Overview
资料来源：弗朗西斯·萨亚斯塔德1，2，惠特尼·斯旺森2，3和托马斯·格里菲斯1，2，3，4
1明尼苏达大学明尼阿波利斯分校微生物学、免疫学和癌症生物学研究生课程，MN 55455
2明尼苏达大学明尼阿波利斯分校免疫学中心，MN 55455
3明尼苏达大学泌尿科，明尼阿波利斯，MN 55455
4共济会癌症中心，明尼苏达大学明尼阿波利斯分校，MN 55455
多边克隆抗体被定义为针对抗原或多种抗原的不同抗原决定子（1）的抗体的集合。虽然多克隆抗体是识别生物分子的有力工具，但有一个重要的局限性 - 它们无法区分具有抗原决定因素的抗原。例如，当牛血清白蛋白用于给动物接种疫苗时，具有不同表面Ig的B细胞对牛血清白蛋白上不同的抗原决定因素有反应。结果是抗血清中的抗体混合物。由于牛血清白蛋白与人类血清白蛋白在进化保存区域与人血清白蛋白共享一些表皮，这种抗牛血清白蛋白抗血清也会与人血清白蛋白发生反应。因此，这种抗血清对区分牛和人血清白蛋白没有用处。
为了克服多克隆抗血清的特异性问题，我们采取了几种方法。一种是通过通过固定抗原（2）的色谱柱吸收不需要的抗体。这种方法是乏味的，往往不能完全去除不需要的抗体。另一种方法是分离单个产生抗体的B细胞，并在培养中扩大它们。然而，像大多数正常未转化的细胞一样，B细胞在长期培养中无法存活。
为了克服B细胞在培养中生存的能力，一种方法是制备骨髓瘤-B细胞杂交瘤。1847年，亨利·本斯-琼斯发现多发性骨髓瘤（一种淋巴瘤）患者产生了大量抗体（3）。这些患者的B细胞已经变得恶性，并不受控制地生长。由于恶性B细胞来自单个克隆，它们相同，只产生一种类型的抗体（即单克隆抗体或mAb）。然而，这些骨髓瘤细胞大多产生未知特异性的抗体。1975年，塞萨尔·米尔斯坦和乔治·科勒通过将骨髓瘤细胞融合到B细胞中，成功地培育出一种可以在体外无限期培养的杂交瘤，并产生无限数量的已知抗原特异性的单克隆抗体（4）。其方法背后的原理是结合骨髓瘤细胞的不朽特性和产生B细胞的抗体特性。其技术彻底改变了抗体生产，为使用单克隆抗体识别和纯化生物分子提供了强有力的手段。
一般来说，制备单克隆抗体需要几个月。一般过程包括以下步骤：
- 抗体皮毒的免疫和筛选
- 产生抗体的B细胞和骨髓瘤细胞的融合
- 杂交瘤的选择性生长
- 筛选杂交瘤以产生所需的单克隆抗体
- 通过限制稀释进行克隆 - 将细胞稀释到浓度以统计上允许向 96 孔板的孔中添加少于 1 个细胞的过程。有些井最终将有0个细胞，有些将有1个细胞。种子有1个细胞的井最终将长成单克隆细胞群。
- 杂交瘤的生长与单克隆抗体的制备
该协议侧重于最后一步 - 杂交瘤的生长和单克隆抗体的制备。抗体通过硫酸铵沉淀（通常称为盐化）从培养上清液中纯化 - 一种常用的方法，从溶液中去除蛋白质。溶液中的蛋白质与其他亲水性相互作用一起通过暴露的极性组和离子组与水形成氢键。当加入小、高电荷离子（如铵或硫酸盐）的浓度时，这些组与蛋白质竞争与水结合。这从蛋白质中去除水分子，降低其溶解度，导致蛋白质沉淀。
Procedure
注意：在以无菌方式处理混合瘤细胞和介质时（例如，在生物安全柜中），在抗体净化步骤之前，应保持无菌细胞培养技术。
1. 解冻冷冻杂交细胞
- 在37°C水浴中孵育含有冷冻杂交瘤细胞的瓶，直到刚解冻（约2分钟）。
- 将解冻细胞加入含有10 mL完整RPMI（RPMI补充10%胎儿牛血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、1mM丙酸钠、1x非必需氨基酸、50μM 2-Mercaptoto酸、10mM HEPES）的15mL锥形管中。
- 在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以洗掉任何污染冷冻介质。
