Conjugaison : méthode de transfert de la résistance à l'ampicilline du donneur à l'hôte E. coli

Les cellules bactériennes, comme E. coli, sont capables de transférer l'information génétique de cellule en cellule. La conjugaison diffère des autres mécanismes de transfert d'ADN, tels que la transduction ou la transformation, en ce qu'elle nécessite un contact physique entre les cellules.

Pour procéder, la conjugaison nécessite une cellule donneuse qui exprime la fertilité, ou F, facteur et une cellule receveuse sans elle, une cellule F moins. Le processus nécessite deux étapes. Le premier est l'établissement d'un contact direct de cellule à cellule. Pour ce faire, la cellule du donneur génère une structure filamentelle extracellulaire appelée pilus sexuel. Il est nommé ainsi depuis la conjugaison est une forme d'accouplement pour les bactéries reproductrices asexuées, mais il convient de noter que ce n'est pas la reproduction sexuelle vrai car aucun gamète s'échange et aucune progéniture ne sont formées.

La deuxième étape consiste à livrer de l'ADN à la cellule récepteuse. Après que le pilus de sexe établit le contact entre deux cellules, un conduit appelé le système de sécrétion de type IV est construit permettant le transfert de l'ADN. La cellule donneuse commence alors à reproduire l'ADN extrachromosomique qui sera transféré sélectionné en fonction de la présence d'un élément génétique connu sous le nom d'OriT ou origine du transfert. Une extrémité de l'ADN nouvellement reproduit est enfilée dans le conduit par la liaison de protéine d'ADN. Au fur et à mesure que l'ADN est reproduit, il est pompé par le canal, facilité par un complexe de protéines codées par des gènes situés à proximité de l'OriT. Une fois que l'ADN est entièrement transféré, il formera soit un plasmide chromosomique supplémentaire, soit il peut s'intégrer dans le chromosome de la cellule recevable. Quel que soit le point final de l'ADN transféré, les gènes qu'il code seront alors exprimés. Cette expression génique peut être utilisée pour confirmer la conjugaison réussie.

Par exemple, envisagez un scénario où la souche du donneur exprime une résistance à l'ampicilline et la transmet dans l'ADN conjugué à la bactérie receveure, mais la souche receveuse a également un gène de résistance à la tétracycline qui n'est pas présent chez le donneur. Dans ce cas, lorsque les cellules sont plaquées sur le support LB contenant à la fois la tétracycline et l'ampicilline, les colonies ne devraient se développer que de bactéries conjuguées avec succès, qui exprimeront les deux phénotypes de résistance. Pour confirmer davantage la conjugaison réussie, l'ADN plasmide de ces colonies peut être moissonné et alors une section de l'ADN spécifique au plasmide transféré peut être amplifiée utilisant la réaction en chaîne de polymérase, ou PCR. Lorsque le produit PCR est exécuté sur un gel d'électrophoresis à côté d'une échelle de tailles standard, un fragment de PCR d'une taille connue devrait être visible sur le gel, confirmant davantage la conjugaison réussie. Dans cette expérience, un plasmide sera utilisé pour transférer le gène de résistance à l'ampicilline par conjugaison d'une souche de donneur à une souche récepteuse résistante à la tétracycline. Après cela, pour confirmer la conjugaison, le mélange de conjugaison sera incubé sur une plaque contenant les deux antibiotiques ne laissant que les bactéries transformées. Enfin, la conjugaison réussie sera confirmée par PCR.

Avant de commencer la procédure, mettez l'équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stérilisez l'espace de travail à l'aide de 70 % d'éthanol pour essuyer la surface.

Dans cette procédure, le gène de résistance à l'ampicilline sera transféré de la souche WM3064 d'E. coli à la souche J53 d'E. coli par conjugaison. La souche de donneur WM3064 est résistante à la tétracycline et à l'ampicilline et nécessite la croissance de l'acide diaminopimelique, ou DAP. La souche bénéficiaire J53 n'est résistante qu'à la tétracycline et ne nécessite pas la croissance du DAP. Cela signifie que les cellules conjuguées avec succès doivent être résistantes à la tétracycline et à l'ampicilline et peuvent se développer sans DAP.

Préparer la culture de la souche du donneur en inoculant cinq millilitres de LB contenant 0,3 millimoles de DAP avec un morceau du stock de glycérol de souche de donneur congelé. Ensuite, préparer la souche du receveur en inoculé cinq millilitres de bouillon LB sans DAP avec un morceau de la souche congelée souche de stock de glycérol. Cultivez ces cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec l'aération et secouant à 220 tr/min dans un incubateur secouant. Une fois que les cultures ont grandi à un OD 600 de deux, supprimer un millilitre de culture de chacun et placer cela en deux nouveaux tubes distincts de 1,5 millilitre microcentrifuge. Ensuite, centrifuger ces aliquots à 3000 tr/min pendant cinq minutes pour granuler les cellules bactériennes. Jeter le supernatant et laver chaque granule avec 250 microlitres de 1X PBS. Centrifuger les échantillons à nouveau et, après avoir jeté le supernatant, resuspendre chaque granule dans 500 microlitres de PBS.

Pour commencer la procédure de conjugaison, d'abord combiner 50 microlitres de cellules receveurs avec 50 microlitres de cellules donneurs dans un tube de microcentrifuge de 1,5 millilitre et mélanger en pipetting de haut en bas doucement. Ensuite, pipette 100 microlitres de la culture cellulaire destinataire sur une autre plaque de tétracycline 1X contenant DAP. Ensuite, préparez votre contrôle négatif en pipetting 100 microlitres de la culture de cellules destinataires seulement sur une plaque d'agar non sélective contenant DAP. Ensuite, incuber la conjugaison et les plaques de contrôle négatives pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, prenez un grattoir à cellules stériles et récoltez les cellules de la plaque de conjugaison en collectant des colonies. Ensuite, transférez les colonies dans un tube stérile de 1,5 millilitre de microcentrifuge contenant un millilitre de 1X PBS. Répétez ce processus pour recueillir les cellules réceptrices de l'autre plaque.

