Name: 可视化的Live果蝇胶质细胞神经肌肉交界处，与荧光染料 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习果蝇幼虫外翻组织制备技术，利用荧光染料和共聚焦显微镜实时成像胶质细胞与神经肌肉接头的结构特征，为研究突触功能中的胶质细胞作用提供新方法。

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本项目由加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。我们感谢Barb Jusiak在构建表达dsRed标记的SSR（BJ品系）果蝇品系方面所做的贡献，以及不列颠哥伦比亚大学生物成像中心提供的支持。

第1部分：组织制备
<ol>
	<li>我们的目标是制备一种果蝇幼虫组织，其中神经系统保持完整，同时体壁肌肉的内表面暴露于人工血淋巴中，并可紧贴显微镜盖玻片以获得良好的光学效果。换句话说，即一种内外翻转的幼虫制备样本。 
	 
	由于传统的组织制备方法通常涉及切割、固定和拉伸体壁肌肉，有时还需移除部分神经系统，因此我们需要采用一种不同的方法。 
	 
	我们希望将动物内外翻转，以便能够清晰观察突触中随时间变化的结构特征和结构动态，同时保持神经系统的完整性。我们还希望避免拉伸组织以及激活牵张感受器，否则会引起肌肉抽搐，从而破坏成像质量。</li>
	 
	<li>首先，对实验动物进行分期。取摄食期三龄幼虫或游走期三龄幼虫，因其体型较大、易于解剖，本实验将以W3期幼虫为例进行演示。该幼虫具有Tubby表型，体型宽大，易于外翻。 
	 
	仅使用观察到正在活跃爬行的幼虫，包括W3期幼虫。</li>
	<li>在含有双蒸水的培养皿中，用极柔软的画笔清洁蛆体表面。清洁后的幼虫具有更好的光学特性，且可减少细菌污染。</li>
	<li>将幼虫转移至盛有约3 ml冰冻HL-6人工血淋巴的小培养皿中，并将培养皿置于冰上，直至幼虫停止活动并完全松弛（约5分钟）。</li>
	<li>一手持精细尖头镊子，另一手持弹簧剪刀。我习惯用惯用手操作剪刀。用剪刀在体壁上刺一个小孔，以平衡体壁内外的压力。</li>
	<li>用镊子轻轻将幼虫固定在培养皿底部，剪除后端两个体节。解剖过程中，内脏和脂肪体会从体腔中移出，需一并剪除。</li>
	<li>用精细镊子将幼虫固定在培养皿底部，手持一支#0昆虫针（钝头），顶住幼虫口器部位，将口器推入体腔，如同将袜子内面翻出一般，完成外翻操作。</li>
	<li>内外翻转后的组织应如图所示。使用超细解剖工具，小心去除体壁上的脂肪体和气管。务必极其小心，避免牵拉气管或断开神经系统。撕裂气管会导致体壁肌肉出现破孔。 
	 
	尽可能清除所有脂肪体。这两种结构均会干扰组织的光学质量。建议在进行此操作前避免饮用咖啡。</li>
	 
	<li>完成操作后，肌肉应呈半透明状，而非不透明或白色。若将组织制备样本置于不含谷氨酸的HL-6溶液中，并在室温下孵育，其可能因中枢神经系统中的运动模式发生器仍在工作而出现节律性收缩。 
	 
