Overview
출처: 틸드 앤더슨1,롤프 루드1
1 임상 과학 룬드학과, 감염 의학 학과, 생물 의학 센터, 룬드 대학, 221 00 룬드, 스웨덴
겉보기에는 불가능한 미생물 생물 다양성은 약 1조 종의 공존하는 종(1,2)으로 정말 놀랍습니다. 특히 가혹한 기후, 인간의 위 (3) 또는 남극의 빙하 호수 (4)의 산성 환경 처럼, 특정 종에 의해 지배 될 수 있습니다., 박테리아는 일반적으로 혼합 된 문화에서 발견. 각 균주는 다른 (5)의 성장에 영향을 미칠 수 있기 때문에, "순수"(한 가지 유형으로만 구성)를 분리하고 육성하는 능력은 모두 임상 및 학술 환경에서 필수적이되고있다. 순수한 배양은 추가 유전 (6) 및 proteomic 검사 (7), 샘플 순도의 분석 및, 아마도 더 주목할 만한, 임상 샘플에서 전염하는 에이전트의 식별 및 특성을 가능하게합니다.
박테리아는 성장 요구 사항의 넓은 범위를 가지고 있으며, 까다로운 종과 까다로운 종 (8)을 모두 유지하기 위해 설계된 영양소 미디어의 수많은 유형이있다. 성장 매체는 액체 형태(국물로서) 또는 전형적으로 한천계(적조류에서 유래한 겔화제) 고체 형태로 제조될 수 있다. 국물에 직접 접종은 유전적으로 다양하거나 심지어 혼합 된 세균 인구를 생성할 위험을 수반하지만, 도금및 재 줄무늬는 각 세포가 매우 유사한 유전 적 메이크업을 가지고 있는 순수한 문화를 만듭니다. 줄무늬 플레이트 기술은 개별 세포를 서로 분리하는 것을 목표로 시료(도1)의점진적 희석을 기반으로 합니다. 미디어 및 지정된 환경에 의해 유지되는 모든 실행 가능한 세포(이하 콜로니 형성 유닛, CFU라고 함)는 이후에 이진 분열을 통해 딸 세포의 고립된 식민지를 발견할 수 있다. 세균성 지역 사회 내의 급속한 돌연변이 비율에도 불구하고, 이 세포 단은 일반적으로 복제로 간주됩니다. 이 인구를 수확하고 다시 줄무늬하면 후속 작업이 단일 세균 유형만 포함되도록 합니다.
그림 1: 줄무늬 플레이트는 원래 샘플의 점진적 희석을 기반으로 합니다. I) 접종은 처음에 지그재그 운동을 사용하여 분산되어 상대적으로 조밀한 세균 인구가 있는 영역을 만듭니다. II-IV) 줄무늬는 네 번째 사분면에 도달 할 때까지, 매번 멸균 접종 루프를 사용하여, 이전 영역에서 그려집니다. V) 플레이트 의 중간을 향한 최종 지그재그 동작은 무접종이 현저하게 희석된 영역을 형성하여 식민지가 서로 분리된 것처럼 보일 수 있게 합니다.
줄무늬 플레이트 기술은 선택적 및/또는 차동 매체의 사용과 결합될 수도 있습니다. 선택적 배지는 특정 유기체의 성장을 억제합니다(예를 들어 항생제의 첨가를 통해) 차등 배지는 전적으로 다른 구별하는 데 도움이됩니다(예를 들어 혈액 천식판에 용혈을 통해).
미생물학의 모든 작업의 기본은 무균 (멸균) 기술의 사용입니다. 위험한 긴장, 에어로졸 형성 및 장비/인력의 오염의 의도하지 않은 성장의 위험이 있기 때문에 모든 세균 문화는 잠재적으로 병원성으로 간주되어야 합니다. 이러한 위험을 최소화하기 위해 모든 미디어, 플라스틱, 금속 및 유리 제품은 일반적으로 사용 전후의 오토클레이브를 통해 멸균되어 약 121°C에서 고압 포화 증기를 적용하여 느린 세포를 효과적으로 제거합니다. 작업 공간은 일반적으로 에탄올을 사용하여 소독되어 사용 전과 이후에 모두 사용한다. 실험실 코트와 장갑은 항상 전염성 요원과 함께 작업하는 동안 착용됩니다.
