Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Merhaba, ben farklı lipid sentez yollarının koordinasyonunu, hafızayı ve biyogenezi inceleyen IL OV. Membran biyogenezinin hızlı ve indüklenebilir şekilde gerçekleştiği bir deneysel sisteme sahip olmak faydalıdır. Lateks boncukların fagozitosunun bu tür çalışmalar için özellikle yararlı olduğunu bulduk; çünkü hücreler, engulfment sürecinin başında sarmalama materyali olarak kaybedilenleri yerine koymak için çok hızlı bir şekilde yeni membranlar sentezlerler.

Bu videoda, meslektaşım Ong Zang, fagozitozla tetiklenen gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için kullanılan, Lüsiferaz tabanlı raporlayıcı assay yaklaşımına dayalı prosedürleri gösterecektir. Merhaba, ben Harvard Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü'nden X. Bugün size, fagozitoz sonrası membran biyojenezinde yer alan genlerin regülasyonunu analiz etmek için bir raporlayıcı gen assay'inin nasıl kullanılacağını göstereceğim. Haydi başlayalım.

Bu prosedür için insan embriyonik böbrek 293 hücre kültürlerini kullanıyoruz. Bu hücreler, %10 fetal bovine serum (FBS) ve bir antibiyotik kokteyli ile desteklenmiş basal modifiye eagle ortamı (DMEM) olan Medium A içerisinde 10 santimetrelik kültür kaplarında büyütülür. Bir standartlaştırma tekniği kullanılarak hücreler kabın tabanından ayrılır, sayılır ve ardından poly-L-lysin kaplı 96 kuyucuklu plakalara ekilerek transfeksiyonlar başlayana kadar 24 saat boyunca büyütülür.

Transfeksiyonumuzda, tüm koşulları rutin olarak üç tekrarlı gerçekleştiririz ve kuyu başına toplam 50 ila 100 nanogram plazmit DNA transfekte ederiz. Plazmit karışımları, en azından ateş böceği lusiferazı eksprese eden raporlayıcı konstrüktü ve konstitütif bir promotörden renal lusiferaz eksprese eden kontrol plazmitini içermelidir. Başlamak için, serumsuz ve antibiyotiksiz DMEM ile trans 2 9 3 transfeksiyon reaktifi karışımı hazırlayın; transfekte edilecek her bir kuyu için 10 mikrolitre DMEM kullanın ve her bir mikrogram plazmit DNA için 3 mikrolitre trans 2 9 3 reaktifi ekleyin.

Örneğin, her birinde 50 nanogram DNA'nın, 200 mikrolitre DMEM içerisine üç mikrolitre trans 2 9 3 reaktifi ile transfekte edileceği 20 kuyucuk için: Çözelti, defalarca pipetleme yapılarak karıştırılır ve ardından oda sıcaklığında en az beş dakika boyuncaye müdahale edilmeden bırakılır. Ardından, DNA ayrı mikrosantrifüj tüplerine pipetle aktarılır. Stok çözeltilerimizin konsantrasyonları genellikle mikrolitre başına 10 ve 100 nanogram arasındadır.

DM M geçiş karışımı beş dakika boyunca inkübe edildikten sonra DNA tüpüne aktarılır ve çözelti pipetleme yoluyla tekrar karıştırılır. Ardından örnekler oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletilir. 20 dakikalık inkübasyon sırasında, 96 kuyucuklu kültür plakasındaki besiyeri uzaklaştırılır ve yerine 19 µL taze besiyeri A eklenir; inkübasyon tamamlandığında, her bir kuyucuğa 10 µL D-M-M-D-N-A transle üçlü karışımı eklenir.

Karışım, mevcut sıvının içine doğrudan pipetle aktarılmalıdır. Pipet ucunun tüpün çeperine değmesine izin vermeyin. Ayrıca, incelenmeden bırakılacak üç adet hücre kuyucuğunun dahil edilmesi de önemlidir.

Bu kuyucuklardaki ortalama lusiferaz aktivitesi daha sonra arka plan olarak çıkarılacaktır; 96 kuyucuklu plakayı 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin ve hücreleri 24 saat boyunca büyütün. 24 saatlik inkübasyon tamamlandığında, membran biyosentezinin ve laks boncuklarının biyosentezinin indüklenmesi işlemine geçilir. Başlamak için, hücre kültürü ortamı ve laks boncuğu içeren bir süspansiyon hazırlayın.

Bunu yapmak için, DMEM ile antibiyotikli F-term ortamının ve %10 FBS'nin bire bir karışımı olan B ortamını hazırlayın. Ardından, mililitre başına 1 mg'a kadar konsantrasyonlarda 0,75 mikronluk lateks boncuklar ekleyin. Elbette, her deney, boncuk eklenmeyen kontrolleri de içermelidir.

