Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar

Cam kılcal pipetler, tek hücreli elektroporasyon, DNA mikroenjeksiyonu ve yama kelepçesi elektrofizyolojisi gibi çok çeşitli teknikler için laboratuvarlarda her yerde bulunur hale gelmiştir. Kayıtlar için cam kılcal yama kelepçesi elektrotları hazırlamak veya silikat cam programlanabilir bir polar üzerine çekilir. Elektrot uçları balmumu ile kaplanır ve daha sonra uçlar ateşle parlatılır ve ileride kullanılmak üzere saklanır. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Fizyoloji Bölümü'nden Miriam Goodman.

Bu videoda, elektrofizyoloji için yama kelepçeli pipetlerin ve keskin elektrotların nasıl yapıldığını göstereceğim. Pipet olarak da adlandırılan cam mikro elektrotlar, onlarca yıldır elektrofizyolojinin bir beygir gücü olmuştur. Günümüzde bu pipetler, programlanabilir bir çekme kullanılarak cam kılcal damarlardan yapılmaktadır.

Öyleyse başlayalım. Yama kelepçeli pipetler yapmak için, temiz ve tozsuz kılcal damarlarda Sutter yaban domuzu ipeği kullanıyoruz ve Sutter P nine seven alevli toprak mikro elektrot çektirmesini kullanıyoruz. Sutter'ın Pipet Yemek Kitabı, uygun çekme programları geliştirmek için mükemmel bir referanstır.

Başlamak için, çektirme üzerindeki toz kapağını kaldırın. Ardından kutudan bir cam kılcal tüp alın. Toz birikimini en aza indirmek için kapağı değiştirdiğinizden emin olun.

Ardından, bir elinizle kılcal damarı filamentin bir tarafındaki oluğa kaydırın, kelepçeyi hafifçe sıkın. Bu noktada, kelepçe, borunun düşmesini önleyecek kadar sıkı, ancak oluğa kaydırabileceğiniz kadar gevşek olmalıdır. Şimdi, aynı taraftaki yaylı metal durdurucuyu serbest bırakın.

Ardından başparmağınız ve işaret parmağınızla her iki taşıyıcının altına takılı olan metal tırnakları kavrayın. Diğer yaylı metal durdurucuyu serbest bırakın. Taşıyıcıları gidebildikleri kadar birlikte çekin ve bir elinizle yerinde tutun.

Ardından, tüpü filament muhafazasından diğer taraftaki taşıyıcının oluğuna kaydırın. Camı ısıtma filamentinin içine itmekten kaçının. Her iki taraftaki kelepçeleri sıkın.

Taşıyıcıları yerinde tutacak kadar sıkı olmalı, ancak camın ezilmesine neden olacak kadar sıkı olmamalıdır. Şimdi toz kapağını kapatın ve yeşil düğmeye basın. Yama kelepçesi kayıtları için işaretli kutuplu pipetler, her adımda azalan ısı ve hız ile beş aşamalı bir yoklama programı ve son adımda küçük bir kutup kullanılarak oluşturulur.

Bu program ısı ve yerçekimi kullanır. Keskin elektrotlar yapma prosedürü çok benzerdir, ancak bu durumda, Warner Instruments'ın dış çapı bir milimetre ve iç çapı 0.78 milimetre olan ince cam kılcal damarı kullanıyoruz. Çekme programları bittiğinde ısı ve yer çekimine ek olarak motor kullanan bir çekme programı da uyguluyoruz.

Toz kapağını kaldırın, her iki kelepçeyi de gevşetin ve bitmiş pipeti çıkarın. Ardından pipetleri çalışan bir kutuya koyun. Kutu, plastik bir pipet ucu kutusunun rafına bir köpük şeridi yapıştırılarak ve ardından köpükte altı ila sekiz yarık kesilerek yapılabilir.

Pipetleri yarıklara yerleştirin. Kutu çekilmiş pipetlerle dolduğunda, pipetleri ateşle parlatmak için ateşte parlatma adımına geçin. Yangın parlatmaya başlamadan önce ayak pedalıyla kontrol edilen platin ısıtma filamentine sahip bir mikro dövme teçhizatı kurun.

İlk olarak, kapasitansı azaltmak ve gürültü özelliklerini iyileştirmek için pipeti diş mumu ile kaplayın. Bunu yapmak için, yakınınızda küçük bir erimiş balmumu kaynağı bulundurun. Ağdanın uca girmesini önlemek için pipetin arkasına hava basıncı uygulayın.

Ardından ucu kısa bir süre sıvı balmumuna batırın. Ve şimdi kaldır. Pipeti polisaj aparatına yerleştirin ve ucu filamentten yaklaşık 50 mikron uzağa getirin.

Filamentin ısıtıldığında genişleyeceğini unutmayın. Balmumu pipetin ucundan çıkarmak için bir veya iki saniyelik kısa bir ısı darbesi uygulayın ve camı pürüzsüz hale getirin. Açılma çapını ve düzgünlüğünü belirlemek için pipet uçlarını mikroskop altında inceleyin.

Standart yama kelepçesi kayıtları için, uç açıklıkları bir ila üç mikron çapında, atılmış, pürüzlü, düzensiz veya düzensiz uçlar olmalıdır. Bitmiş pipeti çalışan bir kutuya yerleştirin ve pipetleri 10 başarılı pipet için tekrarlanan tozdan korumak için kapağı kapattığınızdan emin olun. Az önce size programlanabilir bir çektirme kullanarak yama kelepçeli pipetlerin ve keskin elektroların nasıl yapıldığını gösterdim.

Aynı prosedür, optimum yama kelepçesi sonuçları için enjeksiyon iğneleri de dahil olmak üzere çeşitli cam aletler yapmak için kullanılabilir. Deneyin aynı gününde yeni tozsuz pipetleri çekmeyi ve deneyden sonraki bir saat içinde cilalamayı unutmamak önemlidir. Ayrıca pipetlerin pürüzsüz ve cilalı olduğunu kontrol ederek doğrulayın.

Opus oositlerde ifade edilen iyon kanallarının yama kelepçesi kaydının nasıl yapılacağını gösteren diğer videomuzu mutlaka izleyin. Tamam, bu kadar. Artık bir pipet uzmanısınız ve deneylerinizde iyi şanslar.