Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler
22 Ekim 2008
Bu cam mikropipetler şeklini değiştirerek bir kılavuzdur. Özellikle, ısı ve hava basıncı ile konik pipet direnci azaltmak için, ucu açıklığı artırmadan genişletilinceye. Bu küçük hücrelerin düşük gürültü kayıtları elde etmek için kritik öneme sahiptir, ancak birçok uygulamada yararlıdır.
Bu prosedür, pipet ucunun 100 kat büyütmede parlatma filamentinin yanına yerleştirilmesiyle başlar. Ardından, hava basıncını ve ısıyı açın. Filament.
Pipet ucu, künt şekilli bir uç oluşturacak şekilde genişleyecektir. Daha küçük bir uç açıklığı elde etmek için ısıyı kapatın. Basıncı kapatın ve tekrar ısıtın.
Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Fizyoloji Bölümü'nden Dr.Miriam Goodman'ın laboratuvarından Brandon Johnson. Bugün size basınçlı parlatma yama pipetleri için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda iyon kanallarını ve membran yamalarını ve NC elgan nöronlarını incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Altı ila 10 yama pipetinden oluşan bir set çekin. Yardım için yerel bir uzmana veya programlanabilir polarlı yama pipetleri ve keskin elektrotlar yapma görselleştirilmiş deneyimize danışın.
Prosedüre başlamak için, sıkıştırılmış bir hava basıncı basıncını yaklaşık 40 PS'ye ayarlayın. Daha sonra basınçlı hava yolunu dört bir kontrol valfine bağlarım. Dört vanaya uzun bir plastik boru bağlayın ve plastik borunun gevşek ucuna yüksek basınçlı bir pipet tutucu takın. Parlatma işlemini gerçekleştirmek için bir mikro dövme makinesi kullanın.
Bir LA Scientific'ten Ccpm iki kitini kullanıyoruz. Bu teçhizat, yüksek basınçlı bir pipet tutucuya, bir ayak pedalı ile kontrol edilen bir platin ısıtma filamentine ve 100 kat uzunluğunda 10 kat düşük ve yüksek büyütme ile donatılmış bir mikroskobuna sahiptir. Çalışma mesafesi hava hedefleri idealdir çünkü protokol sırasında pipet açılmasını gözlemleyebilmek çok önemlidir.
Ardından, basınç valfinin kapalı konumda olduğunu doğrulayın. Ardından pipet tutucusuna bir pipet yerleştirin ve laboratuvarın güvenliği için bağlantı parçasını parmaklarınızla sıkılaştırın. Pipetin pipet tutucusunda sıkıca tutulduğundan emin olun.
Aksi takdirde, hava basıncı pipetin tutucudan çıkmasına neden olur. İsteğe bağlı bir adım olarak, kapasitansı azaltmak ve gürültü özelliklerini iyileştirmek için pipeti balmumu gibi hidrofobik bir yalıtkanla kaplayabilirsiniz. Şimdi pipeti mikro dövmedeki tutucuya yerleştirin, pipet tutucuyu mikroskop tablasına yerleştirin, böylece hem uç hem de parlatma filamenti mikro dövme üzerinde düşük 10 kat güçte görünür hale gelir.
Ucu filamentten yaklaşık 50 mikron uzağa getirin, ardından yüksek güçlü 100 Objektife geçin, hem pipet ucu hem de parlatma filamenti odakta ve görüş alanında olmalıdır. Değilse, filamentin yüksekliğini ayarlayın. Pipet konumu ayarlanamadığından, pipet ucu ve filament görüş alanının zıt taraflarında olmalıdır.
Pipet ucunu filamente çok yakın yerleştirmekten kaçının çünkü ısındıkça genişleyecek ve pipetinize çarpabilir. Uç ve filament düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, basınçlı havayı pipete yönlendirmek için valfi çevirin ve pipet ucunu, ucun arkasındaki konik dışa doğru balonlaşmaya başlayana kadar ısıtın. Uç çok fazla balonlaşmadan önce ısıtmayı durdurun.
İstenilen şekil için uygun mesafeyi, ısıyı ve zamanı belirlemek için deney yapılması gerekir. İsteğe bağlı bir adım olarak, uç açma çapını azaltmak için ucu basınç olmadığında da parlatabilirsiniz. Ayrıca, bu parlatma adımlarının ince işlem yapmak için tekrarlanabileceğini unutmayın.
Pipet ucunun hem şeklini hem de boyutlarını ayarlayın. Parlatma tamamlandığında. Basıncı kapatın, pipet ucunu güvenli bir yöne doğrultun.
Pipeti çıkarın ve tozdan korunacağı temiz bir saklama kutusuna koyun. Laboratuvarın güvenliği için, pipeti çıkarmadan önce basıncı kapattığınızdan emin olun. Aksi takdirde, pipet tutucusundan çıkarılabilir.
Çıkardıktan sonra, daha iyi yama kelepçesi kayıtları için cila pipetlerine nasıl basınç uygulayacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, buharlaşmış metalin pipetler üzerinde birikmesini en aza indirmek için parlatma bobinini yüksek erime sıcaklığına sahip camla kaplamayı unutmamak önemlidir. Pipetler basınçlı havaya maruz kaldığında dikkatli olun.
Pipeti tutucudan çıkarmadan önce pipetin tutucuda sıkıca tutulduğundan ve havayı kapattığınızdan emin olun. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler.