Ardından, 96 kuyucuklu kültür plağındaki medyumu boşaltın ve her bir kuyucuğa 100 µL boncuk süspansiyonu ekleyin. Süspansiyon eklendikten sonra, plağı 1000 G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Bu işlem, boncukların kuyucuk tabanında yoğunlaşmasına yardımcı olur ve fagositozu kolaylaştırır. Daha sonra, hücreleri 37 °C'de altı ila 16 saat boyunca inkübe ederek yakalayın.

Koşullara ve lusiferaz artışını yönlendirmek için kullanılan promotöre bağlı olarak, promotör gen ekspresyonu bir ila üç saat sonra tespit edilebilir. Bazı deneyler için, örneğin, belirli ilaçların partikül yönetimine etki etmeden lipid sentezi üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, fal'ı lipid sentezinden ayırmak gerekebilir. Bu gibi durumlarda, hücrelerin boncukları sitoz etmek için 30 ila 16 dakika boyunca boncuklarla inkübe edin.

Bu inkübasyondan sonra, bağlanmamış boncukları uzaklaştırmak için hücreler PBS ile iki kez yıkanır. Ardından taze besiyeri eklenir ve rapor gen ekspresyonu için hücreler altı ila 16 saat boyunca inkübe edilir. Artık ferous analizlerine geçmeye hazırız.

Lucifer assaylarına başlamak için; 20 mM Tris-HCl pH 7,8, %10 (v/v) gliserol ve %0,5 (v/v) Triton X-100 içeren bir xis tamponu hazırlayın; deney için gerekli olan yeterli miktarda hazırlık yapın. Ardından, mililitre başına bir mikrolitre olacak şekilde 1 M DTT ekleyin. Artan DTT çözeltisini tekrar kullanmayın.

Ardından, nihai konsantrasyonu 0.5 ila 1 kat olacak şekilde bir proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Dual-Glo kitini ilk kez kullanırken, bir şişe Dual-Glo luciferase tamponunun tüm içeriğini bir şişe Dual-Glo luciferase substratına aktararak ateş böceği lusiferaz reaktifini hazırlayın. Kullanılmayan lusiferaz reaktifini 10 mm'lik tüplere bölün ve -20 °C'de saklayın. Lusiferaz reaktifi hazır olduğunda, 96 kuyucuklu plakayı doku kültürü inkübatöründen çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, medyumu aspirasyon yoluyla uzaklaştırın, ardından her kuyucuğa 40 µL lizis tamponu ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Ardından, her kuyuya 15 µL Lucifer reaktifi ekleyin. Beyaz opak 96 kuyucuklu plaka olarak Perkin S optive plate 96 kullanıyoruz. Daha sonra 15 µL hücre lizatı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

10 dakika sonra, lüminesansı bir mikroplaka okuyucuda ölçün. Ardından, kontrol plazmidi için veri elde etmek amacıyla standart lusiferaz analizini gerçekleştirin. Bunun için, hemen öncesinde, 100 birim stop ve glow reaktifine bir birim dual glow ekleyerek uygun miktarda lusiferaz substrat çözeltisi hazırlayın.

Dual glow, stop ve glow tamponu. Ardından, her bir kuyucuğa 15 µL substrat solüsyonu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından lüminesansı tekrar ölçün.

Lütfen bu dual glow ferous analizleri için üreticinin önerdiği protokolü modifiye ettiğimizi unutmayın. Pro numune için gerekli reaktif miktarını azaltmak amacıyla, plaka artık bir plaka okuyucu kullanılarak yeniden analiz edilebilir. Veriler mikro plaka okuyucu ile toplandıktan sonra, daha ayrıntılı analizler için Microsoft Excel gibi bir hesap tablosu programına aktarılabilir.

İlk olarak, rezekte edilmemiş üç kuyucuğun ortalamasını hesaplayın ve bu değeri her bir veri noktasından çıkarın. Ardından, her bir transfekte kuyucuk için ateş böceği lusiferaz değerini bölün. Bunu lusiferaz için yapın ve ardından her bir üçlü örnek seti için ortalamayı, sapmayı ve varyasyon katsayısını hesaplayın.

Örneğimizde, x eksenine yerleştirilen farklı boncuk konsantrasyonlarını, ateş böceği lükiferaz aktivitesinin vanilla lükiferaz aktivitesine oranına karşı grafiğe döktük. Görebileceğiniz üzere, bu oranda doza bağımlı bir artış söz konusudur. Lateks boncukların fagositozuna yanıt olarak LDL reseptör promotöründen meydana gelen ekspresyonu ölçmek için lükiferaz tabanlı bir reporter gen assay'inin nasıl kullanılacağını göstermiş olduk.

Bu işlemi gerçekleştirirken, transfeksiyon anında hücrelerin yalnızca %80 ila %90 oranında konfluente olduğundan emin olmanın önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.