- 离心后，丢弃液体上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在5 mL新鲜完整的RPMI中。然后，将细胞添加到含有15 mL完整RPMI（RPMI最终体积为20 mL）的T75组织培养瓶中。
- 在37°C的标准培养箱中生长细胞，CO2为5%。在培养中，细胞是非粘附的。
2. 杂交瘤扩张
- 让细胞膨胀约3天，直到烧瓶是+80%的汇入。
注意：此时间量可能因细胞的起始数量以及不同细胞的生长速率的固有差异而异。细胞处于指数生长阶段非常重要。 - 一旦初始烧瓶达到+80%的汇合，从初始T75烧瓶中取出细胞，放入圆锥形离心管中，旋转（1200 RPM，5分钟）以颗粒细胞。
- 将细胞悬浮在6 mL的完整RPMI中，然后将细胞悬浮液分配到三个新的T75瓶（2 mL/烧瓶，含有18 mL RPMI）。在 37°C 下用 5% CO2孵育这三个 T75 烧瓶，直到它们发生 ±80% 的汇合（这大约需要 3 天）。
3. 无血清介质中的抗体生产
注意：此时，细胞准备在专为杂交瘤细胞系生长而设计的无血清培养基中继续生长。在此协议中，我们使用含有 HB101 补充剂产品的即用型、商用 HB 基础液体介质。
- 三个 T75 烧瓶中的每个细胞（在 ±80% 汇合时）被收集并离心（1200 RPM，5 分钟）。
- 每个T75瓶中的细胞颗粒被重新悬浮在10 mL补充的HB101无血清培养基中，然后加入两个T225烧瓶补充HB101无血清介质（即5 mL细胞悬浮液，每个瓶中每个瓶中含有+220-240 mL HB101）。
- 在 37°C 的 T225 烧瓶和 HB101 介质中继续生长，在 5% CO2下生长三周，或直到细胞开始死亡。细胞在这3周内产生mAb，并将其分泌到培养基中。一旦细胞开始死亡，它们就不再产生任何mAb。
4. 抗体纯化 - 第1天
注意：此时，不需要保持无菌，因此无需以无菌方式处理介质（例如，在生物安全柜中）。此外，杂交瘤不被视为"BSL2级"代理。
- 将烧瓶中的介质倒入管中，用于固定角度转子。在10，000RPM的固定角度转子的离心机中旋转管子8分钟。此步骤旨在从培养液上清液中清除细胞碎片。
注意：管尺寸可能因使用的转子而异。要记住的重要的事情是，在管中具有相同的体积，以确保转子在离心前得到适当的平衡。介质的整个体积可能一次无法放入离心机中。其余介质稍后将使用相同的管离心（步骤 4.5）。 - 在被冰包围的桶中，用搅拌棒准备一个 2L 塑料烧杯。放在搅拌盘上。
- 在 1L 瓶上安装 500 mL 的过滤器顶部。通过适当的管道将瓶顶过滤单元连接到室内真空。
- 将步骤 4.1 中的上清液（仍包含杂交细胞产生的 mAb）倒入过滤器顶部。
- 继续使用同一组管从介质中颗粒细胞碎片（颗粒将继续生成）。等待运行真空，直到过滤器顶部已满，另一批上清液准备倒入。不要让过滤器变干或过滤会变得很慢。
- 当 1L 瓶接近满时，取出滤芯顶部并将上清液倒入步骤 4.2 中准备的 2L 烧杯中。重新连接过滤器顶部。跟踪卷。
- 重复离心和过滤步骤，直到处理所有介质。
- 每收集1L过滤上清液，可测量出295克硫酸铵。搅拌时，在接下来的几个小时内（每15分钟约25克）缓慢地将硫酸铵加入上清液中，以防止硫酸铵盐的局部高浓度，可能导致不需要的蛋白质沉淀。
- 加入所有硫酸铵后，用铝箔盖住烧杯，用搅拌板移动到 4°C（例如，步入式冰箱或冷藏室）。搅拌过夜。溶液的不断搅拌需要使盐溶解，但长时间的搅拌会导致溶液中蛋白质在表面/空气界面上的变性。
- 使用固定角度转子清洗管。
5. 抗体纯化 - 第2天