	应避免使用体壁肌肉明显收缩或不规则收缩的制备样本。 
	 
	完整且内外翻转的体壁组织容易沿背侧和腹侧中线对折，因此制备样本通常呈现为左侧或右侧的“半体动物”结构，便于观察。</li>
	<li>1.9 可将组织样本置于小型商用腔室（如Warner腔室）中，或采用桥式盖玻片结构的载玻片进行封片。有关组织封片的建议，请参见第3部分。</li>
</ol>
第二部分：使用荧光标记的抗 HRP 一抗对神经元突触小泡进行标记。
<ol>
	<li>在培养皿中滴加50微升针对HRP的荧光标记一抗（溶于HL-6缓冲液），将翻转的体壁制备物浸入染料溶液中。约5分钟后可观察到神经末梢的标记，但为获得完整且明亮的标记，建议孵育10–20分钟。</li>
	<li>在室温下用HL-6缓冲液漂洗10–30秒，以去除未结合的染料。未结合的染料可迅速被洗脱，因此漂洗过程无需剧烈。</li>
	<li>根据需要调整染料浓度和孵育时间。</li>
</ol>
第3部分：使用葡聚糖荧光素偶联物标记突触周围间隙
<ol>
	<li>将荧光标记的葡聚糖染料用HL-6稀释。适用于我们实验目的的浓度为：</li>
	<li>如果您不关注染料进入细胞外空间的时间，可在“桥接”盖玻片（见第4部分）上滴加20微升染料，并将样品浸入染料液滴中。</li>
</ol>
第4部分：组织封片以进行观察（使用共聚焦显微镜）。
如果无需对样本进行灌流（短时间观察）或希望减少浴液HL-6的用量，可采用双桥式载玻片法
如果需要对样本进行灌流，可尝试使用灌流室。我们使用的是 Warner Instruments 公司的改良型灌流室。
以下详细介绍两者细节。
将样品固定在双桥载玻片上。
<ol>
	<li>使用非常洁净的显微镜载玻片。将两片18 mm的方形盖玻片（#1.5）用超级胶水粘附在载玻片上，两片盖玻片边缘之间保留2 mm的间隙。</li>
	<li>让胶水完全干燥，否则会在样本周围的水性介质上形成异常薄膜。</li>
	<li>将翻转的幼虫置于盖玻片边缘之间。如果幼虫较大，且成像系统像素阵列有限，可能需要将样本以对角线方向放置。</li>
	<li>用一片#1.5、18 mm的洁净盖玻片覆盖组织。使用极少量凡士林将“顶部”盖玻片粘附在载玻片上已固定的两侧盖玻片上。</li>
	<li>在顶部盖玻片上滴加一滴Cargill定制的折射率为1.3379的物镜油（若使用HL-6），然后将整个装置翻转过来。</li>
	<li>将组织装置放置在显微镜上，使油面朝向物镜，并调节物镜焦距。 
使用改良灌流室固定组织。</li>
	<li>将一片#1.5盖玻片粘在RC-20灌流室中作为底部。按照RC-20说明书将组织放入灌流室中，并使用Nytex网片代替盖玻片作为灌流室的顶部。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果：
<ol>
	<li>组织外翻制备的解剖步骤： 
	<img alt="昆虫幼虫阶段；显微镜下特写图像；发育变化观察。" src="/files/ftp_upload/1154/fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
	W3期幼虫，经清洗后（“Tubby”表型）（5.1.1）。W3期幼虫，后部两个体节已解剖。可见脂肪体因体壁压力被推出体腔（箭头所示）。为尽量减少内脏“外溢”，可在解剖前1分钟于体壁上制造一个小孔（5.1.2）。在将组织外翻之前已完成内脏去除的制备样本（5.1.3）。组织大部分已外翻，固定针位于组织腔内（箭头所示）（5.1.4）。此时肌肉位于外侧，表皮位于内侧，部分脂肪体和气管仍附着其上（5.1.5）。完全解剖后的组织制备样本，几乎所有的脂肪体和气管均已去除（5.1.6）。 
	<img alt="GFP与α-HRP蛋白在神经元突触中的荧光显微成像，显示蛋白定位。" height="200" src="/files/ftp_upload/1154/fig2a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"></li>
	<li>利用抗-HRP抗体对幼虫神经肌肉接头进行活体标记。图示为一个典型的W3期幼虫神经-肌肉突触，包含胶质细胞延伸结构（外翻制备）。运动神经元轴突终末使用针对HRP的一抗（品红色）标记，并与Cy5偶联。胶质细胞突起以GFP（绿色）标记。 
	<img alt="GFP/dsRed/葡聚糖荧光显微成像，用于观察神经连接性，示意图显示蛋白标记情况。" src="/files/ftp_upload/1154/fig2b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"></li>
	<li>在外翻制备样本中，使用Alexa 680标记的葡聚糖荧光显示突触周围间隙。胶质细胞突起（绿色）由膜定位GFP标记。肌肉表面的突触后次级褶皱结构（SSR）以dsRed标记（蓝色）。Alexa葡聚糖（红色）在细胞外区域聚集，在突触周围间隙形成环状（类似“甜甜圈”形状）的染料池。葡聚糖染料标记与dsRed标记的SSR以灰度图显示。注意多个环状染料池清晰勾勒出突触周围间隙（箭头所示）。</li>
</ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicles%3A+Test+for+a+role+in+presynaptic+Calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium-channel+currents+in+normal+and+csp+mutant+Drosophila+peptidergic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals.</a> Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).</li>
<li>Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Function+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li>
</ol>

