Name: Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin Xenopus laevis oositlerinde iyon kanalları için yama kelepçe kaydı tekniklerini. Gigaohm mühür oluşturma ve dışa dönük yama yapılandırması ile hücre fizyolojisi araştırmaları için güvenilir veri elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Daraltma çözüm tarifi RW Aldrich laboratuar. Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı, Amerikan Kalp Derneği, Müsküler Distrofi Derneği, Donald B. ve Delia E. Baxter Vakfı, Klingenstein Fonu ve McKnight Endowment for Neuroscience için: Biz aşağıdaki finansman kuruluşları ve vakıflar destek için teşekkür ederiz.

Bölüm 1: vitellin membran Çıkarma <ol><li> Forseps iki set hazırlayın. Biz bir takım hafif bir dosya ile bilenmiş olmuştur No: 5 forseps tercih ediyor. Ayrıca 7 &quot;Pasteur pipeti kırparak ve yangın parlatma, bir cam transferi pipet hazırlar. </li><li> Önerilen: oosit kaymasını önlemek için, ızgara bir daire (1 mm kareler) kesme ve 60mm bir Petri kabı altına yapıştırıcı. Bu yemek, kullanımlar arasında temiz tutulması halinde süresiz olarak yeniden kullanılabilir. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu altında Hiperozmatik çözüm (reçete) ve yeri ile yarım Petri kabı doldurun. </li><li> Çanak içine cilalı Pasteur pipeti ve yer ile inkübasyon çözüm 1-3 Xenopus oositleri çıkarın. </li><li> 15 saniye bekleyin hücreler için 2 dakika küçülmeye başlar. Kat daha uzun kabuğu hücreleri kolaylaştırır, daha kısa sürelerde yama için sağlıklı hücrelere yol. </li><li> Hücre küçülür olarak vitellin zarı, hücre üzerinde şeffaf bir tabaka olarak zor görünür olmaya başlayacaktır. Soymak için sağlıklı bir hücre (loca veya kusurları olmadan) seçin. </li><li> Forseps bir çift ile, plazma membranına zarar vermeden vitellin membran hafifçe kavrayın. Diğeri ile aynı noktaya yakın kavrayın ve yavaşça dışında açık zarı yırtılma ve hücre ücretsiz. </li><li> Pasteur pipeti ile dikkatli bir şekilde hücre kayıt odasına taşıyın. Hücre vitellin çıkarılmasından sonra kırılgan unutmayın. </li></ol> Bölüm 2: Gigaseal nesil <ol><li> Serum fizyolojik ile bir kayıt pipet doldurun. Pipet kapasitans en aza indirmek için elektrot teli ile iyi elektriksel temas yapan çözüm minimum hacim kullanın. </li><li> Elektrot teli üzerine yüzer ve slayt kabarcıkları izin pipeti birkaç kez hafifçe vurun. Doldurulmuş pipet basınç uygulayın. Bu, ağız yoluyla ya da bir evcil hayvan mağazasından bir akvaryum pompası ile yapılabilir. Bu basınç, sıvı arayüzü ve hücre gider haç gibi pipet temizler tutmak için kritik öneme sahiptir. </li><li> Odasında oosit bulun ve hücrenin kenar keskin bir odak. </li><li> Pipet ile banyo, merkezi hücrenin üstündeki (odak) ucu. Bu en aza indirir mühür nesil önce banyo harcanan. </li><li> Hücreye sonraki netleşiyor pipet aşağı bırakın. Yakın (~ 50 mikron) haline getirin. Çözüm küçük bir bozulma, geri basınç pipet itti göreceksiniz. </li><li> Yama kelepçe yazılımı kullanarak, pipet direncini kontrol edin (M hedefimiz yaklaşık 3-4) ve ofset gerilimi kullanarak mevcut sıfır. </li><li> Görsel direnç izleme veya frekans direnci ile orantılı bir ses üretir bir ses monitör kullanırken pipet üzerinde pozitif bir basınç ile, hücre doğru yavaş yavaş ucu hareket. Ucu hücre dokunmaya başladığında, direnç artacaktır. </li><li> Aniden fakat nazikçe yaklaşık olarak aynı mutlak değeri negatif basınç olumlu geçiş. Direnç oluşumu mühür artırmanız gerekir. </li><li> Zaman çoğunluğu, mühür oluşumu birkaç saniye içinde oluşur ve bazen 30-60 saniye gereklidir. </li><li> Direnç 1GΩ sonra, basınç nötr serbest bırakılabilir. Artık on-hücreli bir yama var. Tersyüz olmuş bir yama için, hızla hücre uzak çekin. Dış-çıkış için aşağıya bakın. </li></ol> Bölüm 5: Dış çıkış topolojisi (isteğe bağlı) <ol><li> Gigaseal, rüptür membran ulaşmak hemen sonra. Bu keskin emme, ancak biz 1 V darbe 1 ms için bir tercih olabilir. Direnci ilk pipet direnci biraz daha düşmesi gerekir. </li><li> Pipet yavaşça ve yumuşak bir hücre uzak hareket ettirin. Pipet ile hücre çekin bir bölümünü göreceksiniz. Aniden, ve birkaç saniye içinde, hücre geri yapışır ve direnişin GΩs hemen ve aynı anda dönmelidir. </li><li> Şimdi, dışarıdan yapılandırma bir yama var. Dahil herhangi bir iyon kanalları ectodomains banyosuna maruz kalmaktadır. </li></ol> Bölüm 6: Beklenen Sonuçlar Genel olarak, daha yüksek bir direnç mühürler tercih edilen ve uzun ömürlü. 10 GΩ yüksek kaliteli contalar için iyi bir rehber. Deneyimlerimize göre, bu kalite mühürler alma şansını kalitesi özellikle hücre ve pipet birçok faktöre göre değişir. Sağlıklı hücre, temiz pipetler ve deneyimli bir araştırmacı Patch satın alma oranları% 95 üzerinde olabilir. Bu yamalar birçok dakika sürecek ve tek kanallı kayıtları da dahil olmak üzere Xenopus oositleri ifade iyon kanalları, herhangi bir elektrofizyolojik çalışma için uygundur.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Burada tartışılan elektrofizyolojik kayıt birçok parametre vardır. Rig kurulum, sistem gürültü yönetimi, kanal ifadesi, ve kayıt protokolleri iyi deneysel sonuçlar da kritik öneme sahiptir. Deneyimlerimize göre, bu güvenilir mühürler oluşturan en önemli parametreler şunlardır: banyo girerken yüksek kalitede oosit, (nam-ı diğer &quot;soyma&quot;) hızla vitellin membran kaldırarak, tozdan korunan yeni çekilmiş pipetler, pürüzsüz pipetler, uygulanan pozitif basınç çözümü, kapatılmadan önce banyoda kısa kez. Bu varlık deneyimi yaygın ol...