- 将含有上清液的硫酸铵从 2L 烧杯倒入管中，用于固定角度转子。在离心机中旋转，在6500RPM下固定角度转子，无需制动，旋转20分钟。
- 真空吸出上清液，注意不要吸起颗粒，因为它将是软的。继续使用同一组管子从含有上清液的硫酸铵中收集颗粒。
- 在最后一次吸入后，将每个颗粒（含有抗体）重新悬浮在+1 ml PBS中。
- 通过对大量PBS的透析，从沉淀的mAb溶液中去除硫酸铵。为此，首先为 mAb 溶液的每个 mL 切割大约 1 英寸的透析管（例如，Membra-Cel MD25-14 MWCO 12，000-14，000 道尔顿切断纤维素透析管）。用 dH2O 将管子与管子的一端打结，然后用 dH2O 填充，以检查该结是否泄漏。从管中清空 dH2O。
- 移液器 PBS/抗体溶液进入管材。用额外的 0.25 ml PBS 冲洗管，然后转移到管中。
- 使用橙色透析夹将管的顶部固定在尽可能靠近溶液的地方。
- 将油管顶部贴在 4L 烧杯的外顶部。让油管的填充部分悬挂到烧杯中。用 PBS 填充烧杯，并添加搅拌棒。
- 在4°C下搅拌8小时。
- 用新鲜的 PBS 更换烧杯中的 PBS，再搅拌 8 小时。
- 将抗体从管转移到15或50毫升锥形管。在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以清除可能形成的任何沉淀物。将上清液转移到新鲜的管子上。
- 用PBS（5μl抗体+ 95μlPBS）稀释抗体的等分1：20。用分光光度计（带PBS的空头）在280nm处定量抗体浓度。使用消光系数 （+） 1.43。浓度计算为
- 将抗体与螺钉盖小瓶进行比对，并储存在 -80°C。
抗体是研究和诊断的有力工具，这意味着大量生产它们通常是必要的。
产生抗体的第一步是将感兴趣的抗原注射到宿主动物体内。抗原激活宿主的B细胞，然后产生和释放该抗原特有的抗体。然后，使用ELISA或其他检测方法，对宿主动物的抗血清进行定期筛查，以检测目标抗体的存在。一旦检测到它，宿主动物的脾脏，包含B细胞，被删除。如果脾脏中的所有B细胞现在都被分离，这应该包括一个正在分泌感兴趣的抗原抗体的种群。我们称这个群体为多克隆，因为每个细胞可能绑定到抗原的不同表位，因此，产生自己的个体和独特的抗体。
要产生单克隆抗体，必须首先分离和培养用于识别特定表位的抗体，必须首先分离和培养产生所需抗体的单个B细胞。不幸的是，B细胞在培养中不能很好地存活。因此，为了克服这一障碍，科学家将B细胞与不朽的骨髓瘤细胞融合在一起，导致杂交瘤。这些细胞随后在选择性培养基中生长，仅允许杂交瘤生长和释放抗体。同样，使用ELISA等方法对该介质进行筛选，以寻找所需的抗体。一旦检测到杂交瘤，通过称为限制稀释的过程克隆，即父培养物的连续稀释，这将导致单细胞被播种到筛选板的孔中。这允许从单个母细胞生长杂交瘤，产生仅释放所需抗体的单克隆细胞系。这些单克隆线可以在组织培养瓶中扩展，以产生大量的单克隆抗体。在此之后，当细胞开始死亡时，抗体可以从介质中沉淀成硫酸铵。通常，在溶液中，抗体通过亲水相互作用与水相互作用。然而，铵和硫酸盐是高电荷离子，将水分子与抗体分离，降低抗体的溶解度，导致其沉淀。
首先，首先检查材料列表，并准备协议的所有介质、耗材和工作面。
然后，打开水浴，将其设置为 37 摄氏度。接下来，将 10 毫升完整的 RPMI 添加到 15 毫升锥形管中，将 15 毫升的完整 RPMI 添加到 T75 细胞培养瓶中，并将其放在一边。使用谨慎和穿着适当的个人防护设备，从液氮储存中取出含有杂交细胞的冷冻小瓶。要释放小瓶内的压力，应稍微松开瓶盖。现在，在水浴中小心孵育小瓶，确保瓶盖保持在水面上方，以尽量减少污染的可能性。当细胞几乎解冻时（通常需要大约两分钟）时，将小瓶移到组织培养罩上。
