Name: Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Öğrenin, fagositoz sonrası membran biyogenezindeki gen düzenlemesini Dual-Glo™ lusiferaz rapor geni testi ile nasıl analiz edeceğinizi. Lateks boncuk modeli kullanılarak hücresel yanıtlar incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hücre Kültürü <ol><li> İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri Stok kültürler antibiyotik bir kokteyl (penisilin ml başına 100 birimleri ve 100 mikrogram ile desteklenmiş Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM) oluşan &#39;orta A&#39;, 10-cm kültür yemekleri büyüdü. başına ml streptomisin sülfat) ve% 10 fetal sığır serumu (FBS). </li><li> Bir deney için hücreler kurmak için, orta emdi, ve hücreler 5 ml fosfat ile iki kez yıkanır tamponlu salin (PBS) çözümü. </li><li> PBS sonra kaldırılır ve 0.6 ml% 0.25 &#39;lik tripsin içeren bir çözüm ile değiştirilir. </li><li> Hücreleri ayırmak başlamıştır kadar çanak 37 ˚ C&#39;de yaklaşık 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Tripsin nötralize etmek için 5.5 ml orta eklenir ve hücrelerin hemasitometre sayılır. </li><li> Hücreler ml&#39;de 320.000 hücreleri için seyreltilmiş ve bir polylysine kaplı 96-kuyu kültür plaka başına 0.1 ml vazgeçtik. </li><li> 37 tabak doku kültürü inkübatör içine yerleştirin ° C% 8.8 CO2 içeren bir atmosfer ve 24 saat için büyümek. </li></ol> Transfections <ol><li> Transfections için hazırlanırken, deneysel koşullar başına yapılan ve plazmid miktarda transfekte olacak kaç çoğaltır düşünülmelidir. Biz rutin olarak üç nüsha halinde tüm koşulları yerine ve iyi plazmid DNA ortalama 50 ila 100 ng bir toplam transfect. Plazmid karışımları, en azından bir muhabir ateşböceği lusiferaz ve bir kurucu organizatörü kontrol plazmid ifade Renilla lusiferaz ifade inşa içermelidir. </li><li> Plazmid çözümler, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler pipetlenir ve serum ve antibiyotik DMEM örnek başına 10 ul ile desteklenebilir. 20 kuyu her 50 mg DNA ile transfekte Örneğin, 1 mg DNA 200 ul DMEM ekleyin. </li><li> DMEM / DNA çözüm mg DNA başına 3 ul &#39;Transit 293 reaktif&#39; (Mirus) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın ve numuneler oda sıcaklığında en az 10 dakika bekletin. </li><li> Bu dönemde, 96 kuyu kültür plaka medyayı çıkartın ve taze orta A. 90 ul ile değiştirin </li><li> Her biri 10 ul DMEM / DNA / Transit 293 karışımı ekleyin. </li><li> 37 tabak doku kültürü inkübatör içine yerleştirin ° C% 8.8 CO2 içeren bir atmosfer ve 24 saat için büyümek. </li></ol> Fagositoz <ol><li> Orta B artı (DMEM ve Ham F12 orta artı antibiyotik ve% 10 FBS bir 1:1 karışımı), ml başına sıfır 1 mg 0.75 mikron lateks boncuklar içeren süspansiyonlar hazırlayın. </li><li> 96-kuyu kültür plaka ortamı çıkarın ve orta B. boncuk süspansiyonlar 0.1 ml ile değiştirin </li><li> 1000 x g. az 2 dakika süreyle plaka Spin </li><li> Bu hücreler daha sonra 37 ˚ C&#39;de 6 ila 16 saat için kültüre. Koşulları ve lucifeares, artan muhabiri gen ekspresyonu 1 ila 3 saat sonra tespit edilebilir sürmek için kullanılan promotor bağlı. </li><li> Aynı durumda bu hücrelerin 30 ila 60 dakika süreyle boncuklar ile inkübe için gerekli olabilir, daha sonra adi boncuk kaldırmak ve ek süre hücreleri kuluçka önce taze medya eklemek için PBS ile 2 yıkar. </li></ol> Çift GloTM Lusiferaz Testi <ol><li> Not: bu kit kullanımı için protokol üretici tarafından önerilen bazı bakımlardan farklıdır. Bu örnek başına gerekli reaktiflerin miktarını azaltmak için modifiye edilmiştir. </li><li> -20 ˚ C&#39;de 1 M DTT, bölme, birden fazla küçük alikotları ve depoya bir çözüm hazırlayın </li><li> 20 mM Tris-HCl (pH 7.8),% 10 (v / v) gliserol ve% 0.5 (v / v) Triton X-100 içeren bir lizis tamponu hazırlayın. Kullanmadan önce, kısım, deney için gerekli bir miktar ve 1x 0.5 nihai konsantrasyonu 1 M DTT artı proteaz inhibitörü kokteyl ml başına 1 ul eklemek. Artık DTT çözümü yeniden etmeyin. </li><li> Çift GloTM kiti ilk kez kullanırken, bir şişe, Çift GloTM Lusiferaz Yüzey (sağlanan bir şişe Çift GloTM Lusiferaz Tampon (kit ile birlikte verilen) tüm içeriğini aktararak (ateşböceği) Lusiferaz Reaktif hazırlamak kiti ile). -20 ˚ C&#39;de 10 ml alikotları ve depoya kullanılmayan Lusiferaz Reaktif Böl </li><li> 96-plaka doku kültürü inkübatör çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Aspirasyon medya çıkarın ul için de lizis tamponu 40 ekleyin ve sonra 30 dakika buz üzerinde plaka bırakın. </li><li> Lusiferaz Reaktif ve sonra, ortalama bir beyaz, opak 96 plaka (OptiplateTM-96, Perkin Elmer katalog sayısı 6.005.290) kısım 15 ul 15 ul hücre lizat ekleyin. </li><li> Plaka 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra bir mikroplaka okuyucu lüminesans okuyun. </li><li> Kullanımdan hemen önce, 1 parçası Çift GloTM Durdur &amp; Glo ekleyerek Renilla lusiferaz substrat çözeltisi uygun miktarda hazırlamak ®Reaktif (kit ile birlikte verilen), 100 parça Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Tampon (kit ile birlikte verilen). </li><li> Her biri için 10 dakika oda sıcaklığında inkübe Renilla lusiferaz substrat çözeltisi 15 ul başına iyi, ekleyebilir ve daha sonra tekrar lüminesans ölçmek. </li></ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