该方法可实现对活体标记蛋白和细胞过程的长期成像。in situ 组织制备样品具有完整且功能正常的中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）以及反射回路。与标准的幼虫果蝇肌肉实验方案相比，该组织制备方法具有优势；在标准方案中，幼虫体壁肌肉被拉伸（当其被固定展开时），而拉伸可能导致突触形态扭曲，并引发基于反射的肌肉收缩。我们的外翻式制备样品机械稳定性良好，光学性能极佳，有利于对细胞动态变化进行高分辨率的实时分析。此外，外翻式制备样品可存活长达一小时，能够实现对突触变化的长时间观察。
解剖过程中，注意避免损伤外周神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）。同时避免撕扯或牵拉气管，以免损伤肌细胞。尽量使体壁肌肉保持松弛状态。将HL-6溶液及组织冷却可使体壁肌肉松弛，并降低贯穿体壁的张力。人工血淋巴中含有钙离子（2 mM），对胶质细胞的健康和形态至关重要。
成像必须在稳定且不发生收缩的肌肉组织上进行。虽然5 mM谷氨酸能有效阻断神经诱发的肌肉收缩，但钙通道阻滞剂硝苯地平可能是一种有用的替代方案。10微摩尔浓度的硝苯...

<table><tbody><tr><td>HL-6：人工果蝇血淋巴，添加5 mM L-谷氨酸和2 mM 钙</td><td>试剂</td><td>N/A</td><td>NA</td><td>5 mM L-谷氨酸可阻断肌肉收缩。我们使用了分子级L-谷氨酸（Sigma）。2 mM 钙浓度接近天然幼虫血淋巴中的生理钙水平。参考文献：Macleod 等，2002 年；Macleod，2004 年</td></tr><tr><td>葡聚糖，Alexa Fluor 680；分子量10,000，阴离子型，可固定</td><td>试剂</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D34680</td><td>使用小体积灌流室以保持染料总体积较低</td></tr><tr><td>抗-HRP-CY5偶联物（山羊来源）</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-175-021</td><td>将2.0 mg溶解于1 ml ddH₂O中；分装为每份4微升。在&amp;#8211;20°C下冷冻保存。每次实验取一份分装样品，溶于100微升HL-6中使用</td></tr><tr><td>Alexa 647抗体标记试剂盒</td><td>试剂</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A10475</td><td>我们共制备了80微升偶联的一抗溶液，并分装为每份2微升保存。每次标记时将一份分装样品稀释至100微升HL-6中使用</td></tr><tr><td>定制配方物镜油，折射率1.3379</td><td>试剂</td><td>Cargill Labs</td><td>Custom Formulated</td><td></td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23 或 11295-20</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>超细修枝剪刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>灌流室RC 20系列</td><td>工具</td><td>Warner Instruments</td><td>64-02222</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>显微镜</td><td>Quorum Technologies</td><td>Quorum Wave FX</td><td>安装在Leica DMI6000倒置显微镜上</td></tr></tbody></table>

实时成像 黑腹果蝇 荧光染料标记的胶质细胞-神经肌肉接头

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

我们的项目在发育中的幼虫果蝇神经肌肉突触处鉴定出表达GFP标记的胶质结构。为了观察活体胶质-神经-肌肉突触的发育过程，我们建立了一种幼虫组织制备方法，该方法既保留了活体完整幼虫的特性，又具备良好的光学性质。这种新的制备方法还允许灌流液进入突触区域。我们使用果蝇幼虫，将其浸入人工血淋巴液中，并通过低温处理抑制其正常的节律性身体收缩。随后，解剖去除每只幼虫的后部体节，并用钝头昆虫针将口器部分向后推入体腔，使幼虫体壁外翻，类似于将袜子内面翻出。接着使用超细解剖剪完成解剖，从而暴露体壁肌肉的内脏面。位于神经肌肉接头（NMJ）处的胶质结构在胶质细胞特异性启动子的调控下表达膜定位的GFP。肌肉中突触后膜结构——亚突触网（SSR，Subsynaptic Reticula）则表达突触靶向的dsRed。我们需要对突触的第三组成部分——运动神经元末梢进行急性标记。为此，我们使用与远红外荧光染料偶联的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗进行标记。为了检测荧光染料分子向运动神经元末梢与SSR之间突触周围间隙的扩散特性，我们施加了与远红外荧光染料偶联的大分子右旋糖酐溶液，并采集图像。