然后，在取下瓶盖之前，用70%乙醇擦拭小瓶外侧。使用无菌移液器，将细胞转移到含有10毫升完整RPMI培养基的锥形管中。然后，在 1200 RPM 下将管离心 5 分钟。离心后，将管子移回组织罩并用乙醇擦拭管外侧。在不干扰颗粒的情况下，丢弃上清液，然后加入五毫升新鲜完整的 RPMI 介质，然后轻轻上下移液以重新悬浮。接下来，将细胞转移到T75细胞培养瓶中，将烧瓶置于37摄氏度的5%二氧化碳培养箱内。允许细胞达到约80%的汇合，这通常需要大约三天。请注意，杂交瘤细胞是非粘附的，并且会生长在培养基中。达到足够的汇合时间可能因活细胞的起始数量和所使用的杂交瘤细胞类型而异。
一旦细胞充分结合，使用无菌的25毫升移液器将其从培养瓶转移到圆锥形离心管中。在1200RPM下通过离心将细胞进行5分钟的离心。当细胞在离心机中时，在三个新的T75细胞培养瓶中加入18毫升的完整RPMI，并将其放在一边。离心后，去除上清液，并轻轻地将细胞颗粒悬浮在六毫升完整的RPMI中。接下来，在三个新的细胞培养瓶中加入两毫升的细胞悬浮液。最后，将烧瓶放入设定为5%二氧化碳和37摄氏度的孵化器中，孵育至烧瓶约80%的汇入，约3天。
此时，细胞已准备好在专为杂交瘤细胞系设计的无血清培养基中继续生长，例如含有HB101补充剂的商用HB基底液体培养基。将细胞从每个细胞培养瓶转移到圆锥形离心管中，然后以1200RPM离心对细胞进行5分钟的离心。现在，在6个225厘米平方的细胞培养瓶中加入230毫升补充的HB101无血清培养基，并把它们放在一边。当离心完成时，去除上清液，并在10毫升补充的HB101培养基中重新悬浮每粒。然后，进入每个细胞培养瓶，加入五毫升的细胞悬浮液。将烧瓶置于37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中，然后继续生长约三周。在此期间，细胞将产生并释放感兴趣的单克隆抗体到培养基，当细胞开始死亡时，抗体将准备好进行纯化。
要从含抗体培养基介质中清除细胞碎片，将培养瓶中的内容物倒入管中，用于固定角度转子。将管子放在转子中，并确保在离心前正确平衡。以 10，000 RPM 旋转管 8 分钟。当样品离心时，将一个装有搅拌棒的两升塑料烧杯放入冰桶中，然后将冰桶放在搅拌板上。
接下来，将 500 毫升的过滤器顶部连接到一升瓶。使用适当的管道将此瓶顶过滤单元连接到室内真空中。然后，将含有抗体的上清液倒入过滤器顶部。离心剩余的介质，以分离细胞碎片从含抗体的上清液。当过滤器顶部充满上清液时，启动真空。然后，当一升收集瓶接近满时，取下过滤器顶部，将过滤过的上清液倒入冰上两升烧杯中。重复过滤步骤，直到处理所有上清液。
处理完所有样品后，每升过滤上清液重量为295克硫酸铵。启动搅拌板，并在接下来的几个小时内缓慢地将硫酸铵添加到上清液中。这可以防止硫酸铵盐的局部高浓度，可能导致不需要的蛋白质沉淀。加入所有硫酸铵后，用箔覆盖烧杯，连同搅拌板一起将其移至四摄氏度的冷藏室，并设置在一夜之间搅拌抗体溶液。
第二天早上，将含硫酸铵的抗体溶液从两升烧杯倒入固定角度转子的清洁管中。在 6500 RPM 下将管离心 20 分钟，不中断以颗粒管底部的抗体。接下来，真空吸出上清液，小心不要吸吮软颗粒。继续使用同一组管子从含硫酸铵的上清液中收集颗粒抗体。在最后一次吸入后，将每个抗体颗粒重新悬浮在大约一毫升的PBS中。
要从抗体溶液中去除硫酸铵，首先每毫升抗体溶液切割大约一英寸的透析管。接下来，用蒸馏水擦拭管子，在油管的一端打一个结。在油管中加注蒸馏水，以检查结有无泄漏。如果几分钟后没有泄漏，则将水从管中倒空。