membran biyogenez bir lusiferaz tabanlı reporter gen testi ile incelenmesi

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Membran biyogenezi sırasında farklı lipid sentez yollarının koordinasyon çalışma için, membran biyogenezi indüklenebilir bir şekilde ve hızla oluşan bir deneysel sistemi ile çalışmak için yararlıdır. Biz hücreler hızla parçacık engulfment sırasında malzeme sarma gibi kayıp membran havuzları doldurmak için membran lipidleri sentez olarak lateks boncuk fagositoz bu amaçlar için pratik olduğunu bulduk. Burada, Promega Dual-Glo Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Membran biyogenezi sırasında farklı lipid sentez yolaklarının koordinasyonunu incelemek için, membran... şeklinde bir deneysel sistemle çalışmak faydalıdır.

Merhaba, ben farklı lipid sentez yollarının koordinasyonunu, hafızayı ve biyogenezi inceleyen IL OV. Membran biyogenezinin hızlı ve indüklenebilir şekilde gerçekleştiği bir deneysel sisteme sahip olmak faydalıdır. Lateks boncukların fagozitosunun bu tür çalışmalar için özellikle yararlı olduğunu bulduk; çünkü hücreler, engulfment sürecinin başında sarmalama materyali olarak kaybedilenleri yerine koymak için çok hızlı bir şekilde yeni membranlar sentezlerler.Bu videoda, meslektaşım Ong Zang, fagozitozla tetiklenen gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için kullanılan, Lüsiferaz tabanlı raporlayıcı assay yaklaşımına dayalı prosedürleri gösterecektir. Merhaba, ben Harvard Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden X. Bugün size, fagozitoz sonrası membran biyojenezinde yer alan genlerin regülasyonunu analiz etmek için bir raporlayıcı gen assay'inin nasıl kullanılacağını göstereceğim. Haydi başlayalım.Bu prosedür için insan embriyonik böbrek 293 hücre kültürlerini kullanıyoruz. Bu hücreler, %10 fetal bovine serum (FBS) ve bir antibiyotik kokteyli ile desteklenmiş basal modifiye eagle ortamı (DMEM) olan Medium A içerisinde 10 santimetrelik kültür kaplarında büyütülür

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Video, lusiferaz etiketli proteinleri ölçmek için kullanılan lusiferaz testini göstermektedir. Tahlil, ilgilenilen bir protein ile konjuge edilen küçük parçaya bağlanan büyük bir parçadan oluşan tasarlanmış bir lusiferaz enzimi kullanır. Bağlı alt birimler, substratın varlığında ışıldayan bir sinyal yayan aktif bir enzim oluşturur. Bu sinyal daha sonra bir luminometre kullanılarak ölçülür.

Lusiferaz Testi: Tasarlanmış Nanolusiferaz Sistem Tabanlı Biyomuhabirler Kullanarak Lüminesan Sinyalleri Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Test

Bu video, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için bölünmüş lusiferaz tamamlama testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen proteinler, lusiferaz enziminin küçük ve büyük parçalarına etiketlenir. Proteinler etkileşime girdiğinde, büyük ve küçük fragmanlar, belirli bir substratın varlığında ölçülebilen parlak ışıldama açığa çıkaran aktif bir enzim kompleksi oluşturmak üzere birleşir.

Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Hücresel sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri belirlemek için bir vitro bioluminescence tahlil sunulur. Bu yöntem memeli hücre muhabir plazmid istikrarsızlığın luciferase dönem 2 gen düzenleyici denetimi altında ifade kullanır. Sirkadiyen ritim organ özgü etkileri değerlendirmek için diğer hücre tipleri için uyarlanabilir.

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Öğrenin, fagositoz sonrası membran biyogenezindeki gen düzenlemesini Dual-Glo™ lusiferaz rapor geni testi ile nasıl analiz edeceğinizi. Lateks boncuk modeli kullanılarak hücresel yanıtlar incelenir.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Daha fazla video keşfet