In Vitro İzole Nöronlar kurgulama için Lazer Cımbız

Ashkin, lazer cımbızlarının veya optik tuzakların mikroskobik boyutlardaki canlı nesneleri manipüle etmek için güçlü bir araç olduğunu gösteren ilk kişidir. Bu videoda, nöronları yakalamak ve hareket ettirmek için bu teknolojiyi nasıl uyguladığımızı göstereceğiz. Bu, optik cımbız iş istasyonudur.

Yeşil oklar, lazer ışınının mikroskop optikleri boyunca izlediği yolu göstermektedir. Mikroskop objektif lensi tarafından odaklanan bir lazer ışını bir hücre tarafından kırıldığında, ışık ışınının yönünü değiştiren kuvvet hücreye etki ederek hücreyi odak merkezine doğru hareket ettirir.

Bu, bir hücreyi ortam boyunca çekmek için yeterli olan Piko Newton düzeyinde kuvvet üretir. Bu videoda kapların hazırlanması, retinal hücrelerin hazırlanması, hücrelerin kültür kaplarına ekilmesi, lazer cımbız manipülasyonu ve hücre büyümesinin gözlemlenmesi hakkında konuşacağız. Hücreler cama yapıştığı için, hücrelerin cımbızla kolayca yakalanabileceği hücre itici bir alan oluşturmamız gerekti.

Kabın yarısı, hücre itici bir polimer olan poly hema ile kaplanmıştır. Diğer yarısı ise hücrelerimizin büyümesini destekleyen bir substrat olan cell one ile kaplanmıştır. İlk olarak, kabın hücre yapışkan tarafında bir hücre belirlenir.

Ardından başka bir hücre polimer tarafına hapsedilir ve her iki hücrenin eşleştirildiği yapıştırıcı tarafa taşınır. Kapları hazırlamak için, tozdan arındırılmış steril polistarl, 35 milimetre kültür kapları kullanıyoruz. İlk olarak, küçük bir torna veya sütunlu matkap ile tabanda bir santimetre çapında bir delik açıyoruz.

Asitle temizlenmiş lamelleri alın ve bunları çeker ocak gibi tozsuz bir ortama dik olarak yerleştirin. %95 alkol içinde çözülmüş polyus solüsyonunu alın ve lamelin sadece bir yarısının üst kısmına yakın bir yere birkaç damla damlatın. Poly hema'nın kurumasına izin verin. Lamelin polyus tarafını işaretleyin.

Kültür kabının altındaki deliğin etrafına S koruyucu yerleştirin. Lamını S koruyucu ile kaba yapıştırın. Poliamidin iç kısımda olduğundan ve S koruyucudaki boşluklardan herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun.

Lamelli, poly hema kaplamasının kenarı kabın merkezinden geçecek şekilde yerleştirin. Kabın iki ila üç gün boyunca kurumasına izin verin ve ardından, kabın mikroskop tablası üzerindeki konumlandırması için referans noktaları oluşturacak şekilde kabın tabanını elmas uçlu bir kalemle işaretleyin. Kapları çeker ocağa yerleştirin ve ultraviyole ışık altında sterilize edin.

Keçi anti-US antikor çözeltisinden bir veya iki damlayı, poli hemik kaplamanın üzerine dökmemeye dikkat ederek kabın poli olmayan tarafına damlatın ve yaklaşık üç saat bekletin. Çözeltiyi uzaklaştırın ve steril ringers ile yıkayın. Hücre bir antikor çözeltisini aynı bölgeye yerleştirin ve ertesi günkü deneye hazır hale getirmek için gece boyunca inkübe edin.

Laboratuvarımızdaki hücreler, yetişkin su fazı semender retinalarından türetilmiştir. Retinalar diseke edilerek çıkarılır ve enzimle sindirilir. Ardından, kültür kabına izole edilen hücreler ekilebilir.

Gözler çıkarılır. Kornea diseke edilir ve alınır. Göz çukuru steril Ringer çözeltisine yerleştirilir.

Retina, kavisli bir pensetin kenarıyla dışarı çıkarılarak göz çukurundan ayrılır. Karbondioksit ve oksijen, propan içeren bir ringer çözeltisi içinde kabarcıklandırılır ve ardından ultra ince 0,2 mikronluk bir filtre aracılığıyla sterilize edilir. Retinalar enzim çözeltisine yerleştirilir ve dokuyu parçalamak için ajitasyon altında yaklaşık 40 dakika boyunca digeste edilir.

Üç kez yıkadıktan sonra, retinalar tri ile disosiye edilir. Üç milimetrelik top uçlu pipet kullanılarak izole edilen hücreler, ekim öncesi ekime hazır hale getirilir. Besiyeri içeren kültür kabı mikroskop tablasına yerleştirilir ve kabın altındaki çizik işaretleri kullanılarak uygun şekilde yönlendirilir.

Bu, kabın tam konumunun gelecekte tekrar oluşturulabilmesini sağlar. Ardından hücreler, kabın hem poly hema hem de cell one tarafına ekilir. Kabın mikroskop tablasındaki konumu ve lazer gücü joystick ile kontrol edilir.

İlk olarak, kabın bir yanına yapışmış bir hücre belirledik. Bu hücre, dendritleri sayesinde tanımlanabilen retinal multipolar bir hücredir. Hücrenin konum koordinatları kaydedilir.

Bu, kabın polyus hücre itici tarafındaki bir çubuk fotoreseptör hücresidir. Kap alçaltılır, hücre lazer tarafından yakalanır ve kabın tabanından yukarı kaldırılır. Hücre şimdi kabın diğer tarafına, multipolar hücrenin koordinatlarına taşınmaktadır.

Aslında hücre sabittir; hareket eden kaptır. Hücre şu anda poly hemo kaplamanın kenarından geçmektedir.

Hücreden uzanan çıkıntı akson terminalidir. Hücre, hareketini engelleyebilecek olan kabın tabanındaki kalıntılardan ve diğer hücrelerden oldukça uzaktır. Kabın tabanındaki hücrelerin odak dışı görüntüleri arka planda görünmektedir.

Çomak hücre, multipolar hücreye ulaşır ve bu hücreden istenen noktaya ve mesafeye hassas bir şekilde konumlandırılabilir. Kap kaldırılır ve hücre, hücre alt tabakasına yapışır. Bu prosedürün temel avantajları, hangi hücrelerin taşınacağının seçilebilmesi ve manipülasyonların kapalı, steril bir deney ortamında gerçekleştirilebilmesidir.

Hücreden hücreye etkileşimler, video time-lapse veya dijital fotoğrafçılık ile izlenebilir. Lazer cımbızlar herhangi bir biyolojik teknikle birlikte kullanılabilir; burada, örneğin bir floresan tekniği, cımbızlarla hareket ettirilen hücreler arasındaki bağlantı noktalarında sinaptik proteinlerin varlığını göstermektedir.