接下来，将抗体溶液移入管中。为了恢复尽可能多的抗体，用额外的0.25毫升的PBS冲洗管子，并将它转移到管中。使用透析夹将管的顶部固定在尽可能靠近溶液的地方。然后，将油管顶部带入四升烧杯的外部，将油管的填充部分悬挂在烧杯中。现在，把烧杯带到四摄氏度的寒冷房间，放在搅拌盘上。用 PBS 填充烧杯顶部，并添加搅拌棒。让管子和溶液搅拌约8小时。第二天早上，用新鲜的 PBS 替换烧杯中的 PBS，然后离开烧杯再次搅拌约 8 小时。那天晚上晚些时候，最后重复一次这个过程。早上，打开透析管，然后将抗体溶液从管转移到15毫升锥形管。要去除透析过程中可能形成的任何沉淀物，请以 1200 RPM 将管离心 5 分钟。最后，将上清液转移到新鲜管中。
为了量化抗体浓度，首先通过在95微升的PBS中加入5微升的抗体等分，进行20倍的稀释。然后，将稀释的抗体移入比色皿中，并使用分光光度计将浓度记录在280纳米。接下来，使用所示公式计算抗体浓度。最后，用抗体名称、浓度、制备日期以及（如适用）批号和实验者名称，将抗体与标记的螺帽小瓶等标记。这些可以储存在零下80摄氏度，直到需要。
使用 120G8 抗小鼠 CD317 或 PDCA-1 杂交瘤系列的示例产量范围在 44 到 99.6 毫克之间，通常平均产量为 67.3 毫克。需要注意的是，每个生产运行使用相同的杂交瘤细胞系可以略有不同的单克隆抗体在末端可用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
使用该协议，我们获得了以下结果与几个不同的杂交瘤：
杂交瘤： RB6-BC5 （大鼠抗小鼠 Ly6C/Ly6G （Gr1） IgG2b， +mAb）
OD280 - 1.103
(1.103/1.43)（20） = 15.42毫克/升
杂交瘤： GK1.5 （大鼠抗小鼠 CD4 IgG2b， β mAb）
OD280 - 0.485
(0.485/1.43)（20） = 6.78毫克/升
杂交瘤： 2.43 （大鼠抗小鼠 CD8 IgG2b， β mAb）
OD280 - 0.209
(0.209/1.43)（20） = 2.92 毫克/升
这些都是示例结果，请务必注意，每个具有相同杂交瘤的生产运行在末尾可用的 mAb 数量上可能略有不同。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
上述程序是一种简单、直截了当的方法，用于从杂交瘤培养上清液中纯化单克隆抗体。重要的是要记住，虽然，硫酸铵将沉淀其他蛋白质，可能是在培养上清。因此，从吸光度测量中确定的抗体浓度是估计值。用户可能希望通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行少量，来评估透析样品的纯度。杂交瘤产生的mAb，一旦使用这种方法进行纯化，就可以以多种方式使用。上述RB6-BC5、GK1.5和2.43 mAb通常用于小鼠中微粒细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞的体内耗竭。使用该协议生产和纯化的其他 mAb 可用于流式细胞测定（当与荧光荧光结合或与二次 Ab 结合时）、ELISA 或西方印迹。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
- Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
- Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
- Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).