Procedure
1. 설정
- 모든 미생물은 위험한 것처럼 취급되어야 합니다. 항상 실험실 코트와 장갑을 착용하고 긴 머리를 묶고 상처가 특히 잘 보호되도록하십시오.
- 70% 에탄올을 사용하여 살균하여 작업 공간을 준비하십시오.
- 한천 플레이트, 시료 용액, 미리 멸균된 플라스틱 접종 루프 상자 또는 금속 루프와 분센 불꽃이 가까이 있는지 확인하십시오. 일회용 플라스틱 루프는 일반적으로 사전 멸균됩니다. 금속 루프는 70% 에탄올에 담근 다음 분센 불꽃의 푸른 지역 근처에서 열리고 불타는 뜨거운 때까지 가열해야 합니다. 와이어가 플레이트 뚜껑을 올리고 (오염을 방지하기 위해 약간만) 고화 된 매체에 대해 눌러 식힙니다.
- 작업 공간의 반복 살균과 손과 손목의 철저한 세척 / 살균으로 각 절차를 완료합니다.
2. 프로토콜
- 미디어 준비
- 활용된 세균종/균주를 지탱할 고체 배지(전형적으로 1.5%(w/v) 한천을 식별하고 준비한다. 자동 분해 시 오버플로를 피하기 위해 최종 볼륨의 두 배를 보유할 수 있는 병에 매체를 섞습니다.
- 병을 반조개캡으로 20분 동안 121°C로 설정된 오토클레이브에 배치하여 미디어를 살균합니다.
- 병이 오토클레이브에서 제거되는 즉시 캡을 올바르게 닫습니다. 미디어를 곧 사용할 경우 병을 45°C로 설정된 수조에 배치하여 액체 상태로 보존하십시오. 그렇지 않으면 한천은 32-40°C 미만의 것으로 고화되며 나중에 85°C의 융점에 재가열(일반적으로 전자레인지 사용)할 수 있습니다.
- 문화판 준비
- 실험자의 이름, 날짜 및 미디어 유형으로 측면 또는 하단에 멸균 페트리 접시(일반적으로 100 x 15mm)의 베이스를 표시합니다.
- 45°C 천 배양 배지(이전에 준비된) 20-25mL을 각 표기판에 붓습니다. 거품이 가장자리를 따라 나타나면 일반 파이펫과 멸균 팁을 사용하여 신속하게 제거해야합니다.
- 오염을 방지하기 위해 모든 뚜껑을 접시에 다시 놓습니다.
- 한천이 실온에서 약 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 고화되도록 합니다. 일단 설정되면 세균 배양 판은 중간 표면의 응축을 최소화하기 위해 4 °C에서 거꾸로 보관해야합니다.
- 줄무늬 도금
- 멸균 루프를 원하는 접종에 침수하고 지그재그모션(도 1, I)을사용하여 수집된 샘플을 플레이트의 첫 번째 사분면에 즉시 분산시한다.
- 뚜껑을 닫고 접종 루프를 다시 살균하거나 새로운 멸균 일회용 루프를 수집합니다.
- 플레이트의 제2 사분면(도1, II)을향해 제1 사분면(상대적으로 조밀한 세균 집단 포함)에서 방사되는 3-4스트로크를 만듭니다.
- 뚜껑을 닫고 접종 루프를 다시 살균하거나 일회용 루프를 폐기하고 새로운 멸균 루프를 수집합니다.
- 두 번째 타분면에서 세 번째 사분면으로 3-4 스트로크의 이 줄무늬를 반복한 다음, 세 번째에서 네 번째 사분면까지, 매번 멸균 루프를사용하여(그림 1, III - IV)를반복한다.
