세포주기 분석: 세포주기 CFSE 염색 및 유세포 분석을 사용한 자극 후 CD4 및 CD8 T 세포 증식 평가
출처: 퍼셰 티보1,2,3,뮤니에 실뱅1,2,3,소피 노볼트4,레이첼 골럽1,2,3
1 림프포에이시스 단위, 면역학학과, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스
2 INSERM U1223, 파리, 프랑스
3 유니버시테 파리 디드로, 소르본 파리 시테, 셀룰레 파스퇴르, 파리, 프랑…
1. 준비
- 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
- 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 닦은 다음 철저히 닦아냅니다.
- 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.
2. 해부
- 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
- 집게를 사용하여 복부 오른쪽에 내장과 위를 움직여 위와 비장을 노출시십시오. 비장은 위장에 부착됩니다.
- 집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.
3. 면역 세포 격리
- 같은 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
- 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
- 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
- 적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2 mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 15 mL의 볼륨을 구성하십시오.
- 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 슈퍼네티드를 버리고 5mL의 HBSS 2% FCS로 펠릿을 다시 놓습니다.
- 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 107 세포/mL로 조정합니다.
4. CFSE 염색 및 T 세포 자극
- 4개의 관에107개의 격리된 비장 세포/튜브를 분배합니다 (15mL 튜브, 1-4로 표시)
- 각 튜브에 3mL HBSS 2% FCS를 추가합니다.
- 각 튜브에 CSFE 1 μL을 추가합니다(최종 농도- 5 μM).
- 튜브를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 10분 동안 배양합니다.
- 튜브 3 및 4에서는 2.5 μg/mL의 최종 농도에서 HBSS 2% FCS + 안티 CD3 항체의 12mL을 추가합니다. 튜브 3 과 4항 CD3 항체를 사용하여 자극되고, 세포 주기에 미치는 영향을 관찰한다.
- 튜브 1과 2에서 HBSS 2 % FCS의 12 mL을 추가합니다. 튜브 1과 2의 세포는 자극되지 않습니다.
- 원심 분리기는 10 °C에서 7 분 동안 370 x g의 모든 튜브를 합니다. 초월체를 폐기합니다.
- HBSS 2% FCS의 2mL에서 펠릿을 재중단합니다.
- 결과 용액을 6웰 플레이트의 별도의 우물로 옮기.
- 37°C에서 세포를 배양하고 3일 동안 5% CO2를 배양합니다.
5. 셀 염색
대부분의 면역학 연구에서 면역 세포의 증식을 측정하는 것이 핵심 단계이며 CFSE 형광 염료 기반 방법이 일반적으로 사용됩니다. 적절한 세포 분열은 면역 반응의 수준과 특이성을 모두 조절하기 때문에 면역 세포에 중요합니다. 예를 들어, T 세포는 암세포를 식별하고 죽이기 위해 증식하고 B 세포는 세포 분열을 거쳐 특정 항체를 생성합니다. CSFE 분석의 전반적인 전제는 살아있는 세포에 들어가 내부 단백질에 안정적으로 결합하여 영구적인 라벨링을 생성하는 녹색 형광 염료 CFSE로 세포를 염색하는 것입니다. 그 결과, 염료를 함유한 모세포가 분열할 때 각 딸세포는 모세포로부터 형광의 절반을 얻습니다.
이 과정은 후속 분할에서 계속되며 염료 강도는 각 분할에 따라 점진적으로 감소합니다. 원하는 종말점에서 각 세포의 형광 강도는 유세포 분석으로 측정됩니다. 그런 다음 이 데이터는 세포가 거친 분열의 수와 패턴을 정량화하는 데 사용됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이 형광이 가장 높은 세포 집단은 부모 세대에서 온 것입니다. 두 번째로 높은 것은 2세대에 속합니다. 피크의 수는 세포 분열의 수를 결정합니다.
또한 1차 면역 세포를 사용하는 경우 예를 들어 T 세포와 같은 특정 세포 집단을 CFSE와 함께 다른 색상의 형광 염료로 라벨링하고 동시에 다색 유세포 분석을 사용하여 식별할 수 있습니다. 새로운 데이터는 동일한 그래프에 표시할 수 있으며, 이제 CFSE 염색 강도가 다른 T 세포 하위 집단을 표시하여 T 세포의 증식 속도를 구체적으로 분석할 수 있습니다. 이 동영상은 항-CD3 항체로 자극되는 마우스 비장세포의 CFSE 염색 프로토콜을 보여줍니다. 그 다음에는 T 세포를 라벨링하기 위한 염색과 세포 증식을 추적하기 위한 유세포 분석이 이어집니다.