Après cela, vortex les échantillons à mélanger. Après le mélange, transférer les tubes dans une centrifugeuse pour granuler doucement les cellules. Jeter le supernatant, puis laver les granulés de cellules dans un millilitre de PBS et vortex les tubes pour resuspendre les cellules. Pelleter à nouveau les cellules en centrifugeant. Jetez le supernatant à nouveau et resuspendre les deux granulés de cellules dans un millilitre de PBS. Maintenant, à l'aide d'une pointe de pipette stérile, plaque 100 microlitres du mélange de cellules de réaction de conjugaison sur une plaque d'agar LB sans DAP contenant 1X tétracycline et 1X ampicilline. Répétez la méthode de placage en utilisant 100 microlitres d'une dilution décuplée du même mélange cellulaire dans PBS sur une autre plaque d'agar LB sans DAP contenant 1X tétracycline et 1X ampicilline.

Enfin, pipette 100 microlitres du mélange négatif de cellules de contrôle sur une seule plaque d'agar LB avec 1X tétracycline seulement. Après une incubation de nuit à 37 degrés Celsius, les colonies devraient être visibles. À l'aide d'une pointe de pipette stérile, choisissez une seule colonie de la plaque de réaction de conjugaison et ajoutez-la à un tube contenant cinq millilitres de supports sélectifs LB contenant les deux antibiotiques. Ensuite, répétez l'isolement de la colonie en sélectionnant une seule colonie à partir de la plaque de cellule récepteur. Cultivez ces cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une aération à 220 Tr/min.

Le lendemain, essuyez le dessus du banc avec 70 % d'éthanol et retirez les assiettes de l'incubateur. Utilisez un kit de préparation à l'ADN pour isoler l'ADN de 4. 5 millilitres de chaque culture selon les instructions du fabricant. Après avoir terminé la mini-préparation de l'ADN, éluter l'ADN en utilisant 35 microlitres d'eau sans nucléane. Enfin, utilisez le 0 restant. 5 millilitres de chaque culture pour préparer un millilitre de glycérol stocks en ajoutant 0,5 millilitres de 100% de glycérol pour une dilution un-à-un. Placez ces aliquots à moins 80 degrés Celsius pour le stockage jusqu'à ce que nécessaire.

Pour confirmer la conjugaison réussie par PCR, préparez d'abord un mix PCR master en ajoutant 75 microlitres de mix maître 2X PCR à un tube microcentrifuge. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres chacun d'une amorce avant de 10 micromolaires et une amorce inverse de 10 micromolaires conçue pour amplifier le gène de résistance à l'ampicilline du plasmide. Ensuite, préparez un deuxième mix PCR master en ajoutant 75 microlitres de mix principal PCR 2X à un tube microcentrifuge, puis en ajoutant 7,5 microlitres chacun d'une amorce avant de 10 micromolaires et 10 micromolaires amorteur inverse conçu pour amplifier un gène d'entretien ménager, dans ce cas l'ADN gyrase B.

Maintenant, ajoutez 15 microlitres du premier mix maître à un tube PCR, puis ajoutez 10 nanogrammes, environ deux microlitres de l'ADN expérimental modèle au même tube. Porter la réaction à un volume final de 25 microlitres avec de l'eau sans nucléane. Répétez ces étapes pour produire les cinq réactions restantes, de sorte que les tubes contiennent les composants montrés ici. Maintenant, transférez ces réactions à un thermocycleur avec le bloc préchauffé à 98 degrés Celsius, puis lancez le programme. Après l'achèvement du PCR, retirez les tubes de la machine. Ensuite, chargez deux microlitres de chaque réaction mélangés avec deux microlitres de colorant de chargement et quatre microlitres d'un marqueur de poids moléculaire dans des puits consécutifs d'un gel agarose de 1%. Définir le gel pour qu'il s'exécute à 150 volts pendant 20 minutes. Enfin, visualisez le gel à l'aide d'un illuminateur UV.

Dans cette expérience, le transfert réussi du gène de résistance d'ampicilline par la conjugaison a été confirmé par l'intermédiaire de PCR. Ici, une bande de taille d'environ 500 paires de base devrait être observée dans le puits contenant l'ADN conjugué et les amorces d'ampicilline, bien deux dans cet exemple. Un gène d'entretien ménager, le gyrase B d'ADN, a été chargé dans des puits trois et cinq avec l'ADN conjugué et l'ADN de cellules destinataires, respectivement. Les bandes observées dans ces puits agissent comme un contrôle positif pour s'assurer que le modèle d'ADN était présent et que le PCR a été réussi. Les bandes ne doivent pas être observées dans le puits contenant la réaction pour l'ADN des cellules réceptrices et la paire d'amorce d'ampicilline, bien quatre dans cet exemple, parce que les cellules réceptrices ne sont pas résistantes à l'ampicilline. En outre, aucune bande ne doit être observée dans les réactions dépourvues d'ADN modèle, puits six et sept ici. Si ces conditions sont remplies, cela confirmera le transfert réussi du gène de résistance à l'ampicilline, conférant une résistance à l'ampicilline de la souche WM3064 d'E. coli à la souche J53 de E. coli.