<table><tbody><tr><td>Yama Kenetleme Amplifikatörü &amp;Yazılım</td><td>Enstrüman</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>Veya benzeri başka bir cihaz (örneğin HEKA EPC-9 veya Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>5 numara penset (iki çift)</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oosit büzme çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td></td><td></td><td>Bileşen N-metil-D-glukamin 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartik Asit 220
KCl 2
pH'ı N-metil-D-glukamin ile 7,4'e ayarla</td></tr><tr><td>dokuma ağ</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oosit ifade İyon kanalları patch kelepçe kaydı

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Sakmann ve Neher 1, 2, geliştirme bu yana, yama kelepçe hücreleri tekli veya çoklu iyon kanallarının elektrofizyolojik ölçüm için son derece yararlı bir teknik olarak kurulan haline gelmiştir . Bu teknik, kendi doğal ortamında hem de iyon kanalları için uygulanabilir ve heterolog hücreleri, Afrika pençeli kurbağası, Xenopus laevis hasat oosit gibi ifade edilebilir. Burada, Xenopus oositleri yama kelepçe kayıt köklü bir tekniktir açıklar. Bu teknik, bireysel olarak nüfus (macropatch) ya da (tek kanallı kayıt) olarak ifade iyon kanalları özelliklerini ölçmek için kullanılır. Oosit hazırlanması ve conta üretimi kalitesini en üst düzeye çıkarmak için teknikleri üzerine odaklanır. Tüm faktörleri optimize edilmiş, bu tekniğin başarılı conta üretimi yüzde 90 üzerinde bir olasılık verir. Bu süreç, o en önemli buluntu faktörlere dayanan her araştırmacı tarafından farklı olarak optimize edilmiş, ve biz elimizde en büyük başarısı için yol var yaklaşım mevcut olabilir.

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Sakmann ve Neher tarafından geliştirilmesinden beri 1, 2, patch clamp, elektrofizyolojik ... için son derece yararlı bir teknik olarak kabul edilmiştir.

Bu prosedür, patch clamp kayıtları için gerekli olan giga ohm dirençli mühürlerin başarıyla oluşturulabilmesi amacıyla Opus Cytes'den vilin membranının uzaklaştırılmasıyla başlar. On-cell patch clamp konfigürasyonu elde edildikten sonra, "whole cell patch" konfigürasyonu olarak bilinen durumda, hücrenin sitoplazmasına elektriksel erişim sağlamak için pipete vakum uygulanabilir. Daha sonra, kanalların ekto domainlerinin banyo çözeltisine maruz kaldığı küçük bir membran yaması elde etmek için, pipet ucu geri sıçrayana kadar plazma membranından uzaklaştırılabilir; bu işlem "outside-out patch" konfigürasyonu olarak bilinir. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Fizyoloji Bölümü'nde Dr. Miriam Goodman'ın laboratuvarından Austin Brown.Ben de Goodman Laboratuvarı'ndan Brandon Johnson. Önceki bir videoda, elektrofizyoloji için patch clamp pipetlerinin ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını göstermiştik. Bugün, zpa'da eksprese edilen iyon kanallarının patch clamp kaydına giriş yapacağız.1970'lerin sonlarında S. Sacramento ve arkadaşları tarafından geliştirilmesinden bu yana, yama kenetleme (patch clamp) kaydı, hücrelerdeki tekli veya çoklu iyon kanallarının elektro

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Kesik açık vazelin boşluk yaklaşım hızlı kanal kinetiği yüksek çözünürlüklü Xenopus oositlerde eksprese edilen voltaj-bağımlı iyon kanallarının iyonik ve yolluk akımlarının düşük ses kayıtları elde etmek için kullanılır. Küçük değişiklikler ile, voltaj kıskaç fluorometri kesme açık oosit protokolüne akuple edilebilir.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

Öğrenin Xenopus laevis oositlerinde iyon kanalları için yama kelepçe kaydı tekniklerini. Gigaohm mühür oluşturma ve dışa dönük yama yapılandırması ile hücre fizyolojisi araştırmaları için güvenilir veri elde edin.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Daha fazla video keşfet