시작하려면 적절한 보호복과 실험실 장갑을 착용하십시오. 다음으로, 집게와 해부 가위를 먼저 세제로 씻은 다음 70% 에탄올로 씻은 다음 깨끗한 종이 타월로 물기를 닦습니다. 50ml 튜브에 1ml의 FCS와 49ml의 HBSS를 결합하여 2% 농도의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 50ml를 준비합니다. 용액을 약 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 비장 B-림프구의 FACS 분리를 위한 비디오 프로토콜에 설명된 대로 마우스 비장 세포를 분리합니다.
4개의 15밀리리터 튜브에 1에서 4까지 라벨을 붙이고 7번째 분리된 비장 세포에 10을 곱한 값을 추가합니다. 다음으로, 각 튜브에 HBSS 2% FCS 3ml를 추가합니다. 그런 다음 5마이크로몰 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 1마이크로리터를 각 튜브에 피펫으로 주입합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 튜브를 10분 동안 배양합니다. 1관과 2관의 세포는 자극되지 않습니다. 그들은 비장 CD4 및 CD8 T 세포의 증식의 기초 수준을 밝히는 데 사용될 것입니다.
이 튜브에 10ml의 HBSS 2% FCS를 피펫팅합니다. 3번 관과 4번 관은 세포주기에 미치는 영향을 관찰하기 위해 항-CD3 항체에 의해 자극됩니다. 최종 농도 2.5마이크로그램의 HBSS 2% FCS 및 항-CD3 항체 10ml를 튜브 3 및 4에 추가합니다. 다음으로, 섭씨 10도에서 7분 동안 370 x g의 모든 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 펠릿을 2ml의 HBSS 2% FCS에 재현탁시키고 생성된 용액을 6웰 플레이트의 별도 웰에 피펫팅합니다. 샘플 ID를 추적하기 위해 플레이트에 1부터 4까지 조심스럽게 레이블을 지정합니다. 세포를 섭씨 37도, 5% CO2에서 3일 동안 배양합니다.
3일차에 HBSS 2% FCS 2ml를 1번과 3번 튜브의 세포를 포함해야 하는 웰 1과 3에 추가합니다. 피펫을 위아래로 격렬하게 피펫팅한 다음 샘플을 라벨이 부착된 5ml FACS 튜브로 옮깁니다. 6웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 웰 2와 4의 나머지 세포는 세포 주기에 대한 자극의 장기적인 영향을 조사하기 위해 5일째에 분석될 것입니다. 섭씨 10도에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 이제 각 튜브에 100마이크로리터의 항체 혼합물을 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 튜브를 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 튜브에 HBSS 2% FCS 1ml를 넣고 섭씨 10도에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 펠릿을 HBSS 2% FCS 200밀리리터에 다시 현탁시키고 잘 섞습니다. 재현탁된 펠릿을 새로 라벨링된 FACS 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 FACS 프로토콜에 표시된 대로 유세포 분석을 사용하여 T 세포 증식을 평가합니다. 세포를 게이트하여 림프 CD3 양성 세포를 선택하고 CD4 양성 세포와 CD8 양성 세포를 구별하며 튜브 1과 3에 대한 데이터를 기록합니다. 5일차에는 6웰 플레이트의 나머지 2개 웰에서 추출한 세포로 세포 염색 과정을 반복합니다.
우리는 자극 후 3일과 5일에 CD4 및 CD8 양성 세포의 세포주기에 대한 CD3 자극의 영향을 분석할 것입니다. 시작하려면 FlowJo 아이콘을 클릭하고 파일을 All Sample 창으로 드래그합니다. 3일째에 수집된 자극되지 않은 세포에 대한 파일을 두 번 클릭하여 y축에 전방 산란이 있고 x축에 측면 산란이 있는 점도표를 표시합니다. polygon을 클릭하여 형태에 따라 림프구 집단을 동그라미로 표시합니다. Sub-population identification 창에서 집단 림프구의 이름을 지정하고 OK를 클릭합니다. 그런 다음 원으로 표시된 모집단을 두 번 클릭하고 새 창에서 y축에서 Thy1.2를 선택하고 x축에서 CD3를 선택합니다. 그런 다음 다각형을 클릭하여 CD3 및 Thy1.2 이중 양성 셀에 동그라미를 그립니다. 새 하위 모집단 식별 창에서 모집단 이름을 T-Cells로 지정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 원으로 표시된 모집단을 두 번 클릭합니다. 새 창에서 y축에서 CD4를 선택하고 x축에서 CD8을 선택합니다. 그런 다음 polygon을 클릭하여 CD4 양성 모집단에 동그라미를 칩니다. 새 하위 집단 식별 창에서 집단의 이름을 CD4 T-Cells로 지정하고 확인을 클릭합니다. 이제 polygon을 클릭하여 CD8 양성 모집단에 동그라미를 칩니다. 새 sub-population identification(하위 집단 식별) 창에서 집단의 이름을 CD8 T-Cells로 지정하고 OK(확인)를 클릭합니다. 다른 파일에 대해 이 단계를 반복합니다.