我们利用共聚焦显微镜结合荧光染料，在一种新型的活体果蝇幼虫“内向外”组织制备中，描述了胶质细胞-神经肌肉突触的结构特征。我们使用标记荧光的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗对活神经元末梢进行标记，同时利用荧光葡聚糖对突触周围间隙进行可视化观察。

我们的项目在发育中的幼虫果蝇神经肌肉突触处鉴定出GFP标记的胶质结构。为了观察活体胶质-神经-肌肉发育过程……

该实验首先制备果蝇幼虫，将其翻转使体壁肌肉细胞表面相关的运动神经元和胶质细胞暴露出来，结合对突触前神经元末梢的荧光染色、胶质细胞和突触后肌肉细胞膜上靶向表达的GFP与DS red的内源性表达，以及利用荧光染料对突触旁间隙进行成像，可在活体样本中清晰观察到胶质神经肌肉接头处发生的结构变化。大家好，我是不列颠哥伦比亚大学动物学系Vanessa渐冻症实验室的D Brink。今天我将向大家展示一种组织制备方法及两种细胞标记技术，用于活体果蝇三龄幼虫组织的共聚焦显微镜成像。我们在实验室中采用此方法研究神经肌肉突触处的胶质细胞。现在，让我们来介绍一种完全不同的方法：从内到外的组织制备始于幼虫的分期。本方案将以游走期三龄幼虫为例进行演示，因为它们体型较大且易于解剖，仅使用那些正在活跃爬行的三龄幼虫。接下来，用非常柔软的画笔在盛有双蒸水的培养皿中清洁幼虫表面。清洁幼虫非常重要，因为这可以改善光学效果，同时减少细菌。幼虫清洁后，将其转移至含有3 mL冰冻HL6溶液（含5 mmol/L谷氨酸）的小培养皿中。将培养皿置于冰上，直至动物停止活动并完全放松，通常需要约两分钟。一旦幼虫停止运动，即可开始组织解剖：用惯用手持弹簧剪，另一只手持超细尖镊子，在解剖显微镜下操作。用另一只手用剪刀在体壁上剪出一个小孔，以平衡体壁两侧的压力，同时轻轻将动物固定在培养皿底部。用镊子剪除后部两个体节，并解剖去除内脏。一些脂肪体可能会通过切口从体腔中移出，也将这些组织一并剪除。继续用精细镊子轻轻将幼虫固定在培养皿底部。另一只手握住一根钝头0号昆虫针，将其抵住幼虫的口器部位，并将口器推入体腔，如同将袜子翻面时套在拳头上的动作。组织的内面朝外时应呈现如此形态。使用超精细解剖弹簧剪，将体壁上的脂肪体和气管剥离并清除。尽可能多地去除脂肪体。务必小心，避免牵拉气管或损伤神经系统。撕裂气管会同时在体壁肌肉上造成破孔。完成解剖后，肌肉应呈半透明且松弛状态，而非不透明或收缩状态。如果将肌肉置于室温下不含谷氨酸的 HL6 溶液中，它很可能会发生节律性收缩。由于中枢神经系统中的运动模式发生器具有活性，完整翻转的体壁倾向于沿背侧和腹侧中线对折，因此该制备标本可呈现左侧或右侧的半体动物形态以供观察。最后，使用桥式盖玻片装置将组织封片于显微镜载玻片上。组织封片的具体步骤将在后续展示。开始标记神经元棒状突起时，用移液器吸取30 µL荧光标记的一抗HRP抗体溶液（溶于HL6中），滴加一滴至培养皿上。接下来，将翻转的体壁制备物浸入染色液中。约五分钟后可观察到神经元末端的标记，但为了获得完整且明亮的标记，建议孵育10至20分钟。为洗去多余的 HRP 标记物，将组织置于 0.5 毫升 HL 六溶液中，在室温下孵育 10 至 30 秒。未结合的染料可迅速被洗脱，因此清洗步骤无需过长时间或剧烈操作。标记后的组织现已准备好进行封片，并通过显微镜观察。对刚刚展示的活体抗体标记方案的一种改进是使用荧光标记的葡聚糖来突出显示充满液体的细胞外空间。开始该实验时，将荧光标记的葡聚糖染料用 HL6 缓冲液稀释至 0.001 毫克/毫升。如果你不关注葡聚糖进入细胞外空间的确切时间，则可能需要调整葡聚糖的浓度。用移液器吸取20微升染料滴加到桥式盖玻片上，然后将组织样本转移至染料液滴中。如果无需灌流内翻的组织，或需保持HL六溶液的体积较小，则可将其安装在双桥式载玻片上。首先，用强力胶将两片18毫米的方形盖玻片粘在非常洁净的显微镜载玻片上。