Name: Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Öğrenin, programlanabilir çektirme cihazı kullanarak elektrofizyoloji için patch-pipet ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını. Bu yöntem, nörobilim araştırmalarında yüksek kaliteli cam mikroelektrot üretimini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı, Amerikan Kalp Derneği, Müsküler Distrofi Derneği, Donald B. ve Delia E. Baxter Vakfı, Klingenstein Fonu ve McKnight Endowment for Neuroscience için: Biz aşağıdaki finansman kuruluşları ve vakıflar destek için teşekkür ederiz.

Çekme pipetler Sutter P-97 Flaming / Kahverengi olarak çektirmesi gibi bir mikroelektrot kullanarak, yaklaşık 10-20 pipetler bir set çekin. <ol><li> Kılcal cam seçin. Biz borosilikat (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm, dış çapı, iç çapı 1.1mm, uzun 10cm) kullanın. Temiz ve tozsuz kalır cam dikkatlice saklayın. </li><li> Çekme programı tasarlayın. Biz her aşamasında, ısı ve hızı azalan ve son adım küçük bir çekme, 5 adım programı kullanabilirsiniz. Sutter pipetle yemek kitabı uygun programlar geliştirmek için mükemmel bir referans. </li><li> Pipet uçları açılış çap ve pürüzsüzlük belirlemek için mikroskop altında inceleyin. Kaba, düzensiz ya da düzensiz ipuçları atın. Iyi bir çekme protokol, bu nadir sağlamalıdır. Standart patch-klemp kayıt için 1-3 mikron çapında, ucu açıklıklar olmalıdır. Dik konik (künt uçlu) aynı açılması çapı için direncini düşürmek için yol açar. Şekil ve büyüklük basınç parlatma tarafından değiştirilebilir. </li></ol> Yangın parlatma pipetler <ol><li> Parlatma teçhizat (microforge), bir ayak pedalı ile kontrol edilen bir platin ısıtma filament ile ayarlayın. Yararlı bir kiti ALA Bilimsel (CPM-2) veya benzer bir aparat parça parça monte edilebilir. </li><li> İsteğe Bağlı: Kat kapasitans azaltmak ve gürültü özelliklerini iyileştirmek için bir yalıtkan ile pipet. Biz diş balmumu kullanın. Sylgard 184 ™ (PDMS olarak da bilinen poli-dimetil siloksan elastomer) da bir seçenektir. </li><li> Mumu kullanıyorsanız, yakındaki küçük bir erimiş kaynağı tutmak. Pipet girerek mum tutmak için pipet arka tarafında hava basıncı ile sıvı balmumu içine ucu kısaca daldırma ve çıkartın. Sylgard ile mağaza hazırlanmış dondurulmuş alikot elastomer ve mikroskop altında pipet boya. Elastomer tedavisi için ısıtın. </li><li> Parlatma cihazı pipet (kaplı ya da değil) koyun ve ucu ~ 50 mikron filamandan getirmek. Isıtıldığında filament genişletmek olacağını aklınızda bulundurun. </li><li> Önerilen: en iyi direnç ve bahşiş çapı için pipet şeklini değiştirmek için &quot;baskı parlatma&quot; için ayrı protokol izleyin. </li><li> Kısa bir ısı darbe (1-2 saniye), pipet ucu balmumu kaldırmak ve camın pürüzsüz yeterli. </li><li> Bitmiş pipet, tozdan korumak için 10 başarılı pipetler için tekrarlamak kapalı bir kutu yerleştirin. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Protokol resimli, elektrofizyoloji laboratuarlarında günlük kullanım hem de hücreler ve hayvanlar için enjeksiyon iğneleri yapmak için kullanılır. Programlanabilir çektirmesi ile, çeşitli kullanımlar için pipetler yapmak kolaydır. Çektirmesi üzerine, dikkat ve itina ile filament bir yıl veya daha uzun sürecek. Denemelerinizin iyi şanslar.

<table><tbody><tr><td>Mikropipet Çekici</td><td>Enstrüman</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Veya benzer bir enstrüman (örn. Sutter P-87 veya P-2000)</td></tr><tr><td>Cam Kılcallar</td><td>Reaktif</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>Veya benzer bir kılcal cam. Pipetin doldurulmasını kolaylaştırmak için cam filamanlı bir kılcal kullanın.</td></tr></tbody></table>