- 멸균 루프를 사용하여, 플레이트의 중간쪽으로 네 번째 사분면에서 지그재그 패턴으로 하나의 최종 스트로크를한다(도 1, V). 세균성 보급은 이 지역에서 더 낮을 것이고, 이상적으로 개별 식민지가 단 하나, 실행 가능한 어머니 세포에서 설치될 수 있게 합니다.
- 뚜껑을 닫고 (세균 종에 필요한 경우) 공기 흐름을 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉하십시오.
- 세균종/균주에 따라, 배양판을 적절한 환경에서 상측으로 놓고 세균성 식민지가 보일 때까지 배양판을 위쪽으로 내려놓고 배양한다(분리된 식민지는 초기 농도가 다를 수 있으므로 플레이트의 어느 부위에 나타날 수 있음).
- 클로날 세균성 인구를 생성하기 위해, 다른 플레이트를 줄이면 원래 판의 단일 콜로니에서 분리된 세포를 위해 원래 플레이트에 도금된 접종을 교환한다.
페트리 접시에, 하나의 박테리아가 무성 생식의 여러 라운드를 겪는 다면, 그것은 클로날 식민지의 형성으로 이어질 것입니다. 그러나 토양 현탁액과 같은 혼합 시료로부터 단일 박테리아를 얻는 것은 어려울 수 있다. 이 이기종 문화의 한 루프를 촬영 하는 경우, 그것은 1 조 개별 박테리아를 포함할 수 있습니다. 이 많은 박테리아를 한천판 표면에 퍼뜨리고 단일 식민지를 얻으려면 지그재그 패턴을 사용하여 루프를 자유 섬 전체를 둘러싸고 나란히 놓인 충분한 플레이트의 표면 위로 지속적으로 드래그해야합니다. 분명히, 과학자들은 정말 많은 판을 사용하지 않습니다. 대신, 그들은 줄무늬 도금이라는 기술을 사용합니다.
줄무늬 플레이트 기술은 세균 샘플의 점진적 희석을 기반으로하며 단일 페트리 접시의 고체 미디어 표면을 통해 수행됩니다. 우선, 미디어 표면은 둘레의 4개의 조각을 처음 네 부분으로 할당하고 플레이트의 중심을 다섯 번째 섹션으로 지정하여 시각적으로 5개의 섹션으로 나뉩니다. 이렇게 하면 페트리 접시 한 개에서 5개의 미디어 플레이트가 효과적으로 생성됩니다. 다음으로, 원하는 무접종의 루프를 사용하여, 첫 번째 섹션은 지그재그 패턴을 사용하여 줄무늬가 됩니다. 그런 다음, 새로운 일회용 루프가 사용되거나 와이어 루프의 경우 분젠 버너로 멸균되어 와이어 의 길이에 따라 빨간색이 뜨거워지 때까지 불타는다. 새로운 루프또는 화염 살균 루프의 이러한 사용은 박테리아의 희석을 보조하는 남은 세균 세포를 제거합니다. 핫 루프는 다음 몇 초 동안 공기에서 냉각된 다음 첫 번째 섹션을 통해 드래그되어 각각 박테리아의 일부만 두 번째 섹션으로 운반합니다. 나머지 섹션은 매번 멸균 루프를 사용하여 동일한 방식으로 줄무늬가 있으며 이전 줄무늬를 통과하는 단일 패스입니다.