在盖玻片边缘之间留出两毫米的间隙，并将该间隙大致置于载玻片中央。让胶水完全干燥，否则会在组织样本周围的水相介质上形成一层膜。接下来，在盖玻片之间的缝隙中加入30微升HL六溶液。将内外翻转的组织置于HL六液滴中。如果幼虫较大且成像系统像素阵列有限，可能需要将组织以对角方向放置。取少量凡士林涂抹在第三片18毫米盖玻片的边缘，将涂有凡士林的一面朝下，轻轻压在已用胶固定的两片盖玻片上，覆盖于组织之上。以下是使用转盘共聚焦显微镜获得的两种急性荧光标记方法对翻转幼虫制备样本的成像结果。第一幅图是胶质细胞-神经-肌肉突触的光学切片层析图像，其中活体抗HRP标记了布顿（Buton）末梢。在肌细胞表面，我们可以看到被强烈标记的神经元钮状终末，以蓝色伪彩显示。在图像堆栈的中部，可见绿色标记的GFP阳性胶质细胞突起，以及蓝色HRP标记的钮状结构。围绕这些钮状结构，可以看到类似袋状的突触后网状结构（SSR）的横切面，即突触下网状结构，在堆栈中层和深层还可见DS红色标记的SSR，呈红色。SSR 是肌细胞中的特化突触区域。BNS 嵌入肌细胞的凹陷内，部分绿色胶质细胞突起也位于这些凹陷中。胶质细胞突起环绕在 BNS 和 SSR 周围，但在图像堆栈的最深层，并不会像毯子一样完全覆盖突触表面。我们观察到绿色的胶质细胞突起和红色的突触后致密区（SSR），但突触小结的数量较少。我们还可以找到支配肌肉的运动神经的横切面。胶质细胞包裹着运动神经，因此运动神经也呈绿色。急性荧光标记内外翻幼虫制备物的第二个结果是荧光葡聚糖标记的突触。在此，突触间隙或突触裂隙中的液体被标记为红色。在光学切片图像的表面层，可见一层红色葡聚糖染料的液体，可观察到其在肌细胞膜的波纹状凹陷处聚集。在图像堆栈的深层，荧光葡聚糖染料已渗入突触间隙，在神经元末端与蓝色标记的 SSR 小囊之间形成微小的环状染料池。这是被染料标记出的突触间隙。绿色的胶质细胞片层并未阻挡染料在图像堆栈深层渗入突触间隙。最显著的特征是肌肉中被标记为蓝色的SSR或突触区域，以及呈绿色的扁平胶质细胞突起。同样，在深层可见的神经轴突周围的胶质鞘也呈绿色。该胶质鞘似乎排除了葡聚糖染料的进入。我刚刚向您展示了一种在果蝇幼虫的外翻组织制备样本中可视化胶质神经肌肉突触的新方法。在制备组织时，务必注意轻柔操作，确保肌肉处于松弛状态，并避免损伤周围神经。最后，我想引用马克思的一句话作为结束。光阴似箭。恐惧则如香蕉般飞逝。

visualizing-live-drosophila-glial-neuromuscular-junction-with

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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Drosophila 幼虫神经肌肉接头免疫组织化学

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电生理记录在 果蝇 胚胎

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体内成像完整果蝇幼虫的亚细胞分辨率研究

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逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

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使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头与肌细胞中微管网络的可视化

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