programlanabilir Çektirme patch-pipetler ve sharp elektrotlar

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Cam Mikroelektronlar (pipetler denir), on yıllar boyunca elektrofizyoloji, bir beygir olmuştur. Bugün, pipetler, cam kılcal damarların programlanabilir çektirmenin kullanarak yapılır. Bu tür araçların ısı, bir metal filament veya lazer ve yerçekimi, bir motor veya her ikisini birden kullanarak cam çizmek ya kullanarak kılcal. Intrasellüler kayıt için keskin elektrotlar, ısı, yerçekimi, ve bir motor bir kombinasyonunu kullanabilirsiniz patch-klemp kayıt için Pipetler, sadece ısı ve yerçekimi kullanılarak oluşturulur. , Hücre içi kayıt pipetler yapmak için kullanılan prosedür Crna Xenopus oosit içine enjeksiyon dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için enjeksiyon iğneleri, yapmak için kullanılan benzer. Ise dar cam hücre içi kayıt (dış çapı = 1.0 mm) için kullanılan genel, kılcal cam &lt;1.2 mm çap, pipetler için yama kelepçe kayıt yapmak için kullanılır. Her araç için, çektirmenin biraz farklı programlanmıştır. Bu video kayıt pipetler, önceden belirlenmiş çektirmenin programları kullanarak her iki tür nasıl gösterir.

Bu video elektrofizyoloji için yama pipetler ve keskin elektrotlar yapmak için programlanabilir çektirmenin nasıl kullanılacağını gösterir. Aynı prosedürü enjeksiyon iğneleri de dahil olmak üzere, çeşitli cam aletleri yapmak için kullanılan olabilir.

Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar

Cam mikroelektrotlar (pipetler olarak da adlandırılır), onlarca yıldır elektrofizyolojinin temel araçları olmuştur. Günümüzde, bu pipetler cam kılcal borulardan üretilmektedir...

Cam kılcal pipetler; tek hücreli elektroporasyon, DNA mikroenjeksiyonu ve patch clamp elektrofizyolojisi gibi çok çeşitli teknikler için laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kayıtlar için cam kılcal patch clamp elektrotlarını hazırlamak amacıyla, programlanabilir bir çekici cihazda silikat cam çekilir. Elektrot uçları balmumu ile kaplanır, ardından uçlar ateşle cilalanır ve gelecekteki kullanımlar için saklanır. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Fizyoloji Bölümü'nden Miriam Goodman.Bu videoda, elektrofizyoloji için patch clamp pipetlerinin ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Pipetler olarak da adlandırılan cam mikroelektrotlar, onlarca yıldır elektrofizyolojinin temel araçları olmuştur. Günümüzde bu pipetler, programlanabilir bir çekici kullanılarak cam kılcal borulardan imal edilmektedir.Hadi başlayalım. Patch clamp pipetleri hazırlamak için temiz ve tozsuz olan Sutter borosilikat kapilerler ve Sutter P 97 alevli taşlamalı mikro elektrot çekici kullanıyoruz. Sutter'ın Pipette Cookbook'u, uygun çekme programları geliştirmek için mükemmel bir referanstır.Başlamak için, çekicinin üzerindeki toz kapağını kaldırın. Ardından kutudan bir adet cam kapiler tüp alın. Toz birikimini en aza indirmek için kapağı tekrar kapatmayı unutmayın.Ardından, bir elinizle kapiler tüpü filamentin bir yanındaki yuvaya kaydırın ve kelepçeyi hafifçe sıkın. Bu aşamada kelepçe, tüpün düşmesini engelleyecek kadar sıkı, ancak tüpü yuva içine kaydırabileceğiniz kadar gevşek olmalıdır. Şimdi, aynı taraftaki yaylı metal durdurucuyu serbest bırakın.Ardından başparmağınız ve işaret parmağınızla her iki taşıyıcının altına takılı olan metal sekmeleri kavrayın. Diğer yaylı metal durdurucuyu serbest bırakın. Taşıyıcıları gidebildikleri kadar birbirine doğru çekin ve bir elinizle yerinde tutun.Ardından, tüpü filament yuvasından geçirerek diğer taraftaki taşıyıcının kanalına yerleştirin. Camın ısıtma filamentine itilmemesine dikkat edin. Her iki taraftaki kelepçeleri sıkın.Taşıyıcıları yerinde tutacak kadar sıkı olmalı, ancak camı kıracak kadar sıkı olmamalıdır. Şimdi, toz kapağını kapatın ve yeşil düğmeye basın. Patch clamp kayıtları için işaretli uçlu pipetler, her adımda azalan ısı ve hızla uygulanan beş adımlı bir çekme programı ve son adımda oluşturulan küçük bir uç kullanılarak hazırlanır.Bu program ısı ve yerçekimini kullanır. Sivri elektrotlar hazırlama prosedürü çok benzerdir, ancak bu durumda dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,78 mm olan Warner Instruments marka ince cam kılcal boru kullanıyoruz. Ayrıca, çekme programları tamamlandığında, ısı ve yerçekimine ek olarak bir motor kullanan bir çekme programı uyguluyoruz.Toz kapağını kaldırın, her iki kelepçeyi gevşetin ve tamamlanmış pipeti çıkarın. Ardından pipetleri bir çalışma kutusuna yerleştirin. Kutu, plastik bir pipet ucu kutusunun rafına bir sünger şeridinin yapıştırılması ve ardından süngere altı ila sekiz adet yarık açılmasıyla hazırlanabilir.Pipetleri yuvalara yerleştirin. Kutu çekilmiş pipetlerle dolduğunda, pipetleri ateşle cilalamak için ateşle cilalama adımına geçin. Ateşle cilalama işlemine başlamadan önce, ayak pedalıyla kontrol edilen platinyum bir ısıtma filamentine sahip bir mikro ocak düzeneği kurun.Kapasitansı azaltmak ve gürültü karakteristiklerini iyileştirmek için önce pipeti diş hekimi mumu ile kaplayın. Bunu yapmak için, yakınınızda küçük bir miktar eritilmiş mum bulundurun. Mumun uca girmesini önlemek için pipetin arka kısmından hava basıncı uygulayın.Ardından ucu kısa bir süre sıvı muma daldırın ve hemen çıkarın. Pipeti parlatma düzeneğine yerleştirin ve ucu filamente yaklaşık 50 mikron mesafe gelecek şekilde yaklaştırın.Filamanın ısıtıldığında genişleyeceğini unutmayın. Pipetin ucundaki mumu temizlemek ve camı düzeltmek için bir veya iki saniyelik kısa bir ısı darbesi uygulayın. Açıklık çapını ve pürüzsüzlüğünü belirlemek için pipet uçlarını bir mikroskop altında inceleyin.Standart patch clamp kayıtları için uç açıklıkları bir ila üç mikron çapında olmalıdır; pürüzlü, düzensiz veya heterojen uçları atın. Hazırlanan pipeti, pipetleri tozdan korumak için kapağı kapattığınızdan emin olarak bir çalışma kutusuna yerleştirin ve 10 başarılı pipet elde edene kadar işlemi tekrarlayın. Size programlanabilir bir çekici kullanarak patch clamp pipetleri ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını göstermiş oldum.Aynı prosedür, optimal patch clamp sonuçları için enjeksiyon iğneleri dahil olmak üzere çeşitli cam araçların yapımında kullanılabilir. Yeni, tozsuz pipetlerin deney gününde çekildiğini ve deneyden önceki bir saat içinde parlatıldığını hatırlamak önemlidir. Ayrıca pipetlerin pürüzsüz ve parlatılmış olduğunu gözle muayene ederek doğrulayın.Opus oositlerde eksprese edilen iyon kanallarının patch clamp kaydının nasıl yapılacağını gösteren diğer videomuzu izlediğinizden emin olun. Tamam, işte bu kadar. Artık bir pipet uzmanısınız, deneylerinizde başarılar dileriz.

