin yüzeyine bağlanır ve yamalar halinde kaynaşmaya başlar. Bu durum, oluşan membranın düzensiz ve kesintili bir görünüm kazanmasına yol açar.

Membran tamamlandığında, nükleer yüzey üzerinde düzleşir ve DNA etrafında düzgün, kesintisiz bir halka şeklinde görünür. Çekirdeklere dahil olmamış membran vezikülleri nedeniyle çevreleyen sitozolde hatırı sayılır miktarda arka plan floresansı olacaktır. Size, xenopus yumurta ekstraktından elde edilen çözünür ve hafif membran fraksiyonlarını kullanarak in vitro nükleer yeniden yapılandırmayı göstermiş olduk.

Ham ekstraktın nükleer montaj için kullanılabileceğini, ancak dondurma ve çözme işleminden sonra kullanılamayacağını unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.