줄무늬와 살균의이 주기를 사용 하 여, 최종 섹션은 몇 개의 개별적으로 위치한 박테리아를 포함 되도록 모든 후속 섹션에 세균 농도 희석 되어야 한다. 인큐베이션시, 이러한 이산 박테리아는 식민지 성형 유닛, 또는 CFU라고 불리는 딸 세포의 고립 된 클로날 식민지를 생산하기 위해 증식합니다. 이들은 수확하고 순수한 배양이라고 칭하는 단 하나 세균 모형을 관련시키는 것을 확인하기 위하여 다시 줄무늬가 있습니다. 혼합 세균 배양에서 단일 식민지를 격리 할뿐만 아니라, 줄무늬 도금 기술은 또한 미디어 특정 균주를 선택세균성 식민지 형태를 결정하거나, 다른 세균종을 식별하는 데 사용됩니다. 이 비디오에서는, 우리는 줄무늬 도금 기술을 통해 혼합 세균 샘플 서스펜션에서 단하나 세균성 식민지를 격리하는 방법을 보여줍니다.
먼저 실험실 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. 다음으로 70% 에탄올을 사용하여 작업 공간을 소독합니다. 다음으로, 활용된 세균종 또는 균주를 유지하고 미디어 준비를 시작하는 적합한 배지를 선택한다. 여기서 일반적인 LB 한천은 미리 제조된 분말 미디어 10그램과 7.5그램의 한고를 계량하여 제조합니다. 무게가 있는 건조된 부품을 유리 병에 추가하여 오버플로를 피하기 위해 최종 볼륨의 두 배를 보유할 수 있습니다. 그런 다음 병에 500 밀리리터의 물을 넣고 반 단단히 덮습니다. 병을 121°C로 설정하여 20분 동안 오토클레이브에 배치하여 미디어를 살균합니다. 완료 후 방열 장갑이나 핫 패드를 사용하여 기기에서 미디어를 제거한 다음 즉시 병 뚜껑을 비틀어 단단히 닫습니다.
당일 사용시, 액체 상태에서 미디어를 보존하기 위해 약 45섭씨까지 가열된 수조에 병을 배치하여 미디어를 식히게 하십시오. 또는, 매체는 실온에서 방치하여 솔리드 상태로 저장할 수 있다. 필요한 경우 뚜껑을 약간 열어 미디어를 녹여 서 45도 수조를 사용 하 여 미디어를 냉각 할 수 있습니다.
다음으로, 멸균 페트리 접시의 소매를 가지고, 영구 마커와 함께, 조사자 및 미디어 이름뿐만 아니라 날짜로 레이블. 그런 다음 필요한 양의 미디어를 멸균 용기로 옮기고 필요한 경우 항생제 또는 기타 민감한 성분을 추가합니다. 여기서, 50 밀리리터의 미디어가 100마이크로리터의 카나마이신과 혼합되어 밀리리터당 25마이크로그램의 최종 농도가 있습니다. 튜브를 소용돌이어 미디어 전체에 추가된 구성 요소를 균일하게 분배합니다. 천천히, 거품 형성을 피하기 위해, 각 플레이트에 섭씨 약 45도 의 20 ~ 25 밀리리터를 부어. 거품이나 거품이 나타나면 일반 파이펫과 멸균 팁을 사용하여 신속하게 제거하십시오. 그런 다음 오염을 방지하기 위해 모든 뚜껑을 즉시 교체하십시오. 한천이 실온에서 적어도 2시간 또는 하룻밤 동안 고화되도록 합니다. 일단 고형화되면 배양판을 섭씨 4도에 거꾸로 저장하여 중간 표면의 응축을 최소화합니다.