Mutlu basınçlı parlatma ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu kılavuz, cam mikropipet şekillerinin ısı ve hava basıncı kullanılarak modifikasyonunu detaylandırmaktadır. Bu işlem, uç açıklığını artırmadan konik kısmın genişletilmesine olanak tanır; bu durum, küçük hücre uygulamalarında düşük gürültülü kayıtlar elde etmek için gereklidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektrofizyoloji
- Mikropipet üretimi
Arka Plan
- Cam mikropipetler, elektrofizyolojik kayıtlarda kritik araçlardır.
- Yüksek kaliteli kayıtlar için düşük pipet direnci gereklidir.
- Şeklin değiştirilmesi, çeşitli uygulamalarda performansı artırabilir.
- Bu teknik, özellikle küçük hücre kayıtları için faydalıdır.
Çalışmanın Amacı
- Cam mikropipetleri şekillendirmek için bir yöntem sağlamak.
- Uç açıklığını genişletmeden pipet direncini azaltmak.
- Küçük hücrelerden alınan kayıtların kalitesini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek büyütmede pipet ucunun bir parlatma filamentinin yakınına konumlandırılması.
- Pipet ucunu genişletmek için hava basıncı ve ısı uygulanması.
- Daha küçük bir uç açıklığı elde etmek için ısının kapatılması.
- Basınç ve ısının kapatılmasıyla yapılan son ayarlamalar.
Ana Sonuçlar
- Pipet ucu etkili bir şekilde küt bir forma dönüştürülebilir.
- Uç boyutu artırılmadan daha düşük direnç elde edilir.
- Bu yöntem, küçük hücrelerden alınan kayıt kalitesini artırır.
- Mikropipet modifikasyonu için pratik bir yaklaşım sunar.
Sonuçlar
- Cam mikropipetlerin şekillendirilmesi, nörobilim araştırmalarında değerli bir tekniktir.
- Geliştirilmiş pipet tasarımı, daha iyi veri kalitesi sağlar.
- Bu yöntem, çeşitli elektrofizyolojik çalışmalarda uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Pipetlerin basınçla parlatılması, uç çapını değiştirmeden patch-clamp kayıtlarındaki elektriksel direnci düşürür ve böylece küçük nöronal popülasyonlardan daha yüksek sadakatli iyon kanalı ölçümlerinin yapılmasına olanak tanır. Bu teknik geliştirme, elektrofizyolojik analizlerde sinyal-gürültü oranlarını iyileştirerek nörobilim ilaç keşfinde hedef validasyonunu destekler. Artırılmış kayıt kalitesi, nöronal uyarılabilirlik ve sinaptik fonksiyonun erken aşama mekanistik çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değeri: Nöropatik ağrı ve epilepsi hedefleri açısından kritik olan küçük çaplı nöronlarda iyon kanalı fonksiyonlarının incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değeri: Pipet kaynaklı gürültüyü minimize ederek tek kanal kayıtlarındaki değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir elektrofizyolojik tarama panelleri için standartlaştırılmış pipet geometrileri üretir.
- Operasyonel Değer: Hem yumuşak hem de sert cam mikropipetlerle uyumlu olup, hedef sınıflar genelinde esnek analiz tasarımı sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Antibiyotik perforanlar için membran kabarcıklanma (bleb) oluşumunu artıran küt uçlar oluşturarak, delinmiş-yama kenetleme (perforated-patch clamp) uygulamalarını destekler.
- Operasyonel Değer: Primer nöronal kültürlerde kayıt süresini uzatarak, öncü bileşik optimizasyon çalışmaları için verimliliği artırır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, elektrofizyolojik fenotiplemenin hedef seçimini ve öncü bileşik profilini belirlediği erken keşif iş akışlarına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Hastalıkla ilişkili nöronal modellerde iyon kanalı hedeflerinin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Tarama: Patch-clamp platformlarında yüksek doğruluklu bileşik taraması için düşük dirençli pipetler sağlar.
- Analitik: Geliştirilmiş sinyal stabilitesi ile kantitatif akım ve iletkenlik ölçümleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Farmakokinetik-farmakodinamik modelleme için akut dilimlerde ve kültürlenmiş nöronlarda boylamsal kayıtları kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yalnızca bir mikroforge yükseltmesi gerektirir, bu da onu mevcut elektrofizyoloji altyapısı için ölçeklenebilir ve düşük maliyetli bir geliştirme haline getirir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Daha temiz elektrofizyolojik fenotipler aracılığıyla hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Pipet geometrisini standartlaştırarak farklı merkezler ve operatörler arasındaki analiz tekrarlanabilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Teknik gürültüyü minimize ederek iyon kanalı taramalarındaki yanlış negatifleri azaltır.
- Portföy Etkisi: Nöronal eksitabiliteyi hedefleyen preklinik programlardaki devam/durdurma kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Mikropipet kullanımı ve elektrofizyoloji konusunda uzmanlık gerektirir.
- Yüksek basınçlı valf, ısıtma filamanı ve büyütme optiklerine sahip bir mikroforge gereklidir.
- Kullanıcılar arasında basınç, ısı ve zamanlama parametrelerinin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Parlatma tepkisindeki cam tipi farklılıklarının (soda-kireç ile borosilikat) dikkate alınması gerekir.
- Manuel uç konumlandırma gereksinimi ve aşırı genişlemeyi önlemek için gereken operatör becerisi ile sınırlıdır.