분열하는 세포와 분열하지 않는 세포의 빈도를 결정하려면 먼저 Layout Editor를 클릭하여 세포 집단을 시각화합니다. 그런 다음 4개의 튜브 각각에서 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 All Sample 창으로 드래그합니다. 모집단을 나타내는 그래프가 나타납니다. 각 튜브에 대해 CD8 T-cell에 대한 점도표를 두 번 클릭하고 Graph Definition(그래프 정의)에서 Histogram(히스토그램)을 선택하여 결과를 시각화합니다. CFSE를 파라미터로 선택하여 각 시점에서 자극된 세포 집단과 자극되지 않은 세포 집단을 비교합니다. 분열하지 않는 세포는 더 높은 수준의 CFSE를 유지하는 반면 증식하는 세포는 CFSE의 함량을 분열하는 세포로 분할합니다.
이제 Shift 키를 누른 상태에서 히스토그램을 두 번 클릭합니다. 새 창에서 범위를 클릭하고 가장 높은 피크에 해당하는 CFSE의 범위를 선택합니다. Sub-population identification 창에서 집단의 이름을 Non-Dividing CD8 T-Cells로 지정하고 집단의 이름을 Dividing CD8 Cells로 지정합니다. 이제 반복하여 각 튜브에서 분열하는 CD4 T 세포와 분열하지 않는 CD4 T 세포를 선택합니다. CD3 양성 세포가 분열하는 빈도를 검사하려면 Table Editor를 클릭하십시오. 그런 다음 관심 집단인 Dividing CD8 T-Cells 및 Dividing CD4 T-Cells를 테이블로 드래그합니다. Statistic(통계) 메뉴에서 Frequency of T-cells(T 세포의 빈도)를 선택합니다. 그런 다음 Create Table(테이블 생성)을 클릭하여 새 테이블에서 빈도를 표시합니다.
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Q1: How does CFSE staining track cell division in immune cells?
CFSE is a green fluorescent dye that enters live cells and binds permanently to internal proteins. When a parent cell divides, each daughter cell receives half the fluorescence from the parent. This process continues through subsequent divisions, with dye intensity progressively decreasing with each division. Flow cytometry then measures the fluorescence intensity of each cell to quantify the number of divisions.
Q2: Why is measuring T cell proliferation important in immunology studies?
Proper cell division in immune cells regulates both the levels and specificity of an immune response. T cells proliferate to identify and kill cancer cells, while B cells divide to produce specific antibodies. Measuring proliferation using CFSE staining and flow cytometry allows researchers to assess how immune cells respond to stimulation and understand the effectiveness of immune responses.
Q3: What do the peaks in a CFSE histogram represent?
Each peak in a CFSE histogram represents a generation of cells based on fluorescence intensity. The highest fluorescence peak corresponds to the parent generation that has not yet divided. The second highest peak belongs to the first generation of daughter cells, and subsequent peaks represent further divisions. The number of peaks determines the total number of cell divisions that have occurred.
Q4: How can researchers distinguish CD4 and CD8 T cell proliferation simultaneously?
Primary immune cells can be labeled with different colored fluorescence dyes alongside CFSE and identified using multicolor flow cytometry. For example, T cell sub-populations can be stained with antibodies against CD4 or CD8 markers while also receiving CFSE labeling. This allows researchers to plot both populations on the same graph and analyze the proliferation rate of each T cell subset separately.
Q5: What is the purpose of anti-CD3 antibody stimulation in this protocol?
Anti-CD3 antibody stimulation is used to activate T cells and observe the effects on the cell cycle. In the protocol, tubes stimulated with anti-CD3 antibody are compared to unstimulated control tubes to reveal the basal level of proliferation. This comparison demonstrates how T cell proliferation changes in response to specific immune stimulation over three and five days.
Q6: How does the CFSE assay distinguish dividing from non-dividing cells?
Non-dividing cells maintain higher levels of CFSE fluorescence because they have not split the dye between daughter cells. Proliferating cells show progressively lower fluorescence intensities as they divide and distribute the dye among daughter cells. By analyzing CFSE intensity histograms, researchers can identify distinct populations of dividing and non-dividing cells and calculate the frequency of each population.
Q7: What cell populations are analyzed when gating lymphocytes in flow cytometry?
Researchers first gate lymphoid cells based on morphology using forward and side scatter. Then they identify CD3-positive T cells, which are further subdivided into CD4-positive and CD8-positive populations. These gated populations are then analyzed for CFSE staining intensity to determine proliferation rates. This hierarchical gating strategy ensures accurate identification and analysis of specific T cell subsets.