선택한 문화를 줄이려면 먼저 깨끗한 배양 판을 가지고 뚜껑을 제거하십시오. 신속하게 작업하고, 일회용 멸균 루프를 원하는 접종에 담근 다음 지그재그 동작을 사용하여 플레이트의 첫 번째 사분면에 루프를 즉시 면봉합니다. 접시뚜껑을 교체하고 사용된 접종 루프를 폐기한 다음 새 멸균 루프를 선택합니다. 새로운 루프를 사용하여, 제 1 사분면에서 방사되는 원래 면봉 선을 가로지르는 3~4개의 스트로크를 만드십시오. 뚜껑을 다시 한 번 닫고 루프를 폐기합니다. 새 루프를 사용하면 이 작업을 다시 반복하지만 이번에는 두 번째 에서 세 번째 사분면으로 줄무늬가 됩니다. 그런 다음 새 루프를 다시 사용하면 세 번째 루프에서 플레이트의 네 번째 섹션으로 또 다른 줄무늬를 만듭니다. 마지막으로, 신선한 루프를 통해 네 번째 사분면에서 플레이트 의 중앙을 향해 지그재그 패턴으로 마지막 스트로크를 만듭니다. 세균성 보급은 이 지역에 있는 더 낮을 것입니다, 이상적으로 개별 식민지가 단 하나 실행 가능한 어머니 세포에서 설치될 수 있도록 허용합니다.
플레이트 뚜껑을 교체하고 세균종에 적합한 경우, 공기 흐름을 방지하기 위해 판을 파라 필름으로 밀봉한다. 코격 플레이트를 거꾸로 뒤집어 응축 물방울을 방지한 다음 성장에 적합한 온도에 놓습니다. 여기서 인큐베이터는 섭씨 37도로 설정됩니다. 세균성 식민지가 보일 때까지 접시를 배양하도록 허용하십시오. 복제 세균 성 인구를 생성하려면이 플레이트에서 하나의 개별 식민지를 선택합니다. 이제 멸균 루프를 사용하면 대상 식민지를 터치하고 이전과 마찬가지로 새 플레이트의 첫 번째 사분면에서 연승을 만듭니다. 루프를 번갈아 살균하고 이전에 설명한 대로 플레이트의 나머지 사분면을 줄이며 지그재그로 중앙으로 끝납니다. 접시를 닫고 분리된 식민지가 형성될 때까지 배양하도록 놓습니다. 이러한 식민지가 재배되면 일반적으로 순수한 복제 균주를 나타냅니다.
초기 줄무늬 플레이트는 샘플 순도에 따라 다른 세균성 종 또는 다른 유전 적 구성을 가진 세포로부터 유래한 콜로니를 포함할 수 있다. 모든 단위가 일반적인 어머니 세포에서 파생되는 단일 식민지의 후속 격리를 통해, 두 번째 줄무늬 절차는 국물에 추가 특성화 또는 접종에 적합한 상대적으로 복제 세균 집단을 생성합니다.
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Results
초기 줄무늬 플레이트는 상이한 유전적 메이크업을 가진 세포로부터 유래되는 콜로니를 포함하거나(샘플 순도에 따라 다름)를 상이한 세균종(도2A)으로부터포함할 수 있다.
모든 단위가 일반적인 모성 세포로부터 파생되는 단일 식민지의 후속 격리를 통해, 두 번째 줄무늬 절차는 상대적으로 복제 세균성 집단을 생성하여 국물에 대한 추가 특성화 또는 접종에 적합합니다(도2B).
도 2: 하나의 한적한 식민지의 분리를 통해 혼합 시료로부터 순수한 배양을 생성할 수 있다. A) 단일 세균성 세포 (CFU)의 성장은 다른 종 및 균주의 것과 분리 된 복제 식민지를 생성했습니다. 이러한 CFU는 새로운 플레이트 B) 제2판에 후속 줄무늬를 위해 사용되었으며, 세균 집단은 초기 CFU로부터 유래된 세포만으로 구성된다.
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Applications and Summary
순수한 세균 성 식민지를 얻고 육성 하는 능력은 필수적이다, 임상 및 학술 설정모두에서. 줄무늬 도금은 상대적으로 복제 세포 집단의 격리를 가능하게, 공유 CFU에서 유래, 진단 중 또는 격리의 추가 특성에 대한 특정 관심있을 수 있습니다. 시료는 적합한 한천 계 영양 매체에 줄무늬가 있고 식민지가 눈에 띄게 될 때까지 배양됩니다. 고립된 식민지는 이후에 수확되어 두 번째 접시에 다시 줄지어 놓입니다.
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