making-patch-pipettes-and-sharp-electrodes-with-a-programmable-puller

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu cam mikropipetler şeklini değiştirerek bir kılavuzdur. Özellikle, ısı ve hava basıncı ile konik pipet direnci azaltmak için, ucu açıklığı artırmadan genişletilinceye. Bu küçük hücrelerin düşük gürültü kayıtları elde etmek için kritik öneme sahiptir, ancak birçok uygulamada yararlıdır.

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Düzlemsel çift katlı lipit katmanını da adlandırılan yapay çift katlı lipit katmanını, çalışma izin iyon iletken, iyi tanımlanmış bir ortamda kanal. Burada, bilayeri odası hazırlamak için gerekli bireysel adımlar, elektrotlar ve nasıl bilayeri tek kanal ölçümleri için uygun olup olmadığını test etmek için ortaya koymaktadır.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Ekstrasellüler sırasında nöral agonistleri ve antagonistleri...

Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma<em&gt; In vivo</emSinir Cevaplarının&gt; Farmakolojik Çarpıtmalar

Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb'leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb'leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

Uyanık farelerde hücre dışı nöral aktiviteyi aynı anda kaydetmek ve kayıt bölgelerinin yakınında birden fazla nöroaktif madde salmak için elektrotların yapımı için yöntemler sunuyoruz. Bu teknik, ilgilenilen nörona varsayılan yerel sinaptik girdilerin ayrıntılı analizine izin verir.

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Bu protokol, manuel bir endolizozomal yama-kelepçe sistemi kullanarak hücre içi veziküller üzerindeki iyon kanalı aktivitesini doğrudan ölçmek için bir yöntemi detaylandırır. Endolizozomların büyütülmesini ve bu veziküllerin manuel olarak izole edilmesini içeren yöntemi gösteriyoruz. Bu yaklaşım, araştırmacıların prosedürü doğru bir şekilde tekrarlayabilmelerini ve uygulayabilmelerini sağlar.

Tek Endolisozomal Vezikül Analizi için Yama-Klemp Teknikleri

Öğrenin, programlanabilir çektirme cihazı kullanarak elektrofizyoloji için patch-pipet ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını. Bu yöntem, nörobilim araştırmalarında yüksek kaliteli cam mikroelektrot üretimini sağlar.

Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar

Daha